Isolamento primário da microglia de cérebros de camundongos pós-natais

Resumo

A cultura de células primárias é uma das abordagens mais utilizadas para estudar a biologia microglial in vitro. Aqui, desenvolvemos um método para isolamento simples e rápido da micróglia do dia 1 pós-natal do camundongo (P1) para o P4.

Resumo

A microglia são os fagócitos mononucleares do sistema nervoso central (SNC), que desempenham papéis fundamentais na manutenção da homeostase e na regulação do processo inflamatório no SNC. Para estudar a biologia microglial in vitro, a microglia primária mostra grandes vantagens em comparação com as linhagens celulares microgliais imortalizadas. No entanto, o isolamento da microglia do cérebro pós-natal do camundongo é relativamente menos eficiente e demorado. Neste protocolo, fornecemos um método rápido e fácil de seguir para isolar a micróglia primária do cérebro de camundongos neonatais. As etapas gerais deste protocolo incluem dissecção cerebral, cultura primária de células cerebrais e isolamento da microglia. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem obter microglia primária com alta pureza. Além disso, as micróglias primárias colhidas foram capazes de responder ao desafio dos lipopolissacarídeos, indicando que mantiveram sua função imunológica. Coletivamente, desenvolvemos uma abordagem simplificada para isolar eficientemente a micróglia primária com alta pureza, o que facilita uma ampla gama de investigações de biologia microglial in vitro.

Introdução

A microglia, as células imunes residentes no sistema nervoso central (SNC), desempenham papéis fundamentais na manutenção da homeostase, que respondem aos desafios neuropatológicos¹. Recentemente, investigações intensivas foram conduzidas para descobrir as funções fisiológicas da microglia, por exemplo, na doença de Alzheimer². Atualmente, o perfil transcricional da microglia na resolução de célula única obtida durante o desenvolvimento, envelhecimento e doença do SNC fornece uma melhor compreensão da função microglial em cérebros saudáveis e doentes³. Estudos anteriores identificaram um subtipo microglial associado à doença na DA e outras doenças neurodegenerativas ^4,5,6. Esta subpopulação é proximal à deposição de β amilóide (Aβ). Genes associados à fagocitose e metabolismo lipídico (por exemplo, Apoe, Tyrobp) foram considerados regulados positivamente nessas populações ^6,7. No entanto, os processos subcelulares, vias de sinalização extracelulares e intracelulares que regulam as mudanças dinâmicas do perfil molecular na microglia não são totalmente compreendidos. Particularmente, o mecanismo subjacente à ativação microglial crônica em doenças neurodegenerativas permanece indefinido. Portanto, é crucial entender os mecanismos celulares envolvidos na microglia, uma vez que as respostas da microglia contribuem claramente para o desenvolvimento do cérebro e a progressão da neurodegeneração.

Embora existam algumas ferramentas in vivo e in vitro para estudar a microglia, ainda existem algumas limitações. É tecnicamente difícil obter um número suficientemente grande de células microgliais com alta pureza para realizar rotineiramente experimentos, como western blot, para elucidar as vias de sinalização intracelular. A cultura primária da microglia fornece um meio alternativo para estudar a biologia da microglia. A micróglia primária cultivada pode ser aplicada para analisar a capacidade fagocítica microglial após a manipulação gênica e avaliar a produção de citocinas pró e anti-inflamatórias em resposta a estímulos inflamatórios e outros aspectos biológicos para entender seus papéis no cérebro⁸. Aqui, apresentamos um novo protocolo e descrevemos uma instrução passo a passo para o isolamento e cultura da micróglia primária do cérebro de camundongos neonatais, com ênfase nas etapas que são críticas para a obtenção de células microgliais primárias saudáveis e puras.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo comitê de Pesquisa Animal e pelo painel de administração institucional de cuidados com animais de laboratório da Universidade Jiao Tong de Xangai. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.

1. Preparação do tampão de cultura, frascos e lamínulas

1. Meio de cultura e meio de cultura da microglia: Suplemento DMEM com 10% de FBS para fazer o meio de cultura. O meio de cultura da microglia é feito adicionando 10% de FBS e 20% de meio condicionado LADMAC ao DMEM. Adicione 1% de penicilina / estreptomicina a ambos os meios.
   1. Para preparar o meio condicionado com 20% de LADMAC, colete o meio de cultura das células LADMAC, centrifugue a 200 x g por 10 min, filtre usando um filtro de célula de 0,22 μm e, em seguida, armazene as alíquotas a -80 ° C.
2. Tampão de digestão: Prepare o tampão de digestão adicionando 8 U / mL de papaína e 125 U / mL de DNase ao DMEM.
   NOTA: Para obter melhores resultados, o tampão de digestão deve ser preparado na hora. Calcule a quantidade desejada com base no número de filhotes (1 mL de solução para cada 2 filhotes).
3. Frascos de revestimento: Use frascos T25 ou T75 para pré-plaquear as células cerebrais isoladas. Antes da dissecção cerebral, cobrir os frascos T25 com 2 ml (ou 4 ml para um balão T75) de 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (PDL) e incubar a 37 °C durante pelo menos 1 h. Aspirar a solução de PDL, lavar duas vezes com 1x PBS e, em seguida, deixar o balão secar ao ar na campânula de cultura de células.
   NOTA: O tamanho e o número de frascos usados no experimento dependeram do número de filhotes pós-natais. Para permitir que as células atinjam a camada de células confluentes dos astrócitos em um curto espaço de tempo, prepare um frasco T25 para 3-5 cérebros ou um frasco T75 para 5 cérebros. Os frascos revestidos não utilizados podem ser conservados a 4 °C durante um mês. Para economizar tempo, 10x (1 mg / mL) solução estoque de PDL pode ser preparada antes do início do experimento e armazenada a -20 ° C como alíquotas de uso único. Dilua as alíquotas em 1x PBS estéril antes de usar.
4. Prepare lamínulas: Lave lamínulas de vidro comerciais com HCl 0,1 M por 1 h, enxágue duas vezes com água da autoclave e armazene em etanol 100%. Antes de usar, chame as lamínulas usando uma pinça fina com uma lâmpada queimadora para remover o etanol residual. As lamínulas de vidro de 8 mm podem ser colocadas em uma placa de 48 poços e as lamínulas de vidro de 12 mm podem ser colocadas em uma placa de 24 poços.
5. Prepare as ferramentas de dissecação: Mergulhe tesouras finas, pinças e microcolheres de aço inoxidável em etanol a 75% por pelo menos 20 min. Em seguida, coloque essas ferramentas sob radiação ultravioleta na capa de cultura de tecidos por 30 min.

2. Dissecção do cérebro do camundongo

NOTA: Para avaliar a eficácia do protocolo, aqui usamos camundongos knock-in CX3CR1^GFP para rastrear a microglia⁹. Camundongos CX3CR1^GFP/GFP e fêmeas selvagens do tipo C57BL/6J em 2 a 8 meses foram cruzados para gerar camundongos CX3CR1^+/GFP , ambos foram originalmente obtidos de fontes comerciais. Os camundongos foram alojados em um ciclo claro-escuro de 12-12 h em um ambiente específico livre de patógenos (SPF) na Universidade Jiao Tong de Xangai. Filhotes do dia 1 ao dia 4 pós-natal podem ser usados para este protocolo.

1. Decapite todos os filhotes com uma tesoura cirúrgica. Para minimizar a contaminação, enxágue todas as cabeças com etanol 75% e coloque rapidamente o PBS 1x gelado. Enquanto isso, aqueça o tampão de digestão e o meio de co-cultura em banho-maria a 37 °C.
   NOTA: Decapite e isole o tecido cerebral de um filhote de cada vez para preservar a integridade estrutural. Para evitar contaminação, todas as ferramentas cirúrgicas devem ser colocadas em etanol a 75% entre a decapitação.
2. Use uma tesoura de dissecação fina para cortar o crânio junto com a medula oblonga. Coloque uma microcolher de aço inoxidável sob o tecido cerebral do local do corte para espremer o cérebro da cavidade da cabeça. Transfira-o para uma nova placa resfriada de 6 poços contendo 2 mL de PBS pré-resfriado 1x por poço.
3. Corte e descarte o cerebelo e os bulbos olfatórios. Transfira suavemente o tecido cerebral restante para uma placa gelada de 6 poços contendo 2 mL de PBS 1x pré-resfriado.
   NOTA: Coloque 4-5 tecidos cerebrais em um poço.
4. Repita o mesmo procedimento para as cabeças restantes até que todo o tecido seja coletado.

3. Semeie as células primárias mistas

1. Aspire 1,5 mL de 1x PBS na placa de 6 poços e pique totalmente o tecido cerebral em pedaços pequenos (aproximadamente 1 mm²) com a ajuda de uma tesoura de mola.
   NOTA: Para reduzir a quantidade de detritos finos, não pique demais o tecido.
2. Adicione a quantidade desejada de tampão de digestão ao poço (0,5 mL de tampão de digestão por cérebro) e, em seguida, coloque a placa na incubadora umidificada a 5% de CO₂, 37 ° C por 20 min. Agite o prato a cada 10 min.
   NOTA: Durante o tempo de incubação, molhe um filtro de células de 70 μm com meio de cultura (10% FBS em DMEM) e, em seguida, coloque o filtro de células em um novo tubo de coleta de 50 mL.
3. Retire a placa da incubadora e termine a digestão da papaína adicionando 3 mL de meio de cultura a cada poço. Pipete levemente as células para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta de 1 mL. Transfira a mistura para um tubo de 15 mL e deixe repousar por 1 min. Um pellet de célula turva pode ser visto na parte inferior. Para remover grandes aglomerados e detritos celulares, passe cuidadosamente a suspensão celular por um filtro de células de 70 μm e colete o fluxo no tubo de coleta de 50 mL.
4. Adicione 3 mL de meio de cultura aquecido (10% FBS em DMEM) ao pellet de células não dissociadas no tubo de 15 mL. Triturar 10 vezes como nas etapas 3.3 para continuar a dissociação. Deixe o tecido repousar por 1 min e, em seguida, passe a suspensão celular através do filtro para o tubo de coleta de 50 mL. Repita esta etapa e descarte os detritos celulares restantes.
5. Transfira a suspensão celular do tubo de coleta de 50 mL para tubos de 15 mL e centrifugue as células a 200 x g por 10 min em temperatura ambiente.
6. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 5 mL de meio de cultura. Semear as células primárias num balão T25 ou T75 com uma densidade celular de cerca de 5 x 10⁶ e cultivar na estufa humidificada (5% CO₂, 37 °C). Este é o Dia 0 nesta programação cultural.
   NOTA: Se as células forem semeadas num balão T25, é suficiente um volume final de 5 ml de meio por balão. Adicionar mais 5 ml de meio de cultura a cada balão quando semeado num balão T75.

4. Coleta de micróglia primária

1. Avalie a confluência das células mistas no dia seguinte (Dia 1). Como as células mistas foram semeadas em uma densidade bastante alta, leva de 3 a 4 dias para os astrócitos atingirem a confluência, permitindo que a micróglia seja coletada 1 a 2 dias depois.
   NOTA: Tenha cuidado se as células não estiverem presas ao fundo do frasco no dia seguinte; Pode ser devido à contaminação celular ou morte celular causada por digestão excessiva ou manuseio severo.
2. No Dia 2, lave os frascos com 3 mL de 1x PBS quente duas vezes e troque o meio adicionando 3-5 mL de meio de cultura fresco a cada frasco T25 (7-10 mL para um frasco T75). O meio de cultura descartado contém restos celulares e vários tipos de células, incluindo neurônios, oligodendrócitos e microglia.
3. No dia 4, certifique-se de que os astrócitos presos ao fundo do frasco estejam em 100% de confluência. Enquanto isso, uma subpopulação de microglia está frouxamente ligada à camada superficial de células mistas, que pode facilmente se desprender da superfície e flutuar no meio de cultura por aperto de mão. Transfira o meio de cultura para uma placa fresca de 6 poços e a microglia primária enriquecida no meio é coletada durante esse processo. Em seguida, forneça às células da placa original de 6 poços meio de cultura fresco para posterior coleta de células.
   NOTA: Bater os frascos na mesa ou agitar os frascos em um agitador de laboratório a 180 rpm por 30 minutos antes da transferência do meio é apropriado para produzir mais células.
4. Coloque cuidadosamente os 6 poços na incubadora para permitir a fixação das células. Cerca de 2 h após a incubação, todas as células serão presas à placa. Quando as células estiverem presas, lave-as suavemente com PBS morno 1x duas vezes para remover agregados celulares e detritos celulares; em seguida, forneça às células 3 mL de meio de cultura fresco de microglia. As células isoladas da microglia podem ser mantidas por mais de um mês in vitro, atualizando o meio de cultura da microglia a cada 2 dias.
   NOTA: O fator estimulador de colônias 1 (CSF1) é um importante fator de crescimento para apoiar a sobrevivência da micróglia in vitro. Estudos anteriores relatam que o CSF1 pode ser secretado a partir da linha celular LADMAC, que é uma linha celular transformada originada de células da medula óssea de camundongos. O meio condicionado LADMAC pode ser coletado centrifugando a cultura LADMAC a 200 x g por 10 min; Em seguida, passe o sobrenadante por um filtro de células de 0,22 μm. O meio de cultura Microglia foi preparado adicionando 20% de meio condicionado LADMAC ao meio de cultura (10% FBS, DMEM).
5. A cada 2-3 dias, continue a coletar a microglia do meio de cultura de células mistas como na etapa 4.4. Cultive as células misturadas restantes no frasco e use-as para colher microglia de forma consistente a cada 2-3 dias por até 1 mês.
   NOTA: A microglia pode ser colhida com sucesso coletando as células de cultura mista de forma média por até 50 dias. Cada vez, o meio de co-cultura coletado produzirá cerca de ~ 1-3 x 10⁵ células de microglia por frasco T75. Combine células microgliais, se necessário.
6. Use células microgliais primárias para o ensaio funcional desejado.

Resultados

A microglia primária coletada de CX3CR1 ^{+ / GFP} no dia 7 e no dia 35 após a semeadura celular foi demonstrada na Figura 1. Conforme mostrado na coloração de imunofluorescência do marcador de células de microglia / macrófago IBA1, todas as células positivas para IBA1 são positivas para os sinais de GFP e negativas para S100β (marcador de astrócitos) e CC1 (marcador de oligodendrócitos), sugerindo que as células positivas para GFP purificadas são de fato microglia. Em seguida, verif...

Discussão

Esse protocolo é baseado nos métodos descritos anteriormente com algumas modificações¹¹. Dicas para melhorar a viabilidade e pureza da microglia isolada estão listadas a seguir. Primeiro, tome cuidado para evitar contaminação ao preparar tampões usados para isolamento de tecidos e cultura de células. Certifique-se de que as ferramentas cirúrgicas, recipientes e equipamentos plásticos sejam estéreis. Normalmente, realizamos a dissecção cerebral em um capuz de cultu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtros de células, 40 µ m	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco da Life Technologies	C11995500BT
tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Gibco da Life Technologies	14190-144
Soro Fetal Bovino (FBS)	Gibco da Life Technologies	10099141
Papaína, Suspensão	Sangon Biotech	Papaína, Suspensão
Penicilina-Estreptomicina 100X solução	Hyclone	SV30010
Poly-D-Lysine	ThermoFisher Scientific	A3890401