Este protocolo fornece orientação detalhada para a ação de aotransplante geracional inicial e contínua de tumores de Drosophila no abdômen de hospedeiros adultos para estudar vários aspectos da neoplasia. Usando um aparelho autoinjetor, os pesquisadores podem obter melhor eficiência e rendimentos tumorais em comparação com os alcançados pelos métodos tradicionais e manuais.
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Artigo de método
Loteamento tumoral em Drosophila melanogaster com um Injetor Auto-Nanoliter Programável
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve a aotransplantação de tumores em Drosophila melanogaster usando um aparelho de injeção de auto-nanolitera. Com o uso de um aparelho autoinjetor, operadores treinados podem obter resultados de transplante mais eficientes e consistentes em comparação com aqueles obtidos usando um injetor manual. Aqui, abordamos temas de forma cronológica: desde o cruzamento das linhas de Drosophila , até a indução e dissecação do tumor primário, o transplante do tumor primário em um novo hospedeiro adulto e o transplante geracional contínuo do tumor para estudos prolongados. Como demonstração, aqui usamos o domínio intracelular notch (NICD) sobreexpressão induzida tumores de anel de glândula salivar imaginária para transplante geracional. Esses tumores podem primeiro ser induzidos de forma confiável em um microambiente de zona de transição dentro de anéis imaginários da glândula salivar larval, depois alusorados e cultivados in vivo para estudar o crescimento contínuo do tumor, evolução e metástase. Este método de aotransplante pode ser útil em programas potenciais de triagem de medicamentos, bem como para estudar interações tumorais-hospedeiros.
Introdução
Este protocolo fornece uma orientação passo-a-passo para a ação da glândula salivar larval Drosophila (SG) tumores imagináveis de anel em abdômens de hospedeiros adultos usando um aparelho de injeção de auto-nanolitera (por exemplo, Nanoject). Este protocolo também fornece instruções para o subsequente re-alusão de tumores em novas gerações de hospedeiros adultos, o que oferece oportunidades para o estudo longitudinal contínuo das características tumorais, como evolução tumoral e interações tumorais-hospedeiros. O protocolo também pode ser aplicado para experimentos de triagem de drogas.
Este método foi desenvolvido para melhorar a....
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Protocolo
1. Preparação do tumor do anel imaginário de SG
- Moscas adultas cruzadas com genótipos de UAS-NICD (Masculino: 10-15 moscas) e Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (Fêmea Virgem: 10-15 moscas) e permitem que elas se reproduzam por 1 dia a 18 °C. As moscas adultas selecionadas devem ter de 5 a 9 dias para garantir alta fertilidade.
- Permita que as moscas adultas coloquem ovos nos alimentos de mosca contidos em frascos por 24 h a 18 °C e, em seguida, remova as moscas adultas.
NOTA: A comida fly é preparada usando a receita padrão de alimentos de fubá do Drosophila Stock Center8. Cada frasc....
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Resultados
Aqui, realizamos a alocagem de gerações de tumores de anel imaginável SG usando o aparelho autoinjetor de injeção de nanoliter e conduzimos imagens subsequentes de tumores com um microscópio de varredura a laser confocal, o que permitiu um mergulho mais profundo em tópicos de crescimento tumoral, migração de células tumorais e interações tumorais-hospedeiros. Ao montar moscas, cole-as a um slide de microscópio e contê-as através de um bloco de polidimtilatilasiloxano (PDMS)bloco 11.
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Discussão
A aotransplantação tumoral pode ajudar os pesquisadores a resolver certos problemas que surgem durante o crescimento e progressão do tumor de Drosophila. Um desses desafios é a evasão de mortes prematuras de larvas tumorais ou adultos durante a cultura do tumor primário12. Nesse contexto, a aotransplante tumoral contínua permite que os tumores cresçam indefinidamente, o que facilita estudos longitudinais de crescimento tumoral, metástase e evolução. A aotransplante tumoral também é útil p.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse para declarar entre os autores.
Agradecimentos
Agradecemos aos ex-membros do laboratório Dr. Sheng-An Yang e Sr. Juan-Martin Portilla por sua contribuição no desenvolvimento deste protocolo. Somos gratos pelo laboratório do Dr. Yan Song na Escola de Ciências da Vida da Universidade de Pequim por compartilhar seu protocolo sobre a locotraplantação manual. Agradecemos também ao Sr. Calder Ellsworth e ao Sr. Everest Shapiro pela leitura crítica do manuscrito.
A ADM recebeu financiamento (GM072562, CA224381, CA227789) para este trabalho do Instituto Nacional de Saúde (https://www.nih.gov/) e financiamento (IOS-155790) da Fundação Nacional de Ciência (htps://nsf.gov/). Os financiadores não t....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio de Varredura a Laser Confocal | Zeiss | LSM 980 | Também conhecido como "Zeiss LSM 980" |
| Alimento para Moscas de Fubá | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Também conhecido como "Alimento Padrão BDSC para Fubá"Agulha |
| Dissecção (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Placa de Dissecção | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Adaptador de Fluorescência para Microscópio Stero | Microscopia Eletrônica Ciências | SFA-UV | Também conhecido como "Adaptador de Fluorescência NightSea" |
| Microscópio de Fluorescência | Zeiss | 495015-0001-000 | Também conhecido como "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Fórceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Também conhecido como "Fórceps Dumont #5" |
| Capilar de Vidro (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Cola | Elmer | E305 | Também conhecido como "Elmer Washabale Clear Glue"Light |
| Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Também conhecido como "Zeiss Stemi 305"Extrator |
| Micropipetas | World Precision Instruments | PUL-1000 | Também conhecido como "Extrator de Micropipetas de Quatro Passos" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Também conhecido como "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Seringa (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
Referências
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem....
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Reimpressões e permissões
