Aqui, apresentamos um ensaio de cocultura fácil de usar para analisar a migração de glioblastoma (GBM) em neurônios padronizados. Desenvolvemos uma macro no software FiJi para fácil quantificação da migração celular GBM em neurônios, e observamos que os neurônios modificam a capacidade invasiva celular GBM.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Glioblastomas (GBMs), gliomas malignos de grau IV, são um dos tipos mais mortais de câncer humano por causa de suas características agressivas. Apesar dos avanços significativos na genética desses tumores, como as células GBM invadem o parenchyma cerebral saudável não é bem compreendida. Notavelmente, foi demonstrado que as células GBM invadem o espaço peritumoral através de diferentes rotas; o principal interesse deste artigo é a rota ao longo de tratos de matéria branca (WMTs). As interações das células tumorais com os componentes das células nervosas peritumorais não são bem caracterizadas. Aqui, foi descrito um método que avalia o impacto dos neurônios na invasão celular GBM. Este artigo apresenta um ensaio avançado de cocultura in vitro que imita a invasão de WMT analisando a migração de células-tronco GBM em neurônios. O comportamento das células GBM na presença de neurônios é monitorado usando um procedimento de rastreamento automatizado com software de código aberto e de acesso livre. Este método é útil para muitas aplicações, em particular, para estudos funcionais e mecanicistas, bem como para analisar os efeitos de agentes farmacológicos que podem bloquear a migração celular GBM em neurônios.
Introdução
Gliomas malignos primários, incluindo GBMs, são tumores devastadores, com uma taxa média de sobrevivência de 12 a 15 meses relatada para pacientes com GBM. A terapia atual conta com grande ressecção de massa tumoral e quimioterapia aliada à radioterapia, que só aumenta a taxa de sobrevivência em poucos meses. As falhas terapêuticas estão intimamente relacionadas ao mau fornecimento de drogas através da barreira hematoencefálica (BBB) e ao crescimento invasivo em espaços perivasculares, meninges e ao longo das OTN1. A invasão perivascular, também chamada de co-opção vascular, é um processo bem estudado, e os mecanismos moleculares estão começand....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com os regulamentos do comitê de ética local). Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética em pesquisa humana e animal da Universidade de Bordeaux. Ratos grávidas foram alojados e tratados na instalação animal da Universidade de Bordeaux. A eutanásia de um rato grávida cronometrado E18 foi realizada usando CO2. Todos os procedimentos de animais foram feitos de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo comitê de ética local. Todos os produtos comerciais são referenciados na Tabela de Materiais.<....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Neurônios padronizados co-cultivados com células GBM fluorescentes foram preparados como descrito na seção de protocolo, e experimentos de rastreamento foram realizados. As células GBM modificaram rapidamente sua forma enquanto migravam nos neurônios(Figura 1B: painel 6 e vídeo 1). As células migraram ao longo das extensões neuronais, em um movimento aleatório(Vídeo 1). Células GBM fluorescentes e neurônios não fluorescentes podem ser facilm.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Glioblastomas invadem extensivamente o parenchyma usando diferentes modos: co-opção de vasos sanguíneos circundantes, invasão intersticiacional ou invasão em WMTs18. Este último modo não é bem caracterizado na literatura devido à dificuldade em encontrar modelos in vitro ou in vivo adequados relacionados à invasão de WMT. Aqui, foi proposto um modelo simplificado no qual neurônios de roedores cultivados foram padronizados em superfícies revestidas de laminina, e células-tronco fl.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole é apoiado pela Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon é bolsista do Hospital Universitário de Toulouse (CHU Toulouse).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (3-aminopropil) trietoxissilano | Sigma | 440140-100ML | O grupo amino é útil para a bioconjugação da |
| fundo redondo de 96 poços | Sarstedt | 2582624 | Usado para preparar esferoides |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Armazenado a -20 ° C (longo prazo) ou 4 &graus; C (curto prazo), enzima de dissociação de esfera |
| B27 | Gibco | 12587 | Armazenado a -20 ° C, descongele antes de usar |
| Fator de Crescimento Básico de Fibroblastos | Peprotech | 100-18B | Armazenado a -20 ° C, descongele antes |
| de usar Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Usado para contagem de células |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Substrato de cultura de células |
| Cartuchos dessecadores | Sigma | Z363456-6EA | Usado para reduzir a umidade durante o tratamento com (3-aminopropil) trietoxisilano |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Armazenado em 4 ° C |
| Software Fiji, MTrack2 macro | ImageJ | Usado para analisar imagens | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparina sódica | Sigma | H3149-100KU | Armazenado a 4 ° C |
| Laminina | 114956-81-9 | Promove a adesão neuronal | |
| Carregamento do software | de micropadrões previstos | ||
| Software MetaMorph | Molecular Devices LLC | NA | Software de automação de microscopia |
| Metilcelulose | Sigma | M0512 | Diluído em NBM para uma concentração final de 2% |
| Meio neurobasal | Gibco | 21103-049 | Armazenado a 4 ° C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | microscópio invertido equipado com um palco motorizado | ||
| Penicilina - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Armazenado a 4 ° C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Fotoiniciador usado para degradar a escova PEG |
| Poli (etilenoglicol) -Succinimidil Valerato (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Usado como revestimento anti-incrustante |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Aparelho de projeção UV baseado em dispositivo de microespelho digital (DMD) |
| Azul de tripano 0,4% | ThermoFisher | T10282 | Usado para contagem de células |
| Tripsina-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Usado para separar células aderentes |
Referências
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
