Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

Gliomas malignos primários, incluindo GBMs, são tumores devastadores, com uma taxa média de sobrevivência de 12 a 15 meses relatada para pacientes com GBM. A terapia atual conta com grande ressecção de massa tumoral e quimioterapia aliada à radioterapia, que só aumenta a taxa de sobrevivência em poucos meses. As falhas terapêuticas estão intimamente relacionadas ao mau fornecimento de drogas através da barreira hematoencefálica (BBB) e ao crescimento invasivo em espaços perivasculares, meninges e ao longo das OTN¹. A invasão perivascular, também chamada de co-opção vascular, é um processo bem estudado, e os mecanismos moleculares estão começando a ser elucidados; no entanto, o processo de invasão de células GBM ao longo de WMTs não é bem compreendido. As células tumorais migram para o cérebro saudável ao longo das estruturas secundárias de Scherer². De fato, há quase um século, Hans-Joachim Scherer descreveu as rotas invasivas do GBM, que agora são referidas como satellitose perineuronal, satellitose perivascular, propagação subpial e invasão ao longo do WMT (Figura 1A).

Algumas quimiocinas e seus receptores, como o fator de crescimento estroboma derivado de células estromal 1α (SDF1α) e c-X-C, o receptor de quimioterapia 4 (CXCR4), mas não o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), parecem estar implicados na invasão do TNM³. Mais recentemente, um eixo TRANScelular NOTCH1-SOX2 mostrou-se um importante caminho na invasão de WMT de células GBM⁴. Os autores descreveram como células-tronco GBM invadem o parênquim cerebral em neurônios parcialmente nãoomiados, sugerindo a destruição de baias de mielina por células GBM. Um marco foi alcançado em 2019, quando três artigos foram publicados de forma consecutiva na revista Nature, destacando o papel da atividade elétrica no desenvolvimento do glioma^5,6. O trabalho seminal de Monje e colaboradores lançou luz sobre o papel central da atividade elétrica na secreção da neuroligina-3, que promove o desenvolvimento do glioma.

Winkler e colaboradores descreveram as conexões entre as células GBM (microtubos) sendo cruciais em etapas invasivas e, ultimamente, interações entre células GBM e neurônios através de sinapses neuroglioma recém-descritas. Essas estruturas favorecem a estimulação glutamatergica de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA) localizados na membrana celular GBM, que promove o desenvolvimento e invasão do tumor. A invasão de células tumorais é um processo central na disseminação de metástases ou focos secundários distantes, como observado em pacientes com GBM. Vários fatores foram identificados como importantes na invasão do GBM, como o trombospondina-1, um fator de crescimento transformador beta (proteína matricellular regulada por TGFβ, ou o receptor de quimioterapia CXCR3)^7,8.

Aqui, um modelo biomimético simplificado foi descrito para estudar a invasão gbm, em que os neurônios são padronizados em trilhas de laminina, e as células GBM são semeadas sobre ele, como células únicas ou como esferoides(Figura 1B). As duas configurações experimentais visam recapitular a invasão sobre neurônios, o que é observado em GBM^9,10,11. Tais modelos foram desenvolvidos no passado como biomateriais de nanofibra alinhados (eletropinning de conchas centrais) que permitem estudar a migração celular através da modulação de propriedades mecânicas ou químicas¹². O modelo de cocultura descrito neste artigo permite uma melhor compreensão de como as células GBM escapam nos neurônios definindo novas vias moleculares envolvidas nesse processo.

O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com os regulamentos do comitê de ética local). Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética em pesquisa humana e animal da Universidade de Bordeaux. Ratos grávidas foram alojados e tratados na instalação animal da Universidade de Bordeaux. A eutanásia de um rato grávida cronometrado E18 foi realizada usando CO₂. Todos os procedimentos de animais foram feitos de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo comitê de ética local. Todos os produtos comerciais são referenciados na Tabela de Materiais.

1. Preparação dos slides padronizados

1. Preparação de substrato para micropatterning
   1. Trate as tampas de vidro circular de 18 mm por ativação de ar/plasma por 5 minutos. Coloque as tampas em uma câmara fechada com 100 μL de trietoxisilano (3-aminopropilil) em um dessecator por 1 h.
   2. Incubar com 100 mg/mL de poli (etileno glicol)-valerate succinimidil (peso molecular 5.000 (Peg-SVA)) em tampão de carbonato de 10 mM, pH > 8, por 1 h. Enxágüe extensivamente com água ultrauso, e seque sob uma capa química.
      NOTA: Nesta fase, a amostra pode ser armazenada a 4 °C no escuro para uso posterior.
   3. Adicione o fotoinitiador, 4-benzoilbenzyl-trimethylammonium cloreto (PLPP), a 14,7 mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
      NOTA: Uma forma concentrada de PLPP, um gel PLPP, também pode ser usada. Resulta em um tempo de iluminação ultravioleta (UV) mais curto necessário para degradar a escova PEG (100 mJ/mm²).
2. Depoimento de gel fotoinitiador
   1. Prepare uma mistura de 3 μL de gel PLPP e 50 μL de etanol absoluto para depósito no centro do slide. Coloque a amostra sob uma capa química até a evaporação completa do etanol absoluto.
      NOTA: Nesta fase, a amostra pode ser armazenada a 4 °C no escuro para uso posterior.
3. Micropatterning de lâmina de vidro
   1. Monte o deslizamento em uma câmara Ludin, e coloque-o no estágio motorizado de um microscópio equipado com um sistema de foco automático.
   2. Carregue imagens correspondentes aos micropatterns previstos no software. Aplique estes parâmetros: replicação 4 x 4 vezes, espaçamento de 200 μm, dose UV de 1.000 mJ/mm². Após a sequência automática de iluminação UV, enxágue o PLPP com várias lavagens PBS.
      NOTA: Se o gel PLPP foi usado, remova-o por extensas lavagens com água deionizada, seque em um córrego de N₂, e armazene a 4 °C.
   3. Incubar com laminina (50 μg/mL em PBS) por 30 min. Lave extensivamente com PBS.
      NOTA: Uma solução fluorescente de proteína fluorescente verde purificada (GFP, 10 μg/mL em PBS) pode ser misturada com laminina para visualizar os micropatterns por microscopia de fluorescência.

2. Preparação de neurônios e células GBM para co-cultura

1. Cultura de neurônios hipocampais de ratos embrionários
   1. Disseque o hipocampo de ratos embrionários (E18) e transfira o tecido para uma solução de sal balanceada de Hank (HBSS)/1 mM 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES)/penicilina-estreptomicina em um tubo de 15 mL. Remova a solução em excesso sem secar o hipocampo.
   2. Adicione 5 mL de ácido tetraacético de trippsin-etilenodiamina (EDTA) suplementado com penicilina (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) e 1 mM HEPES, e incubar por 15 min a 37 °C. Lave 2x com a solução HBSS/HEPES/penicilina-estreptomicina, e deixe o tecido permanecer nesta solução por 2-3 min.
   3. Dissociar o tecido usando duas pipetas Pasteur polidas por chama, pipetando para cima e para baixo 10x com cada tecido, tomando o cuidado de minimizar a espuma. Conte as células e avalie a viabilidade da suspensão celular. Aplaque os neurônios em tampas micropatteradas como indicado abaixo.
      NOTA: A taxa de viabilidade celular é de 85-90% após a extração.
2. Cultura celular para neurônios em tampas micropatteradas
   1. Deslizamentos de vidro micropatterados de reidratação com PBS, e incubar meio completo de cultura celular neuronal.
   2. Sementes os neurônios hipocampais obtidos de ratos E18 Sprague-Dawley diretamente sobre a tampa de vidro micropatterado a uma densidade de 50.000 células por cm² em meio neurobásal (NBM) enriquecido com 3% de soro de cavalo. Coloque os neurônios micropatterados na incubadora (37 °C, 5% CO₂) por 48 h.
      NOTA: Depois de ~6 h, neurônios hipocampais primários podem ser vistos aderindo aos micropatterns de laminina.
3. Co-cultura de células-tronco gbm humanas em neurônios
   NOTA: Para este estudo, as células GBM derivadas do paciente com GFP e tomate nuclear foram cultivadas de acordo com os protocolos publicados anteriormente¹⁰.
   1. À medida que as células em forma de esferoide crescem em suspensão, centrífugas a suspensão por 5 min a 200 × g. Lave os esferoides com 5 mL de PBS e incuba as células com 0,5 mL do reagente de dissociação celular (ver a Tabela de Materiais) por 5 min a 37 °C.
   2. Adicione 4,5 mL de NBM completo (complementado com suplemento B27, heparina, fator de crescimento do fibroblasto 2, penicilina e estreptomicina, conforme descrito anteriormente⁸), e conte as células usando uma técnica de contagem automática.
   3. Sementes 1.000 células GBM sobre a cultura neuronal micropatterada em NBM enriquecidas com 3% de soro de cavalo. Incubar a placa a 37 °C, 5% DE CO₂e 95% umidade.

3. Imagem celular ao vivo

1. Imediatamente após a semeadura celular GBM, coloque a amostra no estágio de um microscópio invertido equipado com uma câmara de termostato. Realize imagens de células vivas no microscópio equipado com um estágio motorizado para registrar múltiplas posições usando uma caixa de ferramentas de aquisições multidimensionais no software. Adquira imagens de campo brilhante e epifluorescência GFP/Tomate a cada 5 minutos ao longo de 12 h com um objetivo de 20x em um ambiente de temperatura (37 °C) e controlado por gás (5% CO₂).

4. Análise de imagem

NOTA: Usando a pilha de imagens Fiji, bidimensional (2D), foram semi-automaticamente pré-processados ou processados usando uma ferramenta caseira e fácil de usar (disponível neste endereço: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), que está escrita na linguagem macro IJ1(Figura 2A). O fluxo de trabalho automatizado e os procedimentos são resumidos na Figura 2B.

1. Análise da rede neuronal (Figura 2Bi)
   1. Selecione uma imagem da pilha. Clique com o botão direito do mouse na ferramenta Rede para abrir a caixa de diálogo opções correspondentes e ajustar as configurações (por exemplo, Limiar = Triângulo, Li, Huang..., Desfoque gaussianoe filtros medianos = 1, 2, 3...) para produzir uma segmentação precisa de imagens. Em seguida, clique em OK.
   2. Clique à esquerda na ferramenta Rede para ativar automaticamente o seguinte procedimento.
      1. Duplique a imagem selecionada e divida-a em três canais de cores (Vermelho-Cinza-Verde).
      2. Selecione o canal cinza (brightfield) e realize o aprimoramento do estiramento de contraste (CSE) para melhorar a separação entre diferentes áreas. Use o detector de bordas Sobel (SED) para executar a operação de convolução de processamento de sinal 2D já agrupada sob o comando Find Edge.
      3. Para filtragem dupla (F), aplique um desfoque gaussiano e filtro mediano para reduzir o ruído e suavizar o sinal do objeto. Converta-se em Máscara (CM) executando algoritmos de limiar adaptados para obter uma imagem binária (binário cinza) com pixels pretos (área celular) e pixels brancos (fundo). Skeletonize (Sk) a área celular em uma rede simples (NET) e filtra partículas (EP) em uma imagem NET removendo pequenas partículas não-em rede.
      4. Para canais vermelhos e verdes (núcleo e membrana), realize a dupla filtragem, converta-se em Máscara usando o método de limiar adaptado e permita que bin-green determine morfologia celular com o comando Analisar partículas.
      5. Mescle todos os canais usando sua região de interesse (ROI) com o operador OR (combine) e reajuste sua cor inicial em uma imagem RGB simples.
2. Análise de motilidade unicelular(Figura 2Bii)
   1. Clique com o botão direito do mouse na ferramenta Rastreamento de Células Únicas para abrir a caixa de diálogo opções correspondentes e ajustar as configurações (por exemplo, tipo de trilha = núcleo ou membrana, limiar = triângulo, li, huang..., projeção Z = intensidade máxima, Fatias de Soma..., Desfoque gaussiano e filtros medianos = 1, 2, 3...) para produzir uma segmentação precisa de imagens. Em seguida, clique em OK.
   2. Clique à esquerda na ferramenta Rastreamento de células únicas para ativar automaticamente o seguinte procedimento.
      1. Remova o canal cinza. Aplique uma projeção Z na pilha, que gerará uma imagem correspondente a uma pilha de imagens de acordo com o tempo (T-stack). Filtro duplo e converta-se para Mascarar as trilhas deixadas pelas células. Remova pequenas partículas para a imagem BIN-vermelho/verde.
      2. Usando o ROI, selecione cada contorno do traço da célula e marque a caixa Pular a detecção de borda na caixa de diálogo Opções para pular esta etapa de pré-processamento para etapas subsequentes.
      3. Isole o canal vermelho(tipo trilha = núcleo) na pilha original. Selecione um ROI e remova a área externa. Filtre todas as imagens e converta-se em Máscara (BIN-vermelho). Determine a posição centroide X/Y de cada núcleo binarizado.
   3. Usando uma macro já publicada para o software de planilha^13,calcule o deslocamento quadrado médio, a razão de direcionalidade e a velocidade média para esta célula.
3. Análise de rastreamento de células múltiplas(Figura 2Biii)
   1. Clique com o botão direito do mouse na ferramenta Rastreamento para abrir a caixa de diálogo opções correspondentes e ajustar as configurações (por exemplo, Limiar = Triângulo, Li, Huang..., Desfoque gaussiano e filtros Mediana = 1, 2, 3...) para produzir uma segmentação precisa de imagens. Em seguida, clique em OK.
   2. Clique à esquerda na ferramenta Rastreamento para ativar automaticamente o seguinte procedimento.
      1. Remova o canal cinza.
      2. Divida os canais vermelho e verde, filtro duplo e converta-se em Máscara.
      3. Mescle os canais usando a Calculadora de Imagens... comando com o operador E, deixando apenas o sinal do núcleo encontrado nas membranas.
         NOTA: Vários plugins em Fiji podem ser usados para determinar a posição X/Y de várias células nesta imagem pré-processada binária ao mesmo tempo (veja a Tabela de Materiais).
   3. Utilizando uma macro¹³descrita anteriormente, calcule o enredo de trajetória, deslocamento quadrado médio, razão de direcionalidade e velocidade média para essas células.
4. Migração esferoide no tapete neural (Figura 2Biv)
   1. Clique com o botão direito do mouse na ferramenta Migração para abrir a caixa de diálogo opções correspondentes e ajustar as configurações (por exemplo, Limiar = Triângulo, Li, Huang..., Desfoque gaussiano e filtros Mediana = 1, 2, 3...) para produzir uma segmentação precisa de imagens. Em seguida, clique em OK.
   2. Clique à esquerda na ferramenta Migração para ativar automaticamente o seguinte procedimento.
      1. Remova o canal vermelho.
      2. Divida os canais verde e cinza.
      3. Para o canal cinza, desenhe manualmente o contorno do tapete neuronal e meça sua área.
      4. Para o canal verde, filtre duas vezes a pilha e converta-se em Máscara. Remova a área fora do padrão (BIN) e determine a área da célula binarizada para cada imagem.
         NOTA: Os parâmetros descritos acima são calibrados alterando seus valores clicando à esquerda no ícone de interesse. Esse processamento pode ser feito manualmente. No entanto, para um grande número de imagens (aproximadamente cem por aquisições), canais (geralmente 3 canais) e etapas de processamento, uma ferramenta automatizada ou semi-automatizada seria preferível.

Neurônios padronizados co-cultivados com células GBM fluorescentes foram preparados como descrito na seção de protocolo, e experimentos de rastreamento foram realizados. As células GBM modificaram rapidamente sua forma enquanto migravam nos neurônios(Figura 1B: painel 6 e vídeo 1). As células migraram ao longo das extensões neuronais, em um movimento aleatório(Vídeo 1). Células GBM fluorescentes e neurônios não fluorescentes podem ser facilmente distinguidos, e isso permitiu o rastreamento dos movimentos celulares usando a macro fiji, conforme descrito na seção de protocolo(Figura 2). Fiji é um software de licença aberta que facilita o processamento e análise de imagens. Procedimentos manuais relativamente demorados para a análise de inúmeras imagens podem ser automatizados em uma macro. As imagens são importadas pelo procedimento de arrastar e soltar, processados e quantificados, gerando dados disponíveis por meio de um gerenciador de ROI.

Quando depositada na pasta Fiji.app | macros | toolsets, a ferramenta Gliomas-Neurons estava disponível no menu Mais Ferramentas e exibia vários ícones(Figura 2A). Um fluxo de trabalho do processamento de imagem, obtido clicando nos ícones, é ilustrado na Figura 2B (i-iv). A forma celular pode ser analisada na rede neural (Figura 2B, i). Vários parâmetros do rastreamento celular podem ser obtidos para uma (Figura 2B, ii) ou várias células(Figura 2B,iii) usando dois processos de imagem distintos. A velocidade de recuperação por células spheroid GBM nos neurônios também pode ser analisada(Figura 2B, iv). As células semeadas em neurônios apresentaram uma forma alongada com múltiplas saliências seguindo os tratos dos neurônios(Figura 3A, i), mas tinham uma forma redonda quando cultivadas diretamente na laminina(Figura 3A,ii). As células cultivadas em neurônios modificaram eficientemente sua forma, embora não fossem alongadas quando cultivadas em laminina (Figura 3A, iii-v). Saliências finas, às vezes ligando duas células, foram vistas em células co-cultivadas com neurônios em estágios posteriores(Vídeo 1).

A capacidade migratória das células GBM semeadas nos neurônios foi comparada com as células diretamente semeadas em laminina. As células semeadas em neurônios apresentaram maiores capacidades migratórias do que apenas na laminina(Figura 3B, i,ii). O movimento aleatório das células P3 foi detectado em ambas as condições, com maior distância para células P3 nos neurônios, como mostrado na trama de trajetória (Figura 3B, i,ii). A motilidade celular foi estimada quantitativamente pelo deslocamento quadrado médio (MSD), e sua representação de tronco foi equipada com uma função linear14 (Figura 3B, iii). A direcionalidade e a velocidade média também foram calculadas para ambas as condições (Figura 3B, iv,v). A migração celular de esferoides P3 também foi seguida pela detecção da área fluorescente ao longo do tempo nos neurônios e comparada apenas com a migração em laminina(Figura 3C,i,ii e Vídeo 2). Metade do padrão com neurônios foi coberto com células GBM após 500 min em um perfil linear; no entanto, os esferoides não aderiram ao padrão laminina (Figura 3D, iii e Vídeo 2).

Figura 1: Configuração experimental de células de glioblastoma migrando em neurônios padronizados. (A) Representação de células de glioblastoma invadindo o hemisfério contralateral através do corpo caloso. (B) Configuração experimental. Na etapa 1, a superfície da placa é revestida com uma camada PEG anti-induque. O fotoinitiador é adicionado na etapa 2, cobrindo todo o revestimento. Na etapa 3, uma imagem de campo largo UV é projetada através do objetivo do microscópio, que ativa localmente as moléculas fotoiniciadoras. O fotoinicializador ativado localmente corta moléculas PEG e permite a adsorção subsequente de laminina. Na etapa 5, os neurônios são semeados e aderem às matrizes de laminina. As células de glioblastoma P3 (GFP/Tomatenuclear)são então depositadas no padrão neuronal, e as imagens são adquiridas (passo 6). Abreviaturas: PEG = polietilenoglicol; UV = ultravioleta; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho da ferramenta Fiji e análise. (A) A ferramenta chamada Gliomas-Neurons está disponível no menu Mais Ferramentas quando a macro é adicionada à pasta Fiji.app | macros | toolsets (painel esquerdo). É composto por várias ferramentas de ação descritas abaixo (painel direito). i( B) i. Ferramenta de rede: processamento de imagem, que é usado para desenhar a rede neural e células glioma em uma representação simplificada. ii. Ferramenta de rastreamento de células únicas: processamento de imagem, que é usado para desenhar e selecionar a área de movimento celular para analisar o deslocamento de células únicas. iii. Ferramenta de rastreamento: etapas de pré-processamento de imagem para o uso de plugins de rastreamento Fiji pré-instalados. iv. Ferramenta de migração relativa: processamento de imagem, que é usado para determinar a migração celular relativa em um padrão selecionado manualmente. Alguns parâmetros podem ser calibrados com um clique à esquerda no botão da ferramenta. Abreviaturas: CSE = Aprimoramento do estiramento de contraste; SED = Sobel Edge Detector; F = filtragem dupla; CM = Converter para Máscara; Sk = Esqueleto; EP = Eliminação de partículas; OR (combinar) = Operador sindical em ROIs selecionados; E = Operador de conjunção em ROIs selecionados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação de células P3 ou esferoides em neurônios padronizados vs. revestimento laminina. (A) Descritores de forma de célulasnucleares P3 GFP/Tomate dissociadas em neurônios ou em laminina. Exemplo de redes processadas de células P3 em i. neurônios padronizados ou em ii. revestimento de laminina. Barra de escala = 50 μm. iii. Área celular média em neurônios padronizados ou em laminina. iv. Formfactor é a razão da circunferência com a área normalizada para um círculo, fornecendo parâmetros sobre alongamento celular e ramificação celular. v. A proporção é a razão do eixo principal com o eixo menor da célula. Em iii, iv, e v, 15 células foram analisadas por campo; 4 padrões independentes; os dados são representados como média ± S.E.M. (B) Análise de rastreamento de células P3 dissociadas. Um gráfico representativo de células em(i)neurônios padronizados e (ii)no revestimento de laminina. iii. MSD de células P3 migrando em neurônios ou em revestimento de laminina. Os valores x/Y estão em escalas logarítmicas. iv. Razão de direcionalidade. v. Migração média da velocidade celular. Em iii, iv, e v, 15 células foram analisadas por campo; 4 padrões independentes; os dados são representados como média ±.Manálise de migração de spheroids P3 GFP. Imagens representativas em diferentes pontos de tempo de esferoides P3 em(i)neurônios padronizados ou em(ii)revestimento de laminina. Barra de escala = 100 μm. iii. Migração esferoide representada pela confluência padrão; 4 padrões independentes; os dados são representados como ± média S.E.M. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; S.E.M. = erro padrão da média; MSD = Deslocamento quadrado médio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Células P3 em neurônios ou laminina registradas acima de 8h (imagens a cada 5 minutos). O vídeo mostra a migração de células únicas P3 em neurônios (esquerda) e no revestimento de laminina (à direita). As células expressavam proteína fluorescente verde (GFP, cor verde) e tomate nuclear (cor vermelha). Barra = 50 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Esferoides P3 em neurônios ou laminina registrados acima de 8h (imagens a cada 5 minutos). O vídeo mostra a migração de esferoides P3 em neurônios (esquerda) e no revestimento de laminina (à direita). As células expressavam proteína fluorescente verde (GFP, cor verde). Barra = 100 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.