Name: Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda a analisar a migração de células de glioblastoma em neurônios padronizados usando um sistema de co-cultura reprodutível. Este método permite quantificar a capacidade invasiva tumoral com potencial aplicação clínica.

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Este trabalho foi apoiado pela Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole é apoiado pela Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon é bolsista do Hospital Universitário de Toulouse (CHU Toulouse).

O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com os regulamentos do comitê de ética local). Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética em pesquisa humana e animal da Universidade de Bordeaux. Ratos grávidas foram alojados e tratados na instalação animal da Universidade de Bordeaux. A eutanásia de um rato grávida cronometrado E18 foi realizada usando CO2. Todos os procedimentos de animais foram feitos de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo comitê de ética local. Todos os produtos comerciais são referenciados na Tabela de Materiais.
1. Preparação dos slides padronizados
<ol><li>Preparação de substrato para micropatterning<ol>
<li>Trate as tampas de vidro circular de 18 mm por ativação de ar/plasma por 5 minutos. Coloque as tampas em uma câmara fechada com 100 μL de trietoxisilano (3-aminopropilil) em um dessecator por 1 h.</li>
		<li>Incubar com 100 mg/mL de poli (etileno glicol)-valerate succinimidil (peso molecular 5.000 (Peg-SVA)) em tampão de carbonato de 10 mM, pH > 8, por 1 h. Enxágüe extensivamente com água ultrauso, e seque sob uma capa química. NOTA: Nesta fase, a amostra pode ser armazenada a 4 °C no escuro para uso posterior.</li>
		<li>Adicione o fotoinitiador, 4-benzoilbenzyl-trimethylammonium cloreto (PLPP), a 14,7 mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). NOTA: Uma forma concentrada de PLPP, um gel PLPP, também pode ser usada. Resulta em um tempo de iluminação ultravioleta (UV) mais curto necessário para degradar a escova PEG (100 mJ/mm2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depoimento de gel fotoinitiador<ol>
<li>Prepare uma mistura de 3 μL de gel PLPP e 50 μL de etanol absoluto para depósito no centro do slide. Coloque a amostra sob uma capa química até a evaporação completa do etanol absoluto. NOTA: Nesta fase, a amostra pode ser armazenada a 4 °C no escuro para uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Micropatterning de lâmina de vidro<ol>
<li>Monte o deslizamento em uma câmara Ludin, e coloque-o no estágio motorizado de um microscópio equipado com um sistema de foco automático.</li>
		<li>Carregue imagens correspondentes aos micropatterns previstos no software. Aplique estes parâmetros: replicação 4 x 4 vezes, espaçamento de 200 μm, dose UV de 1.000 mJ/mm2. Após a sequência automática de iluminação UV, enxágue o PLPP com várias lavagens PBS. NOTA: Se o gel PLPP foi usado, remova-o por extensas lavagens com água deionizada, seque em um córrego de N2, e armazene a 4 °C.</li>
		<li>Incubar com laminina (50 μg/mL em PBS) por 30 min. Lave extensivamente com PBS. NOTA: Uma solução fluorescente de proteína fluorescente verde purificada (GFP, 10 μg/mL em PBS) pode ser misturada com laminina para visualizar os micropatterns por microscopia de fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de neurônios e células GBM para co-cultura
<ol><li>Cultura de neurônios hipocampais de ratos embrionários<ol>
<li>Disseque o hipocampo de ratos embrionários (E18) e transfira o tecido para uma solução de sal balanceada de Hank (HBSS)/1 mM 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES)/penicilina-estreptomicina em um tubo de 15 mL. Remova a solução em excesso sem secar o hipocampo.</li>
		<li>Adicione 5 mL de ácido tetraacético de trippsin-etilenodiamina (EDTA) suplementado com penicilina (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) e 1 mM HEPES, e incubar por 15 min a 37 °C. Lave 2x com a solução HBSS/HEPES/penicilina-estreptomicina, e deixe o tecido permanecer nesta solução por 2-3 min.</li>
		<li>Dissociar o tecido usando duas pipetas Pasteur polidas por chama, pipetando para cima e para baixo 10x com cada tecido, tomando o cuidado de minimizar a espuma. Conte as células e avalie a viabilidade da suspensão celular. Aplaque os neurônios em tampas micropatteradas como indicado abaixo. NOTA: A taxa de viabilidade celular é de 85-90% após a extração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultura celular para neurônios em tampas micropatteradas<ol>
<li>Deslizamentos de vidro micropatterados de reidratação com PBS, e incubar meio completo de cultura celular neuronal.</li>
		<li>Sementes os neurônios hipocampais obtidos de ratos E18 Sprague-Dawley diretamente sobre a tampa de vidro micropatterado a uma densidade de 50.000 células por cm2 em meio neurobásal (NBM) enriquecido com 3% de soro de cavalo. Coloque os neurônios micropatterados na incubadora (37 °C, 5% CO2) por 48 h. NOTA: Depois de ~6 h, neurônios hipocampais primários podem ser vistos aderindo aos micropatterns de laminina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Co-cultura de células-tronco gbm humanas em neurônios NOTA: Para este estudo, as células GBM derivadas do paciente com GFP e tomate nuclear foram cultivadas de acordo com os protocolos publicados anteriormente10.<ol>
<li>À medida que as células em forma de esferoide crescem em suspensão, centrífugas a suspensão por 5 min a 200 × g. Lave os esferoides com 5 mL de PBS e incuba as células com 0,5 mL do reagente de dissociação celular (ver a Tabela de Materiais) por 5 min a 37 °C.</li>
		<li>Adicione 4,5 mL de NBM completo (complementado com suplemento B27, heparina, fator de crescimento do fibroblasto 2, penicilina e estreptomicina, conforme descrito anteriormente8), e conte as células usando uma técnica de contagem automática.</li>
		<li>Sementes 1.000 células GBM sobre a cultura neuronal micropatterada em NBM enriquecidas com 3% de soro de cavalo. Incubar a placa a 37 °C, 5% DE CO2e 95% umidade.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Imagem celular ao vivo
<ol><li>Imediatamente após a semeadura celular GBM, coloque a amostra no estágio de um microscópio invertido equipado com uma câmara de termostato. Realize imagens de células vivas no microscópio equipado com um estágio motorizado para registrar múltiplas posições usando uma caixa de ferramentas de aquisições multidimensionais no software. Adquira imagens de campo brilhante e epifluorescência GFP/Tomate a cada 5 minutos ao longo de 12 h com um objetivo de 20x em um ambiente de temperatura (37 °C) e controlado por gás (5% CO2).</li>
</ol>4. Análise de imagem
NOTA: Usando a pilha de imagens Fiji, bidimensional (2D), foram semi-automaticamente pré-processados ou processados usando uma ferramenta caseira e fácil de usar (disponível neste endereço: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), que está escrita na linguagem macro IJ1(Figura 2A). O fluxo de trabalho automatizado e os procedimentos são resumidos na Figura 2B.
<ol><li>Análise da rede neuronal (Figura 2Bi)<ol>
<li>Selecione uma imagem da pilha. Clique com o botão direito do mouse na ferramenta Rede para abrir a caixa de diálogo opções correspondentes e ajustar as configurações (por exemplo, Limiar = Triângulo, Li, Huang..., Desfoque gaussianoe filtros medianos = 1, 2, 3...) para produzir uma segmentação precisa de imagens. Em seguida, clique em OK.</li>
		<li>Clique à esquerda na ferramenta Rede para ativar automaticamente o seguinte procedimento.<ol>
<li>Duplique a imagem selecionada e divida-a em três canais de cores (Vermelho-Cinza-Verde).</li>
			<li>Selecione o canal cinza (brightfield) e realize o aprimoramento do estiramento de contraste (CSE) para melhorar a separação entre diferentes áreas. Use o detector de bordas Sobel (SED) para executar a operação de convolução de processamento de sinal 2D já agrupada sob o comando Find Edge.</li>
			<li>Para filtragem dupla (F), aplique um desfoque gaussiano e filtro mediano para reduzir o ruído e suavizar o sinal do objeto. Converta-se em Máscara (CM) executando algoritmos de limiar adaptados para obter uma imagem binária (binário cinza) com pixels pretos (área celular) e pixels brancos (fundo). Skeletonize (Sk) a área celular em uma rede simples (NET) e filtra partículas (EP) em uma imagem NET removendo pequenas partículas não-em rede.</li>
			<li>Para canais vermelhos e verdes (núcleo e membrana), realize a dupla filtragem, converta-se em Máscara usando o método de limiar adaptado e permita que bin-green determine morfologia celular com o comando Analisar partículas.</li>
			<li>Mescle todos os canais usando sua região de interesse (ROI) com o operador OR (combine) e reajuste sua cor inicial em uma imagem RGB simples.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de motilidade unicelular(Figura 2Bii)<ol>
<li>Clique com o botão direito do mouse na ferramenta Rastreamento de Células Únicas para abrir a caixa de diálogo opções correspondentes e ajustar as configurações (por exemplo, tipo de trilha = núcleo ou membrana, limiar = triângulo, li, huang..., projeção Z = intensidade máxima, Fatias de Soma..., Desfoque gaussiano e filtros medianos = 1, 2, 3...) para produzir uma segmentação precisa de imagens. Em seguida, clique em OK.</li>
		<li>Clique à esquerda na ferramenta Rastreamento de células únicas para ativar automaticamente o seguinte procedimento.<ol>
<li>Remova o canal cinza. Aplique uma projeção Z na pilha, que gerará uma imagem correspondente a uma pilha de imagens de acordo com o tempo (T-stack). Filtro duplo e converta-se para Mascarar as trilhas deixadas pelas células. Remova pequenas partículas para a imagem BIN-vermelho/verde.</li>
			<li>Usando o ROI, selecione cada contorno do traço da célula e marque a caixa Pular a detecção de borda na caixa de diálogo Opções para pular esta etapa de pré-processamento para etapas subsequentes.</li>
			<li>
Isole o canal vermelho(tipo trilha = núcleo) na pilha original. Selecione um ROI e remova a área externa. Filtre todas as imagens e converta-se em Máscara (BIN-vermelho). Determine a posição centroide X/Y de cada núcleo binarizado.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando uma macro já publicada para o software de planilha13,calcule o deslocamento quadrado médio, a razão de direcionalidade e a velocidade média para esta célula.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de rastreamento de células múltiplas(Figura 2Biii)<ol>
<li>Clique com o botão direito do mouse na ferramenta Rastreamento para abrir a caixa de diálogo opções correspondentes e ajustar as configurações (por exemplo, Limiar = Triângulo, Li, Huang..., Desfoque gaussiano e filtros Mediana = 1, 2, 3...) para produzir uma segmentação precisa de imagens. Em seguida, clique em OK.</li>
		<li>Clique à esquerda na ferramenta Rastreamento para ativar automaticamente o seguinte procedimento.<ol>
<li>Remova o canal cinza.</li>
			<li>
Divida os canais vermelho e verde, filtro duplo e converta-se em Máscara. </li>
			<li>Mescle os canais usando a Calculadora de Imagens... comando com o operador E, deixando apenas o sinal do núcleo encontrado nas membranas. NOTA: Vários plugins em Fiji podem ser usados para determinar a posição X/Y de várias células nesta imagem pré-processada binária ao mesmo tempo (veja a Tabela de Materiais).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizando uma macro13descrita anteriormente, calcule o enredo de trajetória, deslocamento quadrado médio, razão de direcionalidade e velocidade média para essas células.</li>
	</ol></li>
	<li>Migração esferoide no tapete neural (Figura 2Biv)<ol>
<li>Clique com o botão direito do mouse na ferramenta Migração para abrir a caixa de diálogo opções correspondentes e ajustar as configurações (por exemplo, Limiar = Triângulo, Li, Huang..., Desfoque gaussiano e filtros Mediana = 1, 2, 3...) para produzir uma segmentação precisa de imagens. Em seguida, clique em OK.</li>
		<li>Clique à esquerda na ferramenta Migração para ativar automaticamente o seguinte procedimento.<ol>
<li>Remova o canal vermelho.</li>
			<li>
Divida os canais verde e cinza.</li>
			<li>Para o canal cinza, desenhe manualmente o contorno do tapete neuronal e meça sua área.</li>
			<li>Para o canal verde, filtre duas vezes a pilha e converta-se em Máscara. Remova a área fora do padrão (BIN) e determine a área da célula binarizada para cada imagem. NOTA: Os parâmetros descritos acima são calibrados alterando seus valores clicando à esquerda no ícone de interesse. Esse processamento pode ser feito manualmente. No entanto, para um grande número de imagens (aproximadamente cem por aquisições), canais (geralmente 3 canais) e etapas de processamento, uma ferramenta automatizada ou semi-automatizada seria preferível.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li>
<li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li>
<li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2FCXCR4+expression+in+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li>
<li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li>
<li>Boyé, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li>
<li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li>
<li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiprotein+Printing+by+Light%3FInduced+Molecular+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li>
<li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li>
<li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li>
<li>Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Advance+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li>
<li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Glioblastomas invadem extensivamente o parenchyma usando diferentes modos: co-opção de vasos sanguíneos circundantes, invasão intersticiacional ou invasão em WMTs18. Este último modo não é bem caracterizado na literatura devido à dificuldade em encontrar modelos in vitro ou in vivo adequados relacionados à invasão de WMT. Aqui, foi proposto um modelo simplificado no qual neurônios de roedores cultivados foram padronizados em superfícies revestidas de laminina, e células-tronco fl...

Gliomas malignos primários, incluindo GBMs, são tumores devastadores, com uma taxa média de sobrevivência de 12 a 15 meses relatada para pacientes com GBM. A terapia atual conta com grande ressecção de massa tumoral e quimioterapia aliada à radioterapia, que só aumenta a taxa de sobrevivência em poucos meses. As falhas terapêuticas estão intimamente relacionadas ao mau fornecimento de drogas através da barreira hematoencefálica (BBB) e ao crescimento invasivo em espaços perivasculares, meninges e ao longo das OTN1. A invasão perivascular, também chamada de co-opção vascular, é um processo bem estudado, e os mecanismos moleculares estão começando a ser elucidados; no entanto, o processo de invasão de células GBM ao longo de WMTs não é bem compreendido. As células tumorais migram para o cérebro saudável ao longo das estruturas secundárias de Scherer2. De fato, há quase um século, Hans-Joachim Scherer descreveu as rotas invasivas do GBM, que agora são referidas como satellitose perineuronal, satellitose perivascular, propagação subpial e invasão ao longo do WMT (Figura 1A).
Algumas quimiocinas e seus receptores, como o fator de crescimento estroboma derivado de células estromal 1α (SDF1α) e c-X-C, o receptor de quimioterapia 4 (CXCR4), mas não o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), parecem estar implicados na invasão do TNM3. Mais recentemente, um eixo TRANScelular NOTCH1-SOX2 mostrou-se um importante caminho na invasão de WMT de células GBM4. Os autores descreveram como células-tronco GBM invadem o parênquim cerebral em neurônios parcialmente nãoomiados, sugerindo a destruição de baias de mielina por células GBM. Um marco foi alcançado em 2019, quando três artigos foram publicados de forma consecutiva na revista Nature, destacando o papel da atividade elétrica no desenvolvimento do glioma5,6. O trabalho seminal de Monje e colaboradores lançou luz sobre o papel central da atividade elétrica na secreção da neuroligina-3, que promove o desenvolvimento do glioma.
Winkler e colaboradores descreveram as conexões entre as células GBM (microtubos) sendo cruciais em etapas invasivas e, ultimamente, interações entre células GBM e neurônios através de sinapses neuroglioma recém-descritas. Essas estruturas favorecem a estimulação glutamatergica de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA) localizados na membrana celular GBM, que promove o desenvolvimento e invasão do tumor. A invasão de células tumorais é um processo central na disseminação de metástases ou focos secundários distantes, como observado em pacientes com GBM. Vários fatores foram identificados como importantes na invasão do GBM, como o trombospondina-1, um fator de crescimento transformador beta (proteína matricellular regulada por TGFβ, ou o receptor de quimioterapia CXCR3)7,8.
Aqui, um modelo biomimético simplificado foi descrito para estudar a invasão gbm, em que os neurônios são padronizados em trilhas de laminina, e as células GBM são semeadas sobre ele, como células únicas ou como esferoides(Figura 1B). As duas configurações experimentais visam recapitular a invasão sobre neurônios, o que é observado em GBM9,10,11. Tais modelos foram desenvolvidos no passado como biomateriais de nanofibra alinhados (eletropinning de conchas centrais) que permitem estudar a migração celular através da modulação de propriedades mecânicas ou químicas12. O modelo de cocultura descrito neste artigo permite uma melhor compreensão de como as células GBM escapam nos neurônios definindo novas vias moleculares envolvidas nesse processo.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil) trietoxissilano</td><td>Sigma</td><td>440140-100ML</td><td>O grupo amino é útil para a bioconjugação da</td>placa de</tr><tr><td>fundo redondo de 96 poços</td> mPEG-SVA <td>Sarstedt</td><td>2582624</td><td>Usado para preparar esferoides</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Armazenado a -20 &deg; C (longo prazo) ou 4 &graus; C (curto prazo), enzima de dissociação de esfera</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Armazenado a -20 &deg; C, descongele antes de usar</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Básico de Fibroblastos</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Armazenado a -20 &deg; C, descongele antes</td></tr><tr><td>de usar Countess Cell Counting ChamberSlides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Usado para contagem de células</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Marienfeld</td><td>111580</td><td>Substrato de cultura de células</td></tr><tr><td>Cartuchos dessecadores</td><td>Sigma</td><td>Z363456-6EA</td><td>Usado para reduzir a umidade durante o tratamento com (3-aminopropil) trietoxisilano</td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Armazenado em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Software Fiji, MTrack2 macro</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Usado para analisar imagens</td></tr><tr><td>Flask 75 cm&sup2;</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Laminina</td><td></td><td>114956-81-9</td><td>Promove a adesão neuronal</td></tr><tr><td>Carregamento do software</td><td></td><td></td> Leonardo <td>de micropadrões previstos</td></tr><tr><td>Software MetaMorph&nbsp;</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>NA</td><td>Software de automação de microscopia</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Diluído em NBM para uma concentração final de 2%</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td><td></td><td></td> <td>microscópio invertido equipado com um palco motorizado&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina - Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>PLPP</td><td>Alveole</td><td>PLPPclassic_1ml</td><td>Fotoiniciador usado para degradar a escova PEG</td></tr><tr><td>Poli (etilenoglicol) -Succinimidil Valerato (mPEG-SVA)</td> <td>Laysan Bio</td><td>VA-PEG-VA-5000-5g</td><td>Usado como revestimento anti-incrustante</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alveole</td><td>PRIMO1</td><td>Aparelho de projeção UV baseado em dispositivo de microespelho digital (DMD)</td></tr><tr><td>Azul de tripano 0,4%</td> <td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Usado para contagem de células</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td>Usado para separar células aderentes</td></tr></tbody></table>

co-cultura de células-tronco semelhantes ao glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Glioblastomas (GBMs), gliomas malignos de grau IV, são um dos tipos mais mortais de câncer humano por causa de suas características agressivas. Apesar dos avanços significativos na genética desses tumores, como as células GBM invadem o parenchyma cerebral saudável não é bem compreendida. Notavelmente, foi demonstrado que as células GBM invadem o espaço peritumoral através de diferentes rotas; o principal interesse deste artigo é a rota ao longo de tratos de matéria branca (WMTs). As interações das células tumorais com os componentes das células nervosas peritumorais não são bem caracterizadas. Aqui, foi descrito um método que avalia o impacto dos neurônios na invasão celular GBM. Este artigo apresenta um ensaio avançado de cocultura in vitro que imita a invasão de WMT analisando a migração de células-tronco GBM em neurônios. O comportamento das células GBM na presença de neurônios é monitorado usando um procedimento de rastreamento automatizado com software de código aberto e de acesso livre. Este método é útil para muitas aplicações, em particular, para estudos funcionais e mecanicistas, bem como para analisar os efeitos de agentes farmacológicos que podem bloquear a migração celular GBM em neurônios.

Neurônios padronizados co-cultivados com células GBM fluorescentes foram preparados como descrito na seção de protocolo, e experimentos de rastreamento foram realizados. As células GBM modificaram rapidamente sua forma enquanto migravam nos neurônios(Figura 1B: painel 6 e vídeo 1). As células migraram ao longo das extensões neuronais, em um movimento aleatório(Vídeo 1). Células GBM fluorescentes e neurônios não fluorescentes podem ser facilm...

Aqui, apresentamos um ensaio de cocultura fácil de usar para analisar a migração de glioblastoma (GBM) em neurônios padronizados. Desenvolvemos uma macro no software FiJi para fácil quantificação da migração celular GBM em neurônios, e observamos que os neurônios modificam a capacidade invasiva celular GBM.

Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastomas são tumores cerebrais devastadores com alto perfil invasivo. Este sistema de cocultura imita a migração de células glioblastoma em neurônios para recapitular uma das rotas invasivas observadas em pacientes. A geometria e composição do nosso modelo de co-cultura é precisamente controlada.Facilita uma melhor reprodutibilidade e também uma quantificação direta de processos biológicos complexos. Este método pode ser adaptado ao diagnóstico clínico por co-cultivo de células e neurônios de glioblastoma recém-dissociados. Define um índice clínico, que é muito importante como desfecho clínico.Nosso método também pode ser usado para quantificar outras células migratórias, como fibroblastos ou células imunes. Demonstrando o procedimento será Joris Guyon, um estudante de doutorado da minha equipe. Para fazer um substrato para o micropatterning, trate as tampas de vidro circular de 18 milímetros por ativação de ar ou plasma por cinco minutos antes de colocar as tampas em um dessecador com 100 microlitres de trietoxisilano por uma hora e, em seguida, incubar uma solução de PEG-SVA a 100 mililitos por mililitro por uma hora.Para deposição de gel, no final da incubação, adicione trê

co-culture-glioblastoma-stem-like-cells-on-patterned-neurons-to-study

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um dispositivo de microfluidos para a investigação de compartimentalizar cancro migração de células estaminais é descrito. Esta plataforma inovadora cria um microambiente viável celular e permite a visualização microscópica de locomoção de células vivas. Altamente móveis células cancerosas são isolados para estudar os mecanismos moleculares de infiltração agressiva, levando potencialmente a terapias mais eficazes no futuro.

Avaliação do Câncer de Migração Stem Cell Usando compartimentar dispositivos microfluídicos e imagens de células vivas

Este vídeo descreve um ensaio de co-cultura de células de glioblastoma em neurônios micropadronizados, que imitam a invasão do trato neuronal mielinizado pelas células-tronco semelhantes a glioblastoma à medida que migram em neurônios nos espaços peritumorais. Este ensaio pode ajudar a analisar os efeitos de drogas farmacológicas que inibem a migração das células de glioblastoma nos neurônios de um glioma.

Co-cultura de células de glioblastoma em neurônios padronizados: uma técnica para monitorar a migração de células de glioblastoma em neurônios do hipocampo de ratos in vitro

A co-cultura de fatia cerebral organotípicas com células de carcinoma permite visualizar as alterações morfológicas por fluorescência, bem como o campo brilhante (vídeo) microscopia durante o processo de invasão de células de carcinoma de tecido cerebral. Este modelo de sistema também permite abordagens taxas de célula e de reabastecimento e oferece uma ampla variedade de manipulações e análises.

Sistema de co-cultura com uma fatia organotípicas Cérebro e esferóide 3D de carcinomas de células

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Os modelos atuais ex vivo de glioblastoma (GBM) não são otimizados para o estudo fisiologicamente relevante da invasão de tumores humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para geração e manutenção de culturas de fatia organotípicas a partir de tecido GBM humano fresco. É fornecida uma descrição da microscopia por lapso de tempo e técnicas quantitativas de análise de migração celular.

Um modelo de cultura de fatia organotipica de glioblastoma humano para estudo de migração de células tumorais e efeitos específicos de pacientes de drogas anti-invasivas

Compreender o comportamento maligno do câncer requer a criação de modelos precisos de como as células tumorais interagem com componentes do microambiente tumoral, como macrófagos. Aqui descrevemos dois métodos para estudar a interação das células de glioblastoma com macrófagos associados a tumores e micróglia, onde o efeito na invasão do glioblastoma é avaliado.

Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

Aqui, descrevemos técnicas de imagem ao vivo-celular para medir quantitativamente a migração e invasão de células-tronco tumor glioblastoma cerebral ao longo do tempo e sob várias condições de tratamento.

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Aqui apresentamos um sistema de cultura monocamada mista ex-vivo para o estudo da migração de células glioma humanas (hGC) em tempo real. Este modelo fornece a capacidade de observar interações entre hGCs e axônios mielinated e não-myelinated dentro de uma câmara compartimentada.

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Aprenda a analisar a migração de células de glioblastoma em neurônios padronizados usando um sistema de co-cultura reprodutível. Este método permite quantificar a capacidade invasiva tumoral com potencial aplicação clínica.

Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

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