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Artigo de método

Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo

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DOI:

10.3791/62214

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15 de fevereiro de 2021

 ,  ,  , 
1Experimental Immunology Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.

Resumo

As células T (iNKT) invariantes são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células T semi-invariante (TCR) conservado específico para antígenos lipídicos auto ou microbianos apresentados pela molécula não polimórfica relacionada ao MHC CD1d. Estudos pré-clínicos e clínicos apoiam um papel para células iNKT em câncer, autoimunidade e doenças infecciosas. As células iNKT são muito conservadas em todas as espécies e sua investigação foi facilitada por modelos de camundongos, incluindo camundongos deficientes de CD1d ou deficientes em INKT, e a possibilidade de detectá-las inequivocamente em camundongos e homens com tetramers CD1d ou mAbs específicos para o TCR semi-invariante. No entanto, as células iNKT são raras e precisam ser expandidas para alcançar números gerenciáveis para qualquer estudo. Como a geração da linha celular iNKT primária do mouse in vitro tem se mostrado difícil, criamos um protocolo robusto para purificar e expandir células iNKT esplênicas a partir dos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg), nos quais as células iNKT são 30 vezes mais frequentes. Mostramos aqui que as células iVα14Tg iNKT primárias podem ser enriquecidas através de um processo de separação imunomagnética, produzindo cerca de 95-98% de células iNKT puras. As células iNKT purificadas são estimuladas por contas anti-CD3/CD28 mais IL-2 e IL-7, resultando em expansão de 30 vezes até o dia +14 da cultura com 85-99% de pureza. As células iNKT expandidas podem ser facilmente manipuladas geneticamente, fornecendo uma ferramenta inestimável para dissecar mecanismos de ativação e função in vitro e, mais importante, também após transferência adotiva in vivo.

Introdução

Invariantes Células T assassinas naturais (células iNKT) são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células αβ T semi-invariante (TCR), formado em camundongos por uma cadeia vα14-Jα18 inata emparelhada com um conjunto limitado de diversas cadeias Vβ1, que é específica para antígenos lipídicos apresentados pela molécula de classe I da MHC CD1d2. as células iNKT passam por um programa de seleção agonista, resultando na aquisição de um fenótipo ativado/inato do efeito ou do tímumo, que ocorre através de várias etapas de maturação3,4, produzindo um cd4+ e um subconjunto CD4. Através deste programa, as células iNKT adquirem fenótipos de efeito t (TH) distintos, ou seja, TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) e TH17 (iNKT17), identificáveis pela expressão dos fatores de transcrição T-bet, GATA3, PLZF e RORγt,respectivamente 5. As células iNKT reconhecem uma gama de lipídios microbianos, mas também são auto-reativas contra lipídios endógenos que são regulados no contexto de situações patológicas de estresse celular e danos teciduais, como câncer e autoimunidade2. Após a ativação, as células iNKT modulam as funções de outras células inatas e adaptativas do efeito imunológico através do contato direto e da produção de citocinas2.

As investigações das células iNKT foram facilitadas por modelos de camundongos, incluindo camundongos deficientes de CD1d ou Jα18 deficientes, e pela produção de tetramers CD1d carregados de antígeno mais a geração de anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para o TCR semi-invariante humano. No entanto, a geração da linha celular iNKT do mouse primário tem se mostrado difícil. Para caracterizar melhor as funções antitumorais das células iNKT e utilizá-las para a terapia celular adotiva, criamos um protocolo para purificar e expandir células esfécnicas iNKT de camundongos transgênicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, em que as células iNKT são 30 vezes mais frequentes do que em camundongos do tipo selvagem.

Células iNKT expandidas podem ser exploradas para ensaios in vitro, e in vivo após transferência de volta para camundongos. Neste cenário, por exemplo, mostramos seus potentes efeitos anti-tumor7. Além disso, as células iNKT expandidas in vitro são favoráveis à modificação funcional via transferência ou edição de genes antes de sua injeção in vivo8, permitindo uma análise funcional perspicaz das vias moleculares, bem como abrindo caminho para terapias celulares avançadas.

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Protocolo

Os procedimentos aqui descritos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) (nº 1048) do Instituto Científico de San Raffaele.

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis. Todos os reagentes utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Processamento de baço

  1. Eutanize os camundongos iVα14-Jα18 por inalação de CO2 de acordo com a política institucional.
    NOTA: os camundongos iVα14-Jα18 devem ter 8 semanas ou mais. Para evitar a rejeição das células da transferência in vivo das células, considere que as células isoladas de camundongos fêmeas podem ser transferidas de forma adotiva tanto em receptores masculinos quanto femininos, enquanto as células isoladas de camundongos machos só podem ser transferidas em receptores masculinos. Para experimentos in vitro, nenhum viés de gênero deve ser considerado. Mais camundongos podem ser agrupados para obter mais células.
  2. Disseca o baço do rato e esmague-o através de um coador de células de 70 nm para obter uma suspensão unicelular em 10 mL de soro salino tamponado fosfato (PBS) com 2% de soro bovino fetal (FBS).
  3. Centrifugar a 300 x g por 5 min.
  4. Remova o supernatante por inversão e processe com tampão de lise eritrócito. Resuspenque a pelota celular com 1 mL de ACK (Amônio-Cloreto-Potássio) Tampão de lise, incubar por 3 minutos à temperatura ambiente e bloquear com 5 mL de PBS com 2% de FBS. Centrifugar a 300 x g por 5 min.
    NOTA: A ACK está disponível comercialmente; consiste em uma solução de 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3e 0,1 mM Na2EDTA (ácido etilenodiaminetetraacético) dissolvido em H2O bidistilled, pH 7.2-7.4. Se for caseiro, esterilize por filtragem com um filtro de 0,22 μm.
  5. Remova o supernatante por inversão. Resuspense a pelota celular em 3 mL de PBS com 2% de FBS e remova resíduos de gordura por pipetação. Se necessário, acumule as células provenientes de diferentes camundongos.
  6. Conte as células e mantenha 50 μL para análise facs.

2. Enriquecimento celular T

NOTA: Para os passos de enriquecimento, trabalhe rápido, mantenha as células frias e use soluções pré-refresadas a 4 °C durante a noite e depois mantidas no gelo

  1. Centrifugar a 300 x g por 5 min.
  2. Resuspende todas as células na quantidade apropriada de PBS com 2% de FBS (500 μL para 107 células) e bloqueador de Fc (2,5 μL x 107 células); incubar por 15 min a temperatura ambiente (RT).
  3. Lave com 1-2 mL de tampão de separação MACS (MB) por 107 células totais e centrífuga a 300 x g por 10 min.
    NOTA: O buffer MACS está disponível comercialmente. É composto por PBS pH 7.2, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM EDTA. Se for caseiro, esterilize por filtragem com um filtro de 0,22 μm.
  4. Remova o supernatante por inversão e colora as células com CD19-FITC e H2(IAb)-FITC (use 5 μL x 107 células em 100 μL de MB). Misture bem e incubar por 15 min no escuro a 4-8 °C.
  5. Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.
  6. Pipeta fora do supernante completamente e resuspensar a pelota celular em 90 μL de MB por 107 células totais. Adicione 10 μL de MicroEsferas Anti-FITC por 107 células totais. Misture bem e incubar por 15 min no escuro a 4-8 °C.
  7. Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.
  8. Pipeta fora do supernasceto completamente e resuspend até 1,25 x 108 células em 500 μL de MB.
  9. Coloque uma coluna LD no campo magnético do separador MACS para prosseguir com o esgotamento. Para evitar entupimento, aplique um filtro de pré-separação na coluna LD e enxágue com 2 mL de MB.
  10. Quando o reservatório da coluna estiver vazio, aplique a suspensão da célula no filtro. Colete as células sem rótulo que passam pela coluna.
  11. Lave 3 vezes com 1 mL de MB, somente quando o reservatório da coluna estiver vazio. Recolhe o efluente total, que será enriquecido em células T, e conte as células. Mantenha sempre 50 μL para análise FACS.

3. enriquecimento celular iNKT

  1. Centrifugar a 300 x g por 5 min e remover o supernatante por inversão.
  2. Colorisse as células com CD1d-tetramer-PE (mouse PBS57-CD1d-tetramer), de acordo com a titulação de anticorpos em 50 μL de MB por 106 células. Misture bem e incubar por 30 minutos no escuro no gelo.
    NOTA: O procedimento também pode ser realizado com tetramers mCD1d rotulados pela APC e contas anti-APC; ajustando os fluorochromes utilizados nas seguintes manchas em conformidade. No presente protocolo, utilizamos mouse PBS-57-CD1d-tetramers fornecidos pelo NIH. αgalactosylceramida (αGal-Cer) é o antígeno prototípico reconhecido pelas células iNKT; PBS-57 é um análogo de αGal-Cer com solubilidade melhorada9; a NiH Tetramer Facility fornece ligantes PBS-57 complexos para tetramers CD1d. No entanto, outros dimers CD1d/tetramers/dextramers estão comercialmente disponíveis e podem ser carregados com um antígeno lipídico como αGal-Cer. Prevemos a possibilidade de ajustar o protocolo para seu uso.
  3. Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.
  4. Pipeta fora do supernante completamente e resuspensar a pelota celular em 80 μL de MB por 107 células totais. Adicione 20 μL de MicroEsferas Anti-PE por 107 células totais. Misture bem e incubar por 15 min no escuro a 4-8 °C.
  5. Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.
  6. Pipeta fora do supernasceto completamente e resuspend até 108 células em 500 μL de MB. Caso contrário, se as células excederem10 8,ajuste o volume de acordo.
  7. De acordo com a contagem de células, coloque uma coluna LS (até 108) ou MS (até 107) no campo magnético do separador MACS. Enxágüe a coluna com MB (3 mL para LS, 500 μL para MS).
  8. Aplique a suspensão do celular na coluna.
  9. Colete células sem rótulo que passam. Lave a coluna 3 vezes adicionando a quantidade apropriada de MB (3 x 3 mL para a coluna LS, 3 x 500 μL para coluna MS) somente quando o reservatório da coluna estiver vazio. O efluente total é a fração negativa.
  10. Remova a coluna do campo magnético e coloque-a em um novo tubo de coleta.
  11. Pipeta MB na coluna (5 mL para coluna LS ou 1 mL para coluna MS); empurre o êmbolo fornecido para dentro da coluna e limpe a fração positiva (enriquecida em células iNKT).
  12. Para aumentar ainda mais a recuperação da célula iNKT, centrifugar a fração negativa em 300 x g por 10 min e repetir passos 3.6-3.7 com uma nova coluna LS ou MS. Acumule as frações positivas e determine a contagem de células. Mantenha 50 μL de frações positivas e negativas para análise FACS.
  13. Verifique as etapas de Purificação pela análise FACS. As amostras incluem: ex-vivo do baço, fração enriquecida com células T, fração positiva iNKT e fração negativa iNKT. Colorique as células com: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC e DAPI.
    NOTA: A recuperação esperada de um mouse iVα14-Jα18 é de células 2x106 iNKT .

4. ativação e expansão de células iNKT

  1. Ative células magnéticas iNKT purificadas com o ativador T do mouse anti-CD3/CD28 em uma proporção de 1:1.
    1. Centrifugar a fração positiva da célula iNKT a 300 x g por 5 min.
    2. Enquanto isso, transfira o volume apropriado de contas magnéticas anti-CD3/CD28 para um tubo e adicione um volume igual de PBS, vórtice por 5 segundos. Coloque o tubo em um ímã por 1 minuto e descarte o supernatante.
    3. Remova o tubo do ímã e resuspenque as contas magnéticas lavadas no volume adequado de RPMI completo (meio RPMI 1640, FCS inativado por calor de 10%, 1 mM piruvato de sódio, 1% aminoácidos não essenciais, penicílina de 10 U/ml e estreptomicina, 50 μM β-Mercaptoethanol) para ter 5 x 105 células iNKT em 1 mL. Use esta suspensão para resuspensar a fração positiva iNKT centrifusada.
  2. Placa 1 mL da suspensão celular (5 x 10células iNKT) e contas magnéticas anti-CD3/CD28 em uma placa de 48 poços com 20 U/mL IL-2 e incubar a 37 °C.
  3. Após 5 dias, adicione 10 ng/mL IL-7.
  4. Divida as células 1:2 quando atingirem 80-90% de confluência, adicione sempre 20U/mL IL-2 e 10 ng/mL IL-7. Nessas condições, as células iNKT podem ser expandidas por até 15 dias.

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Resultados

O protocolo descrito neste manuscrito permite enriquecer células iNKT do baço de camundongos transgênicos iVa14-Ja18 através de um processo de separação imunomagnética resumido na Figura 1A. As células T do baço total são primeiramente selecionadas negativamente pelo esgotamento das células B e monócitos, seguidas pela classificação imunomagnética positiva da célula iNKT com tetramers CD1d carregados de antígeno lipídico PBS-57, que permitem manchar especificamente apenas células iNKT. Este ...

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Discussão

Aqui mostramos um protocolo reprodutível e viável para obter milhões de células iNKT prontas para uso. Devido à escassez dessas células in vivo, um método para expandi-las era altamente necessário. O protocolo que propomos não requer uma instrumentação específica nem um alto número de ratos. Exploramos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 de propósito para reduzir o número de camundongos necessários para o procedimento.

Outro protocolo bem sucedido para expansão celular iNKT a partir de camundo...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Paolo Dellabona e Giulia Casorati pelo apoio científico e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também ao NIH Tetramer Core Facility pelo tetramer CD1d do mouse. O estudo foi financiado pela fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (para m.F.) e associação italiana de pesquisa do câncer (AIRC) bolsa 2019-22604 (para G.D.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de cloreto de amônio-potássio (ACK)em casa0,15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0,1mM EDTA, pH 7,2-7,4
microesferas anti-FITCMiltenyi Biotec130-048-701
microesferas anti-PEMiltenyi Biotec130-048-801
Brefeldin ASigmaB6542
CD19 -FITCBiolegend115506clone 6D5
CD1d-tetrâmero -PENIH tetrâmero core facilitymouse PBS57-Cd1d-tetrâmeros
CD4 -PeCy7Biolegend clone 100528RM4-5
Fc bloqueadorBD Bioscience553142
Fetal Bovine Serum (FBS)EurocloneECS0186Linativado por calor e filtrado .22 antes do uso
Tampão de coloração do fator de transcrição FOXP3eBioscience00-5523-00
H2 (IAb) -FITCBiolegend114406clone AF6-120.1
hrIL-2Chiron Corp
IonomicinaSigmaI0634
LD ColunasMiltenyi Biotec130-042-901
LS ColunasMiltenyi Biotec130-042-401
Tampão MACS (MB)em casa0,5% de albumina de soro bovino (BSA; Sigma-Aldrich) e 2Mm EDTA
MS ColunasMiltenyi Biotec130-042-201
Aminoácidos não essenciaisGibco11140-035
Penicilina e estreptomicina (Pen-Strep)Lonza15140-122
PermWashBD Bioscience51-2091KZ
PFASigmaP6148
Fosfato tamponado Salino (PBS)EuroCloneECB4004L
PMASigmaP1585
Filtros de Pré-Separação (30 µ m)Miltenyi Biotec130-041-407
Rato Recombinante IL-7R & D System407-ML-025
RPMI 1640 com glutamaxGibco61870-010
piruvato de sódioGibco11360-039
TCRβ -APCBiolegend109212clone H57-597
α CD3CD28 ativador T de camundongo DynabeadsGibco11452D
β-mercaptoetanolGibco31350010

Referências

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