Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET

Resumo

A Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) entre duas moléculas de fluoróforo pode ser usada para estudar as interações proteicas na célula viva. Aqui, um protocolo é fornecido sobre como medir o FRET em células vivas, detectando a emissão sensibilizada do aceptor e a têmpera da molécula doadora usando microscopia confocal de varredura a laser.

Resumo

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) é a transferência de energia sem radiação de um doador excitado para uma molécula aceitadora e depende da distância e orientação das moléculas, bem como da extensão da sobreposição entre os espectros de emissão do doador e absorção do aceitador. FRET permite estudar a interação de proteínas na célula viva ao longo do tempo e em diferentes compartimentos subcelulares. Diferentes algoritmos baseados em intensidade para medir FRET usando microscopia têm sido descritos na literatura. Aqui, um protocolo e um algoritmo são fornecidos para quantificar a eficiência do FRET com base na medição da emissão sensibilizada do aceptor e da têmpera da molécula doadora. A quantificação do FRET ratiométrico na célula viva não requer apenas a determinação do crosstalk (transbordamento espectral ou sangria) das proteínas fluorescentes, mas também a eficiência de detecção da configuração microscópica. O protocolo fornecido aqui detalha como avaliar esses parâmetros críticos.

Introdução

A análise baseada em microscopia da Transferência de Energia por Ressonância de Förster (FRET) permite a avaliação das interações entre proteínas em células vivas. Ele fornece informações espaciais e temporais, incluindo informações sobre onde na célula e em qual compartimento subcelular a interação ocorre e se essa interação muda ao longo do tempo.

Theodor Förster lançou as bases teóricas do FRET em 1948¹. FRET é uma transferência de energia sem radiação de um doador excitado para uma molécula aceitadora e depende da distância das moléculas e da orientação relativa de seus dipolos de transição, bem como da sobreposi....

Protocolo

1. Construção do plasmídeo

1. Para gerar a sonda de fusão eGFP-mCherry1, use um vetor de expressão de células de mamíferos N1 (ver Tabela de Materiais) com mCherry1¹⁰ inserido usando os locais de restrição AgeI e BsrGI.
2. Utilizar os seguintes oligonucleótidos para amplificar a eGFP¹¹ sem um códon de paragem como fragmento de SalI-BamHI : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' e C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
3. Insira este fragmento de SalI-BamHI no local de clonagem múltipla....

Resultados

A Figura 1 mostra as imagens obtidas no canal doador, canal 1 (488, 505-530 nm), canal de transferência, canal 2 (488, >585 nm) e canal aceitador, canal 3 (561, >585 nm), respectivamente. Imagens representativas de células expressando apenas GFP, somente Cherry, co-expressando GFP e Cherry e expressando a proteína de fusão GFP-Cherry. As eficiências celulares médias de FRET calculadas em células NRK que expressam a proteína de fusão GFP-Cherry (controle.......

Discussão

O protocolo apresentado detalha o uso da sonda de calibração de proteínas fluorescentes um-para-um acoplada geneticamente para quantificação do FRET utilizando a detecção de emissão sensibilizada do aceptor e têmpera da molécula doadora por microscopia confocal. Este método pode ser aplicado para avaliar as interações proteicas no contexto fisiológico da célula viva em diferentes compartimentos subcelulares. A resolução espacial pode ser melhorada ainda mais aplicando o algoritmo apresentado para calcular as eficiências .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5% de tripsina-EDTA sem vermelho de fenol (10x)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Clontech mCherry N1 vector	Addgene	3553
DMEM sem vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	11054020
Fugene 6	Promega	E2691
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
Câmaras de 8 poços LabTek #1.0	Thermo Fisher Scientific	12565470
L-Glutamina (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081