Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e expandir robustamente os cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente.
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Artigo de método
Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente
Neste artigo
Resumo
Resumo
A geração de cardiomiócitos específicos do paciente a partir de uma única coleta de sangue tem atraído enorme interesse em medicina de precisão em doenças cardiovasculares. A diferenciação cardíaca das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) é modulada por vias de sinalização definidas que são essenciais para o desenvolvimento do coração embrionário. Inúmeros métodos de diferenciação cardíaca em plataformas 2D e 3D foram desenvolvidos com várias eficiências e rendimento de cardiomiócitos. Isso tem intrigado investigadores fora do campo, pois a variedade desses métodos pode ser difícil de seguir. Aqui apresentamos um protocolo abrangente que elabora geração robusta e expansão de cardiomiócitos específicos do paciente a partir de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs). Primeiro descrevemos um protocolo de reprogramação iPSC de alta eficiência a partir da amostra de sangue de um paciente usando vetores de vírus Sendai não integração. Em seguida, detalhamos um pequeno método de diferenciação de monocamadas mediada por moléculas que pode produzir robustamente cardiomiócitos de batida da maioria das linhas iPSC humanas. Além disso, um protocolo escalável de expansão do cardiomiócito é introduzido usando uma pequena molécula (CHIR99021) que poderia expandir rapidamente cardiomiócitos derivados do paciente para aplicações de grau industrial e clínico. No final, são retratados protocolos detalhados para identificação molecular e caracterização eletrofisiológica desses iPSC-CMs. Esperamos que este protocolo seja pragmático para iniciantes com conhecimento limitado sobre desenvolvimento cardiovascular e biologia de células-tronco.
Introdução
A descoberta de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem revolucionou a medicina cardiovascular moderna1,2. IPSCs humanos são capazes de se auto-renovar e gerar todos os tipos de células no coração, incluindo cardiomiócitos, células endividadas, células musculares lisas e fibroblastos cardíacos. Cardiomiócitos derivados do paciente iPSC (iPSC-CMs) podem servir como recursos indefinidos para modelagem de doenças cardiovasculares geneticamente hereditárias (DCV) e testes de segurança cardíaca para novos medicamentos3. Em particular, os pacientes iPSC-CMs estão bem preparados para....
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Protocolo
Os protocolos experimentais e o consentimento informado para os seres humanos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Hospital Nacional da Criança.
1. Preparação de meios de cultura celular, soluções e reagentes
- Prepare a mídia PBMC
- Misture 20 mL de mídia cultural basal PBMC (1x) e 0,52 mL de suplemento. Adicione 20 μL de SCF e FLT3 cada (concentração de estoque: 100 μg/mL), 4 μL de IL3, IL6 e EPO cada (concentração de estoque: 100 μg/mL) e 200 μL de alternativa L-glutamina (100x). Misture-os bem. Filtrar em uma coifa estéril usando uma unidade de filtro de 0,22 μm. Nomeie isso como Mídia de Sangue ....
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Resultados
Reprogramação do iPSC humano dos PBMCs
Após a pré-cultura com mídia sanguínea completa por 7 dias, os PBMCs tornam-se grandes com núcleos visíveis e citoplasma (Figura 1B),indicando que estão prontos para a transfecção do vírus. Após a transfecção com os fatores de reprogramação do vírus Sendai, os PBMCs passarão por um processo de reprogramação epigenética por mais uma semana. Normalmente, temos 30-50 colônias iPSC da transfecção de 1 x 1.......
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Discussão
Durante a reprogramação do IPSC, é fundamental cultivar PBMCs por 1 semana até que sejam ampliados com núcleos claros e citoplasma. Como os PBMCs não proliferam, um número celular apropriado para transdução viral é importante para a reprogramação bem sucedida do iPSC. O número celular de PBMCs, a multiplicidade de infecção (MOI) e o título do vírus devem ser considerados e ajustados para alcançar os resultados ideais de transdução. Para a diferenciação cardíaca, a densidade inicial de semeadura é fundamental para que os .......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Adicional Ventures AVIF e SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH/NHLBI) concede 1R01HL124245, 1R01HL132520 e R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao também foi apoiado por fundos de startup do Instituto de Pesquisa Abigail Wexner no Nationalwide Children's Hospital.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ABI 7300 Sistema de PCR em Tempo Real Rápido | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Amplificador de Microeletrodo | Dispositivos | Moleculares Amplificador de Microeletrodo | |
| B27 suplemento | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 menos insulina | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix / Cytoperm Kit de Fixação/Permeabilização | BD Biosciences | 554714 | Solução de Fixação/Permeabilização, Tampão Perm/Wash |
| BD Vacutainer Tubo CPT | BD Biosciences | 362753 | Tubo de separação de células sanguíneas |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Kit de reprogramação | de vírus Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Placa de aquisição | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | kit de extração de RNA |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 meio | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 mídia para cultura iPSC |
| Suplemento GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Alternativa de L-glutamina |
| Fator de crescimento reduzido Matrigel | Corning | 356231 | Matriz de membrana basal |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | síntese de cDNA |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Software de aquisição e análise de dados de eletrofisiologia | |
| EPO humano recombinante | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Humano recombinante FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Humano recombinante IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Humano recombinante IL6 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCF humano recombinante | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 médio | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 médio, sem glicose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mídia de montagem |
| StemPro-34 SFM | Thermo Meio de cultura Fisher Scientific | 10639011 | PBMC |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, sem vermelho de fenol | de | dissociação | Thermo Fisher Scientific |
| UltraPure 0,5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | solução de dissociação iPSC |
| Y-27632 2HCl | Produtos Químicos Selleck | S1049 |
Referências
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318
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Reimpressões e permissões
