Fluxo de trabalho e ferramentas para triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin

Resumo

A triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin é realizada usando um fluxo de trabalho com bibliotecas compostas dedicadas, ferramentas de manuseio de cristais, instalações rápidas de coleta de dados e análise de dados amplamente automatizada. O protocolo apresentado pretende maximizar a produção de tais experimentos para fornecer pontos de partida promissores para o design de ligante baseado em estrutura a jusante.

Resumo

A triagem de fragmentos é uma técnica que ajuda a identificar pontos de partida promissores para o design de ligantes. Dado que os cristais da proteína alvo estão disponíveis e exibem propriedades de difração de raios-X de alta resolução, a cristalografia está entre os métodos mais preferidos para a triagem de fragmentos devido à sua sensibilidade. Além disso, é o único método que fornece informações 3D detalhadas do modo de ligação do fragmento, que é vital para a evolução de compostos racionais subsequentes. O uso rotineiro do método depende da disponibilidade de bibliotecas de fragmentos adequadas, meios dedicados para lidar com um grande número de amostras, linhas de feixe síncrotron de última geração para medições de difração rápida e soluções em grande parte automatizadas para a análise dos resultados.

Aqui, são apresentadas as ferramentas práticas completas e as ferramentas incluídas sobre como realizar a triagem de fragmentos cristalográficos (CFS) no Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Precedendo esse fluxo de trabalho, as condições de imersão de cristais, bem como as estratégias de coleta de dados são otimizadas para experimentos cristalográficos reprodutíveis. Em seguida, tipicamente em um procedimento de um a dois dias, uma biblioteca focada em CFS de 96 membros fornecida como placas secas prontas para uso é empregada para absorver 192 cristais, que são então refrigerados individualmente. Os experimentos finais de difração podem ser realizados dentro de um dia nas linhas de luz suportadas por robôs BL14.1 e BL14.2 no anel de armazenamento de elétrons BESSY II operado pelo HZB em Berlim-Adlershof (Alemanha). O processamento dos dados cristalográficos, o refinamento das estruturas proteicas e a identificação de hits é rápido e em grande parte automatizado usando dutos de software especializados em servidores dedicados, exigindo pouca entrada do usuário.

O uso do fluxo de trabalho CFS no HZB permite experimentos de triagem de rotina. Aumenta as chances de identificação bem-sucedida de hits de fragmentos como pontos de partida para desenvolver aglutinantes mais potentes, úteis para aplicações farmacológicas ou bioquímicas.

Introdução

O primeiro passo no desenvolvimento de drogas é a triagem de compostos contra um alvo de interesse. Tradicionalmente, grandes bibliotecas compostas na ordem de 100.000-1.000.000 entradas são usadas em ensaios bioquímicos de alto rendimento na indústria farmacêutica. Essa estratégia foi complementada pelo projeto de medicamentos baseado em fragmentos (FBDD), um método mais novo que teve um aumento acentuado nos últimos 20 anos e tornou-se uma estratégia dominante para gerar candidatos de alta qualidade devido a várias vantagens inerentes ao método¹. O termo "fragmento" refere-se a uma pequena molécula orgânica contendo tipicamente menos de 20 átomos não-hidrogênio ou pesados (HAs). Assim, um fragmento é significativamente menor do que as moléculas semelhantes a drogas ou chumbo (geralmente menos de 30 HAs) exploradas na triagem convencional de alta produtividade. Fragmentos são aglutinantes de afinidade fraca. No entanto, em comparação com moléculas maiores, os fragmentos são mais versáteis, uma vez que mesmo uma pequena coleção deles pode representar melhor o respectivo espaço químico de moléculas do mesmo tamanho². Além disso, a evolução da triagem de fragmentos atinge moléculas de chumbo é consideravelmente mais eficaz do que otimizar moléculas já maiores^2,3,4,5. Isso significa que, enquanto aguarda sensibilidade suficiente da detecção, a triagem de fragmentos pode ser empregada de forma eficiente e produz pontos de partida de alta qualidade para uma evolução composta adicional. Vários métodos biofísicos podem ser aplicados para triagem de fragmentos, sendo o mais popular ressonância magnética nuclear, cristalografia de raios-X, ressonância de plasmon superficial e ensaios de mudança térmica. Esses métodos são utilizados de forma paralela ou sequencial, com o objetivo de aumentar a confiança nos acertos e reduzir o número de falsos positivos ou falsos negativos, respectivamente. No entanto, um estudo comparativo recentemente realizado⁶ sugeriu que cascatas de triagem sequencial devem ser evitadas devido à baixa sobreposição entre os diferentes métodos.

A cristalografia de raios-X é um método bem estabelecido para a determinação da estrutura em detalhes atômicos, mas recentemente também foi desenvolvida como uma ferramenta para fins de triagem^7,8. Como os cristais proteicos toleram altas concentrações de fragmentos (por exemplo, 100 mM), a triagem de fragmentos cristalográficos (CFS) pode competir com outros métodos biofísicos para triagem de fragmentos ou até mesmo superá-los como um método de triagem em primeiro passo^6,9. No entanto, um pré-requisito vital para o CFS é um sistema de cristalização validado da proteína alvo que reproduz cristais com propriedades de difração para uma resolução consideravelmente alta, tipicamente melhor que 2 Å.

Um benefício exclusivo do CFS em comparação com todas as outras metodologias de triagem de fragmentos é o fornecimento de informações detalhadas em 3D sobre o modo de vinculação dos fragmentos identificados. Essas informações estruturais são absolutamente cruciais para a otimização racional dos golpes do fragmento para aglutinantes de maior afinidade. Estratégias de elaboração estabelecidas estão crescendo, fundindo e ligando fragmentos atinge⁵. Assim, a eficiência relativamente alta do ligante é fornecida desde o início, e a introdução de grupos desnecessários ou espacialmente não adequados pode ser evitada, reduzindo assim os custos de síntese química. Em suma, o CFS tem vantagens incomparadas como estratégia inicial para o design de drogas.

Dado que um determinado alvo biológico atende aos altos requisitos do CFS em relação à qualidade do cristal, existem alguns fatores principais que maximizam as chances de um resultado bem-sucedido de tais campanhas de triagem. Depende da qualidade da biblioteca de fragmentos utilizada, de um fluxo de trabalho eficiente para realizar os experimentos antes do experimento de difração, em linhas de feixe síncrotron com automação e velocidade suficiente de coleta de dados, bem como de formas e meios para processamento e análise de dados amplamente automatizados. Aqui, é apresentado o fluxo de trabalho completo dos experimentos de imersão de cristal até a identificação do hit, da forma como é estabelecido com sucesso nas linhas de cristalografia macromolecular no BESSY II (Figura 1). A instalação está aberta a usuários acadêmicos e industriais para colaboração. Além disso, os usuários acadêmicos de países da UE fora da Alemanha podem solicitar diretamente financiamento através do projeto iNEXT Discovery.

Existem pré-requisitos indispensáveis para poder iniciar uma campanha de CFS e conduzir o protocolo descrito neste trabalho: cristais bem difundidos da proteína alvo estão disponíveis que podem ser reproduzidos em grande número, que são estáveis à temperatura ambiente, e que foram cultivados usando um coquetel de cristalização sem ingredientes altamente voláteis. Outro pré-requisito é a adequação da rede de cristal para o experimento. Em uma rede adequada, os locais interessantes da proteína alvo devem ser expostos aos canais de solventes e, portanto, acessíveis. Outra etapa anterior que é opcional, mas ainda assim altamente recomendada para garantir o sucesso no fluxo de trabalho da campanha CFS é a otimização da condição de imersão para o experimento. As estatísticas de benchmark vitais aqui são o poder de difração do cristal e os indicadores relevantes de qualidade dos dados, que são determinados durante o procedimento de dimensionamento de dados. Fatores típicos para otimizar são tolerância ao DMSO, concentração de buffer e crio-protetor. Embora não seja um pré-requisito rigoroso como mais detalhado abaixo, o DMSO como co-solvente pode ajudar a aumentar a solubilização de fragmentos. Os testes típicos devem incluir imersão de 0, 3, 6 ou 10% (v/v) DMSO durante a noite. Um aumento da concentração de buffer para 200 ou 300 mM ajuda a evitar a perda na qualidade da difração devido a efeitos ocasionais de mudança de pH decorrentes das altas concentrações de fragmento a serem utilizadas. Por fim, é decisivo descobrir se e qual crioprotetor adicional é necessário e se ele já pode ser incluído na condição de imersão. Em muitos casos, no entanto, não é necessário um crio-protetor adicional, porque o próprio DMSO pode agir como um crio-protetor. Se assim for, isso salvará um passo de manuseio no experimento final. A maioria dos cristais precisa de menos crio-protetor se resfriada em laços de tamanho apropriado, minimizando ou evitando o licor materno ao redor tanto quanto possível. No entanto, em casos raros, uma camada do licor materno é de fato necessária para evitar danos ao cristal no resfriamento de flash.

O número de acessos obtidos em uma campanha de CFS não depende apenas da drogabilidade da proteína alvo e da adequação da rede cristalina (ver acima), mas também depende da qualidade da biblioteca. A qualidade da biblioteca compreende dois aspectos: a seleção dos compostos para a biblioteca e a confecção dos compostos, (ou seja, em que forma física são apresentados para o experimento). Para a seleção composta podem ser empregadas diferentes estratégias. A maioria dos projetos de bibliotecas incluem a maximização da diversidade química dos fragmentos. Um foco estratégico poderia ser incluir a trato química dos fragmentos para o projeto de seguimento, que foi aplicado, por exemplo, na biblioteca equilibrada Diamond-SGC-iNEXT¹⁰. Outro foco estratégico para o design da biblioteca poderia ser maximizar a representação do espaço químico comercialmente disponível de fragmentos por clustering baseado em forma e farmacocópico, como foi exemplificado pelas bibliotecas F2X desenvolvidas na HZB¹¹. Mais especificamente, a Biblioteca F2X-Universal de 1103 membros e o subconjunto representativo de 96 compostos para campanhas iniciais de CFS, que é chamado de Tela de Entrada F2X, foram desenvolvidos e a Tela de Entrada F2X foi validada com sucesso¹¹. A Tela de Entrada F2X é a principal escolha para campanhas de CFS no HZB. Posteriormente, campanhas maiores podem ser realizadas usando a Biblioteca F2X-Universal ou a biblioteca de fragmentos UE-OPENSCREEN^12, com 1056 membros, que também está sendo oferecida na HZB. Atualmente, essas bibliotecas estão disponíveis para os usuários das linhas de cristalografia macromolecular do síncrotron BESSY II em Berlim gratuitamente com base em um contrato de colaboração. Isso também se aplica aos usuários através de propostas do iNEXT Discovery. Além disso, a Tela de Entrada F2X está disponível para todos os cientistas interessados com base em um acordo de transferência de material.

Com relação à apresentação física de uma biblioteca, duas abordagens são comumente adotadas: os fragmentos são usados como soluções de estoque DMSO ou os fragmentos são secos e imobilizados em placas prontas para uso. Na HZB, tanto a tela de entrada F2X quanto os compostos não voláteis da Biblioteca F2X-Universal são apresentados como compostos secos em uma placa de cristalização de 3 lentes de 96 poços mrc de baixo perfil. A apresentação dos fragmentos imobilizados em placas de cristalização tem duas vantagens vitais: em primeiro lugar, permite o transporte das placas de triagem para o laboratório doméstico do usuário. Portanto, as etapas de imersão e manuseio de cristais do fluxo de trabalho aqui apresentadas (etapas 1-3) podem ser realizadas em qualquer lugar. Em segundo lugar, a solução livre de DMSO pode ser empregada. Assim, os alvos sensíveis ao DMSO podem ser examinados facilmente, mantendo em grande parte as taxas de acerto esperadas¹¹. No entanto, o DMSO aumenta a solubilidade do fragmento, portanto, vale a pena verificar a tolerância do DMSO de um sistema de cristal de escolha antecipadamente, conforme descrito acima.

O protocolo descrito abaixo descreverá um experimento típico com uma tela de 96 compostos, como a tela de entrada F2X. Para isso, aproximadamente 250 cristais precisam estar preparados a tempo de serem usados recentemente. É altamente aconselhável preparar os molhos para todos os 96 compostos em duplicata. Recomenda-se, mas opcional, preparar simulados adicionais que mais tarde ajudarão na análise de dados usando a abordagem de análise de densidade de dados pan-(PanDDA) para identificação de hit¹³. Os mock-soaks são definidos como experimentos de imersão em cristais de proteína usando a mesma solução de imersão que o fragmento absorve para o mesmo tempo de incubação, mas não há fragmentos presentes. Se a solução de imersão for igual à condição de cristalização, os cristais podem ser colhidos diretamente da placa de cristalização.

Dependendo das capacidades do trocador de amostras robótico, diferentes formatos de disco podem ter que ser usados. No momento, as amostras para a linha de feixe BL14.1 operada pela HZB precisam ser preparadas no formato Unipuck, as amostras para a linha de feixe BL14.2 operada por HZB precisam ser preparadas no formato de disco SPINE. Neste protocolo, a preparação no formato Unipuck é assumida.

Protocolo

1.Cristais de imersão

1. Pegue a placa de triagem (aqui, uma placa de tela de entrada F2X, Figura 2) do congelador -20 °C e coloque-a no banco/mesa por cerca de 30 minutos para pré-aquecer à temperatura ambiente, evitando assim a umidade de condensação.
2. Organize o local de trabalho com dois microscópios bem organizados e todas as ferramentas necessárias(Figura 3A). Os materiais estão listados na Tabela de Materiais.
3. Escolha 3-4 loops do tamanho apropriado para a transferência dos cristais a serem encharcados e coloque-os perto dos microscópios.
4. Encha as cavidades da placa de vidro com água desionizada ou destilada.
5. Prepare 5 mL de solução de imersão.
6. Abra o saco da placa de triagem pré-aquecida à temperatura ambiente.
7. Retire a tampa e a folha da placa de triagem, mantendo a placa colocada no banco/mesa.
8. Decante os 5 mL de solução de imersão no reservatório de reagente.
9. Encha cada um dos 96 reservatórios com 40 μL de solução de imersão usando a pipeta de 12 canais.
10. Coloque o quadro EasyAccess em cima da placa de triagem e fixe-o com os grampos incluídos deslizando-os para o lado esquerdo e direito do dispositivo.
    NOTA: O EasyAccess Frame é um dispositivo especial para o manuseio de vários cristais, que foi desenvolvido no HZB¹⁴. Permite fácil acesso a cada poço, deslocando as telhas móveis enquanto protege os outros poços da evaporação.
11. Coloque a placa de triagem (incl. o Quadro EasyAccess) sob o primeiro microscópio e a placa de cristalização, incluindo os cristais a serem embebidos sob o segundo microscópio.
12. Deslize bem A1 da placa de triagem movendo o respectivo azulejo de vidro acrílico do Quadro EasyAccess com um dedo ou a ferramenta de caneta fornecida.
13. Adicione 0,4 μL de solução de imersão do reservatório ao fragmento contendo bem (lente superior esquerda) usando uma ponta de pipeta fresca. Verifique através do microscópio que a gota cobre o fragmento seco, para que possa dissolver.
    NOTA: Alternativamente, esta etapa pode ser realizada usando um robô pipetting antes da montagem do Quadro EasyAccess. Desta forma, as gotas de imersão de todos os poços poderiam ser colocadas em um procedimento automático. No entanto, os autores recomendam adicionar a solução de imersão diretamente antes da etapa de imersão, como descrito para garantir que o fragmento solubilize lentamente e na presença do cristal. Isso evita que o cristal experimente um choque repentino ao ser transferido para uma queda com uma alta concentração de fragmentos.
14. Sob o segundo microscópio, abra a folha de vedação da placa de cristalização em um dos poços que contém os cristais alvo.
15. Transfira dois cristais usando um laço de tamanho apropriado montado na varinha de cristal para o poço A1 da placa de triagem sob o primeiro microscópio.
16. Lave o laço na placa de vidro preparada e seque-a suavemente tocando o tecido. Faça isso após cada transferência para evitar contaminação cruzada com fragmento contendo soluções de imersão.
17. Use o microscópio para verificar se os cristais foram colocados corretamente.
18. Passe para o próximo poço (por exemplo, B1).
19. Repita as etapas 1.13-1.18 com todos os 96 poços da placa de triagem até que cada gota de imersão contenha dois cristais.
20. Remova a placa de triagem (incl. o Quadro EasyAccess) sob o microscópio e coloque-a no banco/mesa.
21. Remova o quadro EasyAccess da placa de triagem.
22. Sele a placa de triagem com papel alumínio de vedação e coloque-a na incubadora ou armário de cristalização, respectivamente, onde os cristais foram cultivados.
23. Incubar para o tempo de imersão otimizado. Durante a noite é geralmente conveniente.
24. (opcional) Preparação de aproximadamente 40 cristais de apo (ou seja, imersão simulada)
    1. Pegue uma placa de cristalização mrc de 3 lentes de 96-bem-perfil baixo e encha duas colunas com 40 μL de solução de imersão por poço usando a pipeta de 12 canais.
    2. Coloque o quadro EasyAccess em cima da placa de cristalização e fixe-o com os grampos incluídos deslizando-os para o lado esquerdo e direito do dispositivo.
    3. Deslize o azulejo de vidro acrílico do poço A1.
    4. Coloque 0,4 μL de solução de imersão em cada uma das duas lentes esquerdas do poço.
    5. Transfira 2-3 cristais para cada gota. Após cada transferência, lave a alça na placa de vidro preparada e seque suavemente o tecido.
    6. Mova-se para o próximo poço (por exemplo, B1).
    7. Repetição de passos 1.24.4-1.24.6 até que cerca de 40 cristais estejam prontos para incubação.
    8. Remova a placa de cristalização (incl. EasyAccess Frame) sob o microscópio para o banco/mesa e remova o Quadro EasyAccess.
    9. Sele a placa de cristalização com papel alumínio de vedação e coloque-a na incubadora ou armário de cristalização acima mencionada.
    10. Incubar ao mesmo tempo que a placa de triagem.

2.Colhendo cristais

1. Retire a placa incubadora da incubadora ou do armário, respectivamente.
2. Organize o local de trabalho com um microscópio e todas as ferramentas necessárias(Figura 3B). Os materiais estão listados na Tabela de Materiais.
3. Prepare uma dewar de espuma Unipuck com 3 tampas Unipuck (ou seja, gabinetes de amostra) e encha-a com nitrogênio líquido (LN₂).
   NOTA: Observe as precauções de segurança adequadas para trabalhar com LN₂ (ou seja, use óculos de segurança e use equipamentos de proteção adequados). É melhor obter LN fresco_{2 várias vezes} durante a sessão, a fim de evitar a condensação de água na lata de armazenamento LN_2. Através de todo o procedimento a seguir, certifique-se de que o nível LN₂ na dewar de espuma esteja sempre atingindo a borda superior da dewar. Certifique-se também de que a LN₂ é livre de gelo; substitua frequentemente a LN₂ (por exemplo, uma vez a cada 45 min), ou mais recente se o gelo começar a se acumular. Então, encha a segunda espuma de guerra e transfira Unipucks para ela. Esvazie a espuma gelada de guerra e remova gelo residual e umidade com o secador.
4. Remova a folha da placa de triagem e coloque o quadro EasyAccess em cima.
5. Deslize bem A1.
6. Retire dois cristais da gota e esfrie-os na LN₂ (um por um) mergulhando com um movimento vertical rápido na LN_{2 e,} em seguida, inserindo a amostra na posição adequada do disco. Faça anotações relevantes na folha de rastreamento da amostra.
7. Etapa de crioproteção (se necessário para os cristais alvo). Nesse caso, realize esta etapa em vez de 2.6.
   1. Coloque 0,4 μL de solução de imersão, incluindo crio-protetor na lente inferior esquerda do poço.
   2. Puxe o laço com um cristal montado a partir da queda na lente superior esquerda lentamente através da solução na lente inferior esquerda, mantendo o cristal no loop, e depois flash-cool em LN₂. Colher dois cristais desta maneira.
      NOTA: Nas etapas 2.6 e 2.7, certifique-se de que o tempo que o cristal está no laço e exposto ao ar seja mantido muito curto. O mergulho (ou seja, a queda vertical da amostra na dewar preenchida na LN₂₎deve ser realizado o mais rápido possível. Isso garante alta qualidade amostral e prevenção de anéis de gelo nos dados. Rastreie as amostras (ou seja, observe se os cristais tiverem danos, etc.) para priorizar as seguintes medidas de raio-X para as seguintes medições de raios-X, use o modelo para isso. Mesmo que os cristais tenham rachaduras, "cabelos" ou outros defeitos devido à imersão, eles ainda podem ser usados e devem ser sempre colhidos. Caso os cristais se quebrem em vários pedaços, duas das peças mais bonitas/mais bonitas devem ser colhidas. A Figura 5 mostra alguns exemplos de como tais cristais podem se parecer. Todos os cristais mostrados deram conjuntos de dados ainda úteis na respectiva campanha^11,sublinhando que vale a pena colher cristais após o tratamento de imersão, mesmo que tenham ocorrido alterações morfológicas substanciais.
8. Vá para o próximo poço e repita os passos 2.5 - 2.6./2.7 até que todos os três discos sejam preenchidos.
9. Adicione as bases Unipuck em cima das tampas após pré-esfriá-las na LN₂.
10. Armazene os Unipucks em racks de armazenamento em uma dewar de transporte ou de guerra de armazenamento.
11. Repita as etapas anteriores até que todos os poços da placa de triagem tenham sido processados.
12. (opcional) Se cristais embebidos foram preparados, colhi-los de forma semelhante como descrito anteriormente.
    NOTA: Se dois cristais para cada uma das 96 condições da placa de triagem serão refrigerados em flash, haverá espaço para 32 cristais de apo embebidos, para encher os 14 Unipucks.
13. Armazene os Unipucks em LN₂ até a medição.

3.Coleta de dados

1. Transfira os Unipucks para a linha de transporte BL14.1. Se os discos SPINE tiverem sido usados na etapa 2, transfira-os para a linha de transporte BL14.2.
2. Realizar medições padrão na linha de trave utilizando as recomendações específicas abaixo. Detalhes sobre a instalação e o programa de controle de experimentos MXCuBE2 foram apresentados anteriormente^15,16. A Figura 4 mostra o interior das cabanas experimentais das linhas de trave BL14.1 e BL14.2, bem como uma captura de tela de exemplo do software de controle MXCuBE2 na linha de trave BL14.1.
   1. Para maximizar a eficiência do tempo e o throughput, pule a coleção de imagens de teste. A distância amostra-detector será fixada a um valor adequado para o limite de resolução superior do sistema de cristal determinado em experimentos anteriores. Se a estratégia de coleta de dados não foi otimizada de antemão, colete 1800 imagens de 0,2 graus cada uma com um tempo de exposição de 0,1 s por imagem.
   2. Idealmente, teste a estratégia de coleta de dados em experimentos anteriores usando cristais apo embebidos por simulados. Para grupos espaciais de maior simetria, 1200 imagens ou mesmo 900 imagens (ou seja, 240° ou 180°, respectivamente) já darão conjuntos de dados completos com boas estatísticas, independente do ângulo inicial da coleta de dados.
      NOTA: Maior redundância e corte mais fino podem produzir qualidade de dados superior¹⁷. No entanto, usar essa estratégia "suficiente, mas não mais" proposta aqui, é uma excelente troca entre qualidade, tempo de coleta de dados, bem como requisitos computacionais para análise posteriormente. Da forma descrita, 200 coletas de dados em 24 horas são bem possíveis nas linhas de trave BL14.1 e BL14.2. No entanto, as amostras devem ser priorizadas.
   3. Primeiro coletar conjuntos de dados de difração para uma amostra por condição de fragmento, com base na priorização na etapa 2.6./2.7 (ou seja, coletar os dados para a duplicata mais priorizada).
   4. Para esses experimentos em 3.2.3, onde a coleta de dados falhou, ocorreu a difração ou anéis de gelo severos, coletando dados para a segunda amostra duplicada da respectiva condição de fragmento.
   5. Coletar conjuntos de dados de difração de cristais apo (se preparados de acordo com as etapas 1.24 e 2.12).
   6. Coletar conjuntos de dados de difração das duplicatas restantes de cada condição de fragmento.
   7. No programa MXCuBE2, combine os identificadores de conjunto de dados de uma campanha de CFS com o seguinte padrão: --[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (por exemplo, MyProtein-F2XEntry-B05a, onde "B05" significa o poço (ou seja, a condição do fragmento na tela) e o seguinte "a" para a primeira duplicata.)

4.Tratamento de dados

1. Para análise de dados da campanha CFS, use o FragMAXapp, uma solução baseada na Web para controlar uma análise multiplex para processamento de refinamento automático e avaliação de acertos do PanDDA dos dados CFS¹⁸ (Lima et al. FragMAXapp, dados inéditos). Na versão FragMAXapp implantada na HZB estão disponíveis os seguintes programas/pipelines: XDSAPP¹⁹, Xia2-DIALS e Xia2-XDS²⁰, fspipeline⁷, DIMPLE²¹, Phenix LigFit²², PanDDA^13,23. Use um modelo de entrada bem refinado da proteína alvo como insumo para refinamento automático; caso contrário, realizar refinamento meticuloso de um cristal de alta resolução embebido simulado que foi coletado durante a campanha.
   NOTA: Um elemento-chave para identificação de acerto é o PanDDA. Os detalhes são explicados nas respectivas publicações^13,23. Em resumo, o PanDDA calcula automaticamente mapas de densidade eletrônica de um conjunto de conjuntos de dados em uma campanha de CFS. Estes são então assumidos como condições de fragmento não vinculante e mediados para gerar o chamado modelo de estado terrestre. O modelo de estado terrestre é então usado para derivar discrepâncias locais entre cada mapa de densidade de elétrons e o mapa do estado terrestre, usando escores Z associados ao voxel. Em seguida, para áreas de pontuação Z alta, o chamado mapa PanDDA é criado por subtração afinada da densidade do estado terrestre a partir do respectivo mapa. Isso aumenta em grande parte a visibilidade dos eventos de ligação de fragmentos.
2. Para maximizar o resultado do PanDDA, use uma abordagem de duas etapas. Em primeiro lugar, realizar uma corrida PanDDA (pandda.analyze) com configurações padrão. Mesmo que cristais embebidos por simulação tenham sido coletados, sua identidade não será incluída como parâmetro (o que é possível, no entanto) a fim de permitir uma geração imparcial do modelo de estado terrestre pelo PanDDA a partir de todos os dados disponíveis. Posteriormente, os dados de saída são avaliados pelo usuário através da chamada inspeção PanDDA em Coot²⁴. Aqui, devem ser observados golpes com confiança relativamente alta, concluindo o primeiro passo.
3. Em segundo lugar, re-executar a etapa pandda.analyze excluindo os hits preliminares (determinados na primeira etapa) do modelo de estado terrestre através da opção de linha de comando --exclude_from_characterisation="". Mais detalhes são descritos nas páginas de ajuda do PanDDA (https://pandda.bitbucket.io/). Dessa forma, conjuntos de dados que são hits claros e, portanto, obscureceriam o modelo de estado terrestre se incluídos forem desconsiderados. Isso leva a um modelo de estado terrestre melhorado e, assim, a melhores resultados em geral. Finalmente, uma inspeção pandda completa é realizada para completar a identificação do hit.
   NOTA: O FragMAXapp também inclui uma opção de saída para salvar os estados vinculados modelados ou preparar dados para envio de PDB, para obter mais detalhes, consulte as páginas da Web fragMAX (https://fragmax.github.io/).

Resultados

Como parte das campanhas de validação relatadas anteriormente da Tela de Entrada F2X^11,três campanhas foram realizadas na linha de feixe BioMAX no MAX IV e uma campanha foi realizada na linha de trave BL14.1 na HZB. Nesta última campanha, um conjunto particular de condições de tela de entrada F2X usando uma condição de imersão que não continha DMSO foi rastreado contra o complexo proteína-proteína do Aar2 de levedura e o domínio rnaseh-like de levedura Prp8 (AR). O conjunto selecionado de condições compreende os hits encontrados em uma campanha anterior da Tela de Entrada F2X contra AR em uma condição de imersão contendo DMSO¹¹, (ou seja, na campanha realizada no HZB esses hits foram re-selecionados na ausência de DMSO). A Figura 7 mostra uma visão geral dos hits obtidos após analisar os dados com a combinação FragMAXapp de XDSAPP para processamento, fspipeline para refinamento automático e posterior localização de acerto usando PanDDA.

Figura 1: Representação esquemática do fluxo de trabalho de um experimento de triagem de fragmentos cristalográfico (CFS) com foco no ambiente especial no Helmholtz-Zentrum Berlin. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Formulação e embalagem da tela de entrada F2X. A tela de 96 compostos está disponível em uma placa de 3 lentes de 96 poços MRC de perfil baixo, selada com papel alumínio e embalada a vácuo. Os 96 compostos da tela são secos das soluções DMSO em duas das três lentes de cada poço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Fotografia da bancada cfs no laboratório de preparação HZB. Conjuntos de ferramentas necessárias para a) imersão e para b) colheita de cristal são exibidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Estações finais de coleta de dados e software de controle. A) Fotografia da cabana experimental das linhas de vigas HZB-MX BL14.1 (esquerda) e BL14.2 (direita)¹⁵. B) Captura de tela da interface de controle de experimento MXCuBE2¹⁶ usada em BL14.1 para coleta de dados de difração. No BL14.2 é usada uma interface muito semelhante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.  

Figura 5: Instantâneos fotográficos de algumas amostras cristalinas em ambiente criogênico antes da coleta de dados. Isso ilustra a variabilidade das morfologias dos cristais após a realização do fragmento de imersão e colheita de cristais. As fotografias foram tiradas na linha de feixe BioMAX (MAX IV síncrotron, Lund, Suécia) para amostras ar coletadas lá como parte da validação da tela de entrada F2X¹¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Captura de tela do FragMaxApp¹⁸ instalado no HZB para análise de dados conveniente. Mais detalhes em Lima et al., FragMAXapp, dados inéditos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Visão geral dos resultados da campanha CFS F2X-Entry vs. AR (sem DMSO). O complexo de proteínas AR é mostrado na vista de desenhos animados, com Aar2 colorido em cinza e o domínio rnaseh-like de Prp8 colorido em azul. Os fragmentos da campanha são coloridos em cores de elementos (C - amarelo, O - vermelho, N - azul, S - laranja, cl - ciano claro). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussão

Para uma campanha de sucesso do CFS, é vital aderir aos pré-requisitos descritos (ver Introdução). Um sistema de cristalização confiável é necessário para o crescimento reprodutível de muitos cristais bem difundidos, e uma estrutura bem refinada é necessária como o modelo de apo de entrada para refinamento automatizado. Também é importante verificar se o local alvo na proteína (local ativo ou área de interface) é acessível para fragmentos na rede de cristal. É crucial otimizar as condições de imersão de antemão para garantir que a imersão não deteriore significativamente a qualidade do cristal. Negligenciar esses aspectos provavelmente levará a um experimento subótimo, que será de uso limitado e, na pior das hipóteses, exigirá uma repetição de todo o experimento.

O protocolo descrito acima descreve os procedimentos que são seguidos durante uma campanha padrão de CFS. Se todos os pré-requisitos forem atendidos, pelo menos 90% de todos os cristais encharcados devem exibir difração à alta resolução em um experimento de difração. Se este não for o caso, os tempos de imersão podem ser reduzidos para algumas horas ou até minutos. Devido à boa solubilidade da maioria dos fragmentos, isso deve ser suficiente para obter valores decentes de ocupação. Além disso, uma campanha típica de CFS resultará em uma taxa de acerto de cerca de 10% ou mais. Para as campanhas de validação da Tela de Entrada F2X¹¹ e campanhas de usuários contínuas com a mesma biblioteca foram observadas taxas de sucesso ainda mais altas (20% ou mais, dados não mostrados).

Uma ressalva geral da triagem de fragmentos cristalográficos é a presença de locais de contato cristalográficos. Estes podem ocluir a priori locais ativos conhecidos (a serem verificados antes da triagem, veja acima), ou esses sites de contato também geralmente fornecem bolsões e pontos quentes onde fragmentos podem se ligar. Tais golpes de fragmento serão artefatos da rede de cristalização e provavelmente não se ligarão à proteína em solução. Esses eventos tendem a ocorrer mais frequentemente em experimentos de imersão do que em experimentos de co-cristalização (provavelmente devido às concentrações de fragmentos mais elevadas empregadas em experimentos de imersão). No entanto, de acordo com a experiência anterior, eles geralmente constituem apenas uma pequena parcela dos acertos obtidos. Por exemplo, na campanha de validação da Tela de Entrada F2X usando endothiapepsin (EP) e no complexo proteico-proteína spliceosomal da Prp^8RNaseH e Aar2 (AR), a maioria dos hits ocorreu em locais promissores¹¹. Para o PE, 27 dos 37 eventos de ligação observados estavam localizados no local ativo (ou seja, a fissura do peptídeo desta protease). Os 10 eventos de ligação remota compreendem dois eventos de ligação expostos solventes e oito eventos de ligação de contato de cristal (correspondendo a cinco acertos únicos). A exclusão desses hits de contato de cristal ainda refletiria uma taxa global de 24% de acessos únicos para a campanha do EP. Também é importante notar que eventos de ligação remotos de um local ativo conhecido (exceto pastadores de contato de cristal) também podem ser potencialmente interessantes (por exemplo, revelando novos pontos quentes ou locais alusicos da proteína). Para a campanha AR (na mesma publicação), dos 23 eventos de ligação observados, sete foram localizados em contatos de cristal, um foi localizado na interface direta das duas proteínas, sete foram localizados em locais conhecidos de interações proteína-proteína com outros parceiros vinculantes do contexto biológico maior (daí diferentes estágios de montagem do emenda, oito eventos vinculantes revelaram dois pontos quentes no AR de função ainda desconhecida e um sendo em uma superfície exposta solvente de Prp8^Rns. Portanto, excluindo os eventos em contatos de cristal e o singleton Prp8^RnaseH, o número de eventos de ligação potencialmente úteis é de 15 (correspondendo a 14 hits únicos) uma taxa de acerto de 15,6%. Esses hits podem ser pontos de partida para o design de moduladores de interação proteína-proteína ou para compostos de ferramentas destinados a explorar os dois pontos quentes Aar2 descobertos. Juntos, também em consonância com campanhas de usuários conduzidas, muitas vezes apenas uma pequena parte dos acessos na triagem de fragmentos cristalográficos deve ser desconsiderada como artefatos. No entanto, isso também será em grande parte dependente de alvos.

Se a taxa de acerto for significativamente menor, isso pode indicar um dos seguintes problemas relacionados à proteína alvo. Por exemplo, em uma campanha de CFS contra uma cisteína viral, observou-se uma taxa de acerto de apenas 3% (dados não mostrados). Descobriu-se que a proteína usada foi provavelmente quimicamente modificada em seu local ativo. Nesse caso, uma preparação de proteínas diferente pode resolver o problema. Se os cristais são muito intolerantes ao DMSO, a tela de entrada F2X também pode ser usada sem DMSO, embora os resultados possam diferir até certo ponto. A maioria dos hits obtidos na presença do DMSO também aparecerá em sua ausência. Haverá também alguns hits que não podem ser observados na ausência de DMSO, mesmo que possam ser observados em sua presença. E, finalmente, haverá alguns que só aparecem na ausência de DMSO.

A dificuldade mais grave ocorre se a proteína sofrer um movimento induzido sobre a ligação da substância. Provavelmente, a rede de cristal não tolerará o movimento da proteína e os cristais se desintegrarão. Nesse caso, a única escolha é recorrer à co-cristalização da proteína e dos fragmentos. Isso pode, no entanto, levar a novas formas de cristal. Portanto, grande parte da automação de todo o processo não funcionará mais de forma eficiente. Felizmente, na maioria das campanhas de CFS realizadas no HZB até agora, esse tipo de problema não foi encontrado. Pode ser que a ligação fraca de um fragmento não forneça energia suficiente para induzir um movimento proteico, em particular se a conformação cristalizada for estabilizada por forças de embalagem de cristal.

Outra limitação grave do método que os autores encontraram até agora é quando o coquetel de cristalização (e, portanto, a solução de imersão) contém compostos voláteis. Então torna-se quase impossível realizar todo o manuseio de cristal de forma significativa.

Diferentes proteínas podem conter locais drogado em maior ou menor grau. Por exemplo, as interações proteína-proteína são geralmente mediadas por superfícies planas estendidas que são mais difíceis de atingir. A taxa de impacto de ligação do fragmento dependerá, portanto, provavelmente da estrutura da superfície molecular da proteína. Em um caso extremo, uma proteína pode não conter pontos quentes de superfície adequados que sirvam como locais de destino para a ligação de fragmentos. Assim, apesar de um experimento meticulosamente realizado, nenhum fragmento de acerto resultará da triagem. No entanto, até agora, os autores não encontraram tal situação.

Em princípio, utilizando o protocolo descrito acima, a parte de imersão e colheita de cristais de uma campanha de CFS pode ser realizada em qualquer laboratório equipado para manuseio de cristais. Isso distingue a metodologia da HZB de outras instalações da CFS e pode ser uma vantagem em alguns casos. Por exemplo, se os cristais não puderem ser facilmente reutilizados em outro local ou se a viagem dos experimentadores for limitada (por exemplo, em uma situação pandêmica mundial), os usuários da HZB são, portanto, fornecidos com todo o equipamento (discos, ferramentas, Quadro EasyAccess, porta-amostras, etc.) como um conjunto portátil.

No entanto, os requisitos para um grande número de detentores de amostras e capacidades de armazenamento criogênico são ainda mais convenientemente atendidos em instalações dedicadas de CFS. Além disso, a necessidade de coleta de muitos conjuntos de dados de difração defende fortemente a localização dessas instalações perto de linhas de luz que são voltadas para um alto rendimento amostral. Exemplos para isso são as linhas de luz I04-1 na Diamond Light Source e as instalações associadas da XChem no Reino Unido^8,25, as linhas de luz MASSIF no ESRF na França²⁶ ou a instalação FragMAX na linha de feixe BioMAX no MAX IV na Suécia¹⁸.

No futuro, poderia ser imaginado para projetar experimentos cfs sem a necessidade de manuseio de cristais completamente. Os primeiros avanços nessa direção foram relatados. Por exemplo, por transferência líquida acústica permitindo a mistura tanto das soluções contendo cristais quanto das soluções de fragmento diretamente nos porta-amostras do tipo^{malha 27}. Outra abordagem foi usada para a triagem de ligantes baseada em XFEL. Em um experimento de prova de princípio, um chorume de cristal foi preparado em lote, e a coleta de dados de imersão e difração foi realizada em um chip de destino fixo de silício²⁸. No entanto, essas abordagens ainda estão em desenvolvimento e longe de serem aplicáveis a uma ampla gama de metas proteicas ou viáveis para as instalações de CFS como rotina.

Com o protocolo neste trabalho instruções detalhadas para realizar com sucesso campanhas de CFS diretamente na HZB (e em outros lugares) foram delineadas e orientações gerais e dicas práticas úteis na preparação e condução de tais experimentos com maiores chances de sucesso foram dadas. Em última análise, melhores chances e taxas de sucesso na triagem de CFS contribuem em grande parte para fornecer pontos de partida eficientemente para o desenvolvimento a jusante de compostos de ferramentas ou candidatos a medicamentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 µ Pipeta L	Eppendorf	EP3123000012
12 canais, 100 µ L	Eppendorf	EP4861000791
Secador	de cabelo TH-Geyer	9.106 788
Placas de cristalização contendo cristal			Contém cristais a serem embebidos
Incubadora			Fornecendo temperatura constante para experimento de cristalização, em HZB: 20° C
MicroLoops de espessura dupla (LD) de diferentes tamanhos de abertura	MiTeGen	vários, por exemplo M5-L18SP-75LD	250 loops no tamanho apropriado necessário para o protocolo, podem ser fornecidos pela HZB
EasyAccess Frame	HZB		O EasyAccess Frame é um dispositivo especial para manuseio de múltiplos cristais, que foi desenvolvido no HZB (Barthel et al., 2021).
Placa de tela de entrada F2X	HZB		Tela de entrada F2X desenvolvida (Wollenhaupt et al., 2020)
Placa de ponto Glas	VWR	MARI1406506
Nitrogênio			Pelo menos uma lata de 5 L cheia
de armazenamento de nitrogênio líquido pode	n.a.a.Varinha
de cristal Magentic	MiTeGen	M-R-1013198
Microscópios	Leica	n.a.MRC
3 lentes Placa de cristalização de baixo perfil de 96 poços	SwissCI	3W96TLP-UVP	Para cristais embebidos em simulação (opcional)
Reservatório de reagente	Carl Roth	EKT6.1	Volume de 25 ml
Modelo			https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx
Bisturi	B. Braun	BA825SU
Folha de vedação para placas de microtitulação	GreinerBioOne	676070
Canas de envio de disco de prateleira (para Unipucks)	MiTeGen	M-CP-111-065	2 canas feitas de alumínio; pode ser fornecido pela solução de imersão HZB
			São necessários pelo menos 5 ml
Solução de imersão incluindo crioprotetor, 150µ L			Necessário apenas se a solução de imersão já não for crioprotetora Tecidos
	Roth (Kimberly Clark Professional)	AA64.1
Dewar de transporte (remetente seco de Whartington)	MiTeGen	TW-CX100	2 Dewars de viagem para armazenamento das 2 bengalas unipuck, alternativamente um dewar de armazenamento do tipo VHC35 ou similar pode ser usado.
Dewars de espuma Unipuck com tampa	MiTeGen	M-CP-111-022	dois dewars de espuma especialmente adequados para o manuseio de unipuck descrito no protocolo se forem usados discos SPINE, diferentes dewars de espuma podem ter que ser aplicados.
Unipuck starter set	MiTeGen	M-CP-UPSK001	Pode ser fornecido pelo HZB
Unipucks	MiTeGen	M-CP-111-021	14 unipucks; pode ser fornecido pelo HZB