Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.
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Artigo de método
Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células T (iNKT) invariantes são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células T semi-invariante (TCR) conservado específico para antígenos lipídicos auto ou microbianos apresentados pela molécula não polimórfica relacionada ao MHC CD1d. Estudos pré-clínicos e clínicos apoiam um papel para células iNKT em câncer, autoimunidade e doenças infecciosas. As células iNKT são muito conservadas em todas as espécies e sua investigação foi facilitada por modelos de camundongos, incluindo camundongos deficientes de CD1d ou deficientes em INKT, e a possibilidade de detectá-las inequivocamente em camundongos e homens com tetramers CD1d ou mAbs específicos para o TCR semi-invariante. No entanto, as células iNKT são raras e precisam ser expandidas para alcançar números gerenciáveis para qualquer estudo. Como a geração da linha celular iNKT primária do mouse in vitro tem se mostrado difícil, criamos um protocolo robusto para purificar e expandir células iNKT esplênicas a partir dos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg), nos quais as células iNKT são 30 vezes mais frequentes. Mostramos aqui que as células iVα14Tg iNKT primárias podem ser enriquecidas através de um processo de separação imunomagnética, produzindo cerca de 95-98% de células iNKT puras. As células iNKT purificadas são estimuladas por contas anti-CD3/CD28 mais IL-2 e IL-7, resultando em expansão de 30 vezes até o dia +14 da cultura com 85-99% de pureza. As células iNKT expandidas podem ser facilmente manipuladas geneticamente, fornecendo uma ferramenta inestimável para dissecar mecanismos de ativação e função in vitro e, mais importante, também após transferência adotiva in vivo.
Introdução
Invariantes Células T assassinas naturais (células iNKT) são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células αβ T semi-invariante (TCR), formado em camundongos por uma cadeia vα14-Jα18 inata emparelhada com um conjunto limitado de diversas cadeias Vβ1, que é específica para antígenos lipídicos apresentados pela molécula de classe I da MHC CD1d2. as células iNKT passam por um programa de seleção agonista, resultando na aquisição de um fenótipo ativado/inato do efeito ou do tímumo, que ocorre através de várias etapas de maturação3,4, produzindo um cd4....
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Protocolo
Os procedimentos aqui descritos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) (nº 1048) do Instituto Científico de San Raffaele.
NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis. Todos os reagentes utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Processamento de baço
- Eutanize os camundongos iVα14-Jα18 por inalação de CO2 de acordo com a política institucional.
NOTA: os camundongos iVα14-Jα18 devem ter 8 semanas ou mais. Para evitar a rejeição das células da transferência in vivo das células, considere ....
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Resultados
O protocolo descrito neste manuscrito permite enriquecer células iNKT do baço de camundongos transgênicos iVa14-Ja18 através de um processo de separação imunomagnética resumido na Figura 1A. As células T do baço total são primeiramente selecionadas negativamente pelo esgotamento das células B e monócitos, seguidas pela classificação imunomagnética positiva da célula iNKT com tetramers CD1d carregados de antígeno lipídico PBS-57, que permitem manchar especificamente apenas células iNKT. Este .......
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Discussão
Aqui mostramos um protocolo reprodutível e viável para obter milhões de células iNKT prontas para uso. Devido à escassez dessas células in vivo, um método para expandi-las era altamente necessário. O protocolo que propomos não requer uma instrumentação específica nem um alto número de ratos. Exploramos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 de propósito para reduzir o número de camundongos necessários para o procedimento.
Outro protocolo bem sucedido para expansão celular iNKT a partir de camundo.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a Paolo Dellabona e Giulia Casorati pelo apoio científico e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também ao NIH Tetramer Core Facility pelo tetramer CD1d do mouse. O estudo foi financiado pela fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (para m.F.) e associação italiana de pesquisa do câncer (AIRC) bolsa 2019-22604 (para G.D.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de cloreto de amônio-potássio (ACK) | em casa | 0,15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0,1mM EDTA, pH 7,2-7,4 | |
| microesferas anti-FITC | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| microesferas anti-PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetrâmero -PE | NIH tetrâmero core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetrâmeros | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend clone 100528 | RM4-5 | |
| Fc bloqueador | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | inativado por calor e filtrado .22 antes do uso |
| Tampão de coloração do fator de transcrição FOXP3 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomicina | Sigma | I0634 | |
| LD Colunas | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Colunas | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Tampão MACS (MB) | em casa | 0,5% de albumina de soro bovino (BSA; Sigma-Aldrich) e 2Mm EDTA | |
| MS Colunas | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Aminoácidos não essenciais | Gibco | 11140-035 | |
| Penicilina e estreptomicina (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Fosfato tamponado Salino (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Filtros de Pré-Separação (30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Rato Recombinante IL-7 | R & D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 com glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| piruvato de sódio | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| α CD3CD28 ativador T de camundongo Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoetanol | Gibco | 31350010 |
Referências
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. <....
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Reimpressões e permissões
