Descrevemos um protocolo para monitorar mudanças na atividade de neurônios diferentes durante comandos motores em um sistema de células ciliadas vertebrados modelo.
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Artigo de método
Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
Sistemas sensoriais reúnem pistas essenciais para o direcionamento do comportamento, mas os animais devem decifrar quais informações são biologicamente relevantes. A locomoção gera sinais reafemináveis de que os animais devem se desembaraçar de pistas sensoriais relevantes do ambiente circundante. Por exemplo, quando um peixe nada, o fluxo gerado a partir de ondulações corporais é detectado pelos neuromasts mecanorreceptivos, compreendendo células ciliar, que compõem o sistema de linha lateral. As células ciliares então transmitem informações de movimento fluido do sensor para o cérebro através dos neurônios sensoriais diferentes. Simultaneamente, a descarga corolária do comando motor é transmitida para as células ciliadas para evitar sobrecarga sensorial. A contabilização do efeito inibidor dos sinais motores preditivos durante a locomoção é, portanto, crítica ao avaliar a sensibilidade do sistema de linha lateral. Desenvolvemos uma abordagem eletrofisiológica in vivo para monitorar simultaneamente a linha lateral posterior aferente neurônio e atividade de raiz motor ventral em larvas de zebrafish (4-7 dias após a fertilização) que pode durar várias horas. Gravações extracelulares de neurônios aferentes são obtidas usando a técnica de grampo de remendo solto, que pode detectar atividade a partir de neurônios únicos ou múltiplos. Gravações radiculares ventrais são realizadas através da pele com eletrodos de vidro para detectar a atividade do neurônio motor. Nosso protocolo experimental fornece o potencial para monitorar mudanças endógenas ou evocadas na entrada sensorial através de comportamentos motores em um vertebrado intacto e comportado.
Introdução
Diferentes neurônios de sistemas de mecanosensoria transmitem informações das células ciliares para o cérebro durante a audição e equilíbrio. A eletrofisiologia pode revelar a sensibilidade de neurônios diferentes através de gravações diretas. Embora a remenda celular inteira das células ciliares possa ser desafiadora, o registro a partir de neurônios a montante é mais fácil e permite a avaliação dos potenciais de ação em resposta às estimulações controladas1,2,3. Estimular as células ciliadas leva à sua deflexão, o que modifica estruturas mecanosensoriais, desencadeando assi....
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Protocolo
Todos os cuidados e experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida.
1. Preparação de materiais para gravações eletrofisiológicas
- Faça um prato de gravação com fundo de elastômero de silicone.
- Distribua uma fina camada de componentes de elastômero de silicone auto-misturados (por exemplo, Sylgard) em um prato de cultura de tecido com fundo de vidro até que ele se níveis com a borda do poço raso. Aproximadamente 0,5 mL é suficiente.
- Cubra e cure o prato por um mínimo de 48 h em temperatura ambiente. ....
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Resultados
Depois que as larvas de zebrafish são devidamente imobilizadas e a linha lateral posterior é alcançada, a atividade em neurônios aferentes e motores pode ser medida simultaneamente. Os canais de gravação são exibidos usando protocolos de gravação livres de lacunas (etapa 1.4) para monitoramento contínuo de atividades aferentes e vr. Em tempo real, podem ser observadas reduções na taxa de pico espontâneo efervescente, concomitantemente com atividade vr indicativa de natação fictícia(Figura 1E.......
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Discussão
O protocolo experimental descrito fornece o potencial para monitorar mudanças endógenas na entrada sensorial através de comportamentos motores em um vertebrado intacto e comportado. Especificamente, ele detalha uma abordagem in vivo para realizar gravações extracelulares simultâneas de neurônios de linha lateral e raízes motoras ventrais em zebrafish larval. A atividade aferente espontânea tem sido previamente caracterizada em zebrafish sem considerar a potencial atividade motor simultânea1,<.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio do Instituto Nacional de Saúde (DC010809), da Fundação Nacional de Ciência (IOS1257150, 1856237) e do Whitney Laboratory for Marine Biosciences ao J.C.L. Gostaríamos de agradecer aos membros do passado e do presente do Laboratório Liao por estimular as discussões.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Copo de 100 mL | Recipiente PYREX | 1000 | para gravação |
| Objetiva de imersão em água 10x | Olympus | UMPLFLN10xW | baixa ampliação para posicionamento de larvas e eletrodo de registro |
| Objetiva de imersão em água 40x | Olympus | LUMPLFLN40XW | maior ampliação para posicionar a ponta do eletrodo e estabelecer o patch-clamp |
| abfload.m | arquivo de codificação suplementar | script MATLAB escrito sob medida para converter gravações de eletrofisiologia bruta em arquivos .mat | |
| codificação suplementar | AffVR_preprocess.m | script MATLAB escrito sob medida para pré-processamento de dados de gravação | |
| Cabos coaxiais BNC | ThorLabs | 2249-C-12 | conectando canais de amplificador e digitalizador; requer 4 |
| capilares de vidro borossilicato com filamento | Warner Instrumentos | G150F-3 | diâmetro interno: 0,86, diâmetro externo: 1,50; vidro capilar usado para formar eletrodos de gravação |
| burst_detect | arquivo de codificação suplementar | função MATLAB escrita personalizada necessária para executar o computador AffVR_preprocess.m | |
| N / A | N / A | qualquer computador deve funcionar | |
| Fonte de alimentação DC | Tenma | 72-420 | usada para gravar eletricamente os pinos de dissecação |
| digitalizador de eletrofisiologia | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | permite a aquisição de filamento de dados patch-clamp |
| Sutter Instrument Company | FB255B | filamento de caixa de 2,5 mm usado em pinças finas extratoras de micropipetas | |
| Fine Science Tools | Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Item nº 11295-10 | usado para manipular larvas e inserir pinos | |
| estágio fixo DIC microscópio | Olympus | BX51WI | microscópio usado para visualizar e estabelecer gravações de patch-clamp |
| de pipeta flexível e cônica | Fisher Scientific | 02-707-169 | permitem a inserção no eletrodo de gravação para dispensar solução extracelular na ponta |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | prato de gravação com fundo de vidro |
| de cobertura KimWipe | KimTech | 34155 | limpeza de tarefas usada para absorver o excesso de fluido das larvas |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | Elastômero sylgard de automistura | 710172 |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | software de linha de comando para pré-processamento |
| de dados amplificador de microeletrodo | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | para gravações de canal duplo |
| microforge | Narishige | MF-830 | microforge para polir micromanipulador de eletrodo de gravação |
| unidade de controle | Siskiyou | MC1000-eR/T | Coordenador de discagem de 4 eixos para controle do micromanipulador |
| extrator de micropipeta | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | para puxar o vidro capilar para eletrodos de gravação |
| unidade de controle do microscópio | Siskiyou | MC1000e | posiciona o microscópio ao redor do estágio fixo e preparação |
| micromanipulador | motorizadoSiskiyou | MX7600 | posiciona o cabeçote e o eletrodo de gravação anexado para gravação de patch-clamp |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | para download da página de download do Axon MultiClamp 700B Commander |
| mesa de ar óptico Mesa | de placa de ensaio VH3036W-OPT | Newport Corporation | para microscópio flutuante e minimizar vibrações durante as gravações |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | para download do Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Software de análise Página de download |
| de tinta permanente | Sharpie | encomenda de amazon.com | para marcar o lado da borda de ataque do eletrodo VR para garantir a orientação adequada ao inserir no porta-pipetas |
| placa de Petri | Falcon | 35-3001 | usado para imergir larvas em porta-pipetas paralíticas |
| Dispositivos Moleculares | 1-HL-U | segurar o eletrodo de gravação e conectar ao cabeçote | |
| transdutor pneumático | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | para controlar o eletrodo de registro pressão interna |
| hidróxido de potássio | Sigma-Aldrich | 221473-25G | gravante para gravação pinos de dissecação |
| tubulação de silicone | Tubulação Tygon | 14-169-1A | para conectar o transdutor pneumático ao suporte da pipeta |
| spike_detect | arquivo | de codificação suplementarfunção MATLAB escrita sob medida necessária para executar o | |
| estereomicroscópio | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | usado para visualizar pontas de pinos e durante a preparação de larvas |
| lâmina de barbear de borda reta | Canopus | encomenda de amazon.com | corta o fio de tungstênio enquanto faz pinos de dissecação |
| swimbout_detect | arquivo | de codificação suplementarfunção MATLAB escrita sob medida necessária para executar a seringa AffVR_preprocess.m | |
| Becton Dickinson Compoany | 309602 | preenchida com solução extracelular para injetar em eletrodos de gravação | |
| pipeta de transferência | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | pipeta não estéril de uso único para transferência de larvas |
| tricaína metanossulfonato | Syndel | 12854 | Farmacêutico anestésico usado para eutanasiar larvas com alta dosagem. |
| fio de tungstênio | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0,002 polegadas, 50,8 μ m de diâmetro; usado para fazer pinos de dissecação |
| unidade de filtração a vácuo | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | unidades de filtração a vácuo de uso único, estéreis usadas para esterilizar solução extracelular usada para eletrofisiologia campainha de eletrodo grampo |
| de tensão grampo de corrente headstage | Molecular Devices | CV-7B | fornecido com amplificador MultiClamp 700B usado como headstages esquerdo e direito |
| α-bungarotoxina | ThermoFisher | B1601 | para imobilizar as larvas antes da gravação |
Referências
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C.
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Reimpressões e permissões
