Avaliação e quantificação de microlacunas epiteliais na mucosa colônica usando coloração por imunofluorescência

Summary

Aqui, descrevemos um novo método para visualizar a localização específica de onde a permeabilidade transcelular e paracelular é aumentada na mucosa colônica inflamada. Neste ensaio, aplicamos um corante fluorescente de 10 kDa conjugado a um dextrano fixável em lisina para visualizar regiões de alta permeabilidade (HPR) na mucosa colônica.

Abstract

As células epiteliais que revestem a mucosa intestinal criam uma barreira física que separa o conteúdo luminal do interstício. O comprometimento da barreira epitelial tem sido associado ao desenvolvimento de várias patologias, como doenças inflamatórias intestinais (DII). Na mucosa inflamada, erosões superficiais ou microerosões que corrompem as monocamadas epiteliais correspondem a locais de alta permeabilidade. Vários mecanismos têm sido implicados na formação de microerosões, incluindo derramamento celular e apoptose. Essas microerosões geralmente representam lacunas epiteliais microscópicas distribuídas aleatoriamente no cólon. A visualização e quantificação dessas lacunas epiteliais emergiu como uma ferramenta importante para investigar a função da barreira epitelial intestinal. Aqui, descrevemos um novo método para visualizar a localização específica de onde a permeabilidade transcelular e paracelular é aumentada na mucosa colônica inflamada. Neste ensaio, aplicamos um corante fluorescente de 10 kDa conjugado a um dextrano fixável em lisina para visualizar regiões de alta permeabilidade (HPR) na mucosa colônica. O uso adicional de marcadores de morte celular revelou que o HPR abrange focos apoptóticos onde ocorre extrusão/derramamento epitelial. O protocolo aqui descrito fornece uma abordagem simples, mas eficaz, para visualizar e quantificar microerosões no intestino, o que é uma ferramenta muito útil em modelos de doenças, nos quais a barreira epitelial intestinal está comprometida.

Introduction

A mucosa gastrointestinal (GI) cria uma barreira física que separa o ambiente extracelular e o meio interno do hospedeiro e está envolvida na absorção de nutrientes, água e eletrólitos. A barreira intestinal engloba uma camada de muco constituída de glicoproteínas, uma monocamada de células epiteliais e a lâmina própria subjacente são células imunes e estromais. As células epiteliais intestinais que formam a barreira física estão ligadas entre si por diferentes complexos proteicos, que incluem a junção aderente (AJ), a junção apertada (TJ) e os desmossomos (DMs). O comprometimento da função de barreira epitelial aumenta a permeabilida....

Protocol

Todos os procedimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (CICUAL) do CINVESTAV.

1. Preparação de materiais e reagentes

1. Pré-aqueça a solução de Hartmann (130 mM de NaCl, 28 mM de lactato, 4 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl₂) a 37 ° C enquanto borbulha com 95% de O₂/5% de CO₂. Manter o pH fisiológico (7,4) da solução.
2. Para analisar a permeabilidade paracelular passiva, prepare uma solução de trabalho dissolvendo 1 mg/mL de FITC-Dextrano (4 kDa) e 1 mg/mL de RITC-Dextrano (10 kDa) em solução de Hartm....

Results

Na mucosa inflamada, erosões superficiais ou microerosões comprometem a integridade da monocamada de células epiteliais e representam locais de alta permeabilidade ^7,8. Para avaliar tais possibilidades, analisamos a permeabilidade passiva na mucosa colônica inflamada em um modelo murino de colite com sulfato de sódio dextrano. Em resumo, por 5 dias, camundongos C57BL / 6J receberam 2,5% de DSS (p / v, 40-50 kDa) dissolvido em água potável. Este modelo é caracteri.......

Discussion

A homeostase epitelial resultante do equilíbrio da proliferação celular e da apoptose epitelial mantém uma barreira intestinal adequada e funcional. Muitos distúrbios clínicos, como a DII, são acompanhados ou caracterizados por alterações na permeabilidade intestinal, inflamação da mucosa e ruptura da homeostase epitelial¹. A interação entre esses processos ainda é altamente controversa. Portanto, o desenvolvimento de novas abordagens de pesquisa para investigar a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo ativo Caspase-3 (1:1000)	Sinalização celular	9664	Caspase-3 clivada (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti coelho (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rato (1:1000)	Invitrogen	A21209
Microscópio confocal (Leica TCS SP8x)	Detectores Leica		HyD  e Laser de Luz Branca
Anticorpo E-Caderina (1:750)	Sigma	MABT26	Rato monoclonal Delma-1 anticorpo
Etanol 70%	Genérico
Fixável-Dextrano	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, aniônico, fixável
FITC Dextran	Sigma	46944	Isotiocianato de fluoresceína– dextrano M. Wt. 4 kDa
Solução de Hartmann	PiSA	HT PiSA
Incubadora (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
Leitor de microplacas (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Placa de poliestireno preto e branco	ThermoFisher Scientific
Paraformaldeído	Sigma	P6148
Faloidina (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Faloidina
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rodamina B Isotiocianato-Dextrana. M. Wt. 10 kDa
Anticorpos secundários (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		Anticorpos secundários conjugados com HRP
Fios de sutura	Genérico		Seda trançada e poliéster trançado suturas cirúrgicas são preferidas.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1