Microgotículas com casca de dimetildioctadecilamônio de mudança de fase como um sistema promissor de entrega de medicamentos: resultados em esferóides 3D de células tumorais de mamíferos

Resumo

As microgotículas de decafluoropentano desenvolvidas com uma casca de brometo de dimetildioctadecilamônio exibiram uma estabilidade coloidal excepcional e uma biointerface actrativa. Os DDAB-MDs provaram ser reservatórios de drogas eficientes caracterizados por uma alta afinidade com as membranas plasmáticas, juntamente com maior captação e atividade antitumoral da doxorrubicina contra o modelo 3D de câncer de mama triplo-negativo humano (MDA-MB-231).

Resumo

A melhoria significativa das microgotículas de perfluorocarbono (MDs) de mudança de fase no vasto cenário teranóstico passa pela otimização da composição dos MDs em relação à eficiência de síntese, estabilidade e capacidade de entrega de medicamentos. Para isso, foram projetados MDs de decafluoropentano (DFP) estabilizados por uma casca de surfactante catiônico de brometo de dimetildioctadecilamônio (DDAB). Uma alta concentração de DDAB-MDs foi prontamente obtida em poucos segundos por insonação pulsada de alta potência, resultando em gotículas de baixo tamanho polidisperso de 1 μm. O potencial de ζ altamente positivo, juntamente com uma longa cadeia de hidrocarbonetos saturada do invólucro DDAB, são fatores-chave para estabilizar a gotícula e a carga de medicamentos nela contidas. A alta afinidade do invólucro DDAB com a membrana plasmática celular permite a entrega de quimioterápicos localizados, aumentando a concentração do medicamento na interface da célula tumoral e aumentando a absorção. Isso transformaria os DDAB-MDs em uma ferramenta relevante de administração de medicamentos, exibindo alta atividade antitumoral em doses muito baixas.

Neste trabalho, a eficácia de tal abordagem demonstrou melhorar drasticamente o efeito da doxorrubicina contra esferóides 3D de células tumorais de mamíferos, MDA-MB-231. O uso de culturas de células tridimensionais (3D) desenvolvidas na forma de esferóides tumorais multicelulares (ou seja, células densamente compactadas em forma esférica) tem inúmeras vantagens em comparação com as culturas de células 2D: além de ter o potencial de preencher a lacuna entre os estudos convencionais in vitro e os testes em animais, melhorará a capacidade de realizar mais previsões in vitro ensaios de triagem para desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos ou avaliar o potencial de medicamentos off-label e novas estratégias de co-direcionamento.

Introdução

Vetores de liberação de medicamentos capazes de garantir alta eficácia antitumoral e reduzir os efeitos colaterais são objetivos primários, permanecendo um grave desafio químico-farmacêutico ^1,2. Até o momento, seu progresso é limitado inicialmente pelo contraste de uma liberação insuficiente de drogas in situ e um nível crítico de toxicidade inespecífica ^3,4,5. Nos últimos anos, vários sistemas de liberação de medicamentos foram implementados para melhorar a administração de agentes anticancerígenos, incluindo lipossomas, micelas poliméricas, polimerossomos 6,7,8,9,10. Esses sistemas apresentam potencial para aumentar o tempo de circulação e a seletividade de fármacos, ao mesmo tempo em que reduzem a distribuição e o acúmulo em órgãos e tecidos saudáveis. De qualquer forma, as formulações encapsuladas de quimioterápicos antineoplásicos, como as antraciclinas, levaram a uma eficiência de internalização de medicamentos significativamente reduzida. Recentemente, carreadores de mícrons e submícrons responsivos a estímulos, como microbolhas¹¹, microgotículas, nanopartículas híbridas de ouro¹², nano-hidrogéis¹³, scaffolds PLGA e plataformas mesoporosas¹⁴, vêm ganhando interesse farmacológico por sua alta versatilidade em direcionar e exercer efeitos inibitórios tumorais usando doxorrubicina (Dox) e docetaxel. Experimentos pioneiros para transformar esses portadores em soldados anticâncer eficientes para tarefas multimodais (ou seja, abordagens quimioterápicas, fototérmicas e sinérgicas genéticas) e imagens moleculares¹⁵ abriram caminho para a nanomedicina teranóstica personalizada.

Nesse cenário, as microgotículas de perfluorocarbono (MDs) de mudança de fase foram avaliadas por meio da principal oportunidade que oferecem para conjugar alta carga de fármaco, versatilidade química do invólucro de MDs abordando barreiras biológicas, estabilidade coloidal e eficiência de síntese^11,12. Como um ativo adicional, a ecogenicidade dos MDs promovida pela vaporização acústica ou óptica do núcleo de perfluorocarbono (PFC) permite obter imagens in situ e eficácia terapêutica promissora. Além disso, a vaporização do núcleo de MDs obtida pela liberação de energia de feixes de partículas ionizantes pode ser explorada para rastreamento de feixes e dosimetria de radiação.

O presente estudo tem como objetivo desenvolver microgotículas de decafluoropentano (DFP) estabilizadas por um invólucro utilizável múltiplo de surfactante catiônico de brometo de dimetildioctadecilamônio (DDAB). Os MDs com casca DDAB atendem às expectativas físico-químicas e biológicas. As microgotículas à base de DFP demonstraram ser valiosos agentes de contraste de mudança de fase para obter MDs de perfluorocarbono biocompatíveis e estáveis¹⁶. O gel cristalino DDAB satura as cadeias longas à temperatura fisiológica, penetrando profundamente no núcleo hidrofóbico, estabilizando a gotícula e a carga do medicamento nela. Além disso, o alto potencial de ζ positivo na interface da água aumenta a estabilidade coloidal dos MDs. A atratividade biológica da superfície da casca do DDAB reside na capacidade de causar a morte de bactérias e fungos, em concentrações que quase não afetam as células de mamíferos, e de ligar membranas plasmáticas, proteínas antigênicas carregadas negativamente, nucleotídeos, DNA ou nanopartículas. As características acima mencionadas podem ser exploradas para gerar uma notável ação imunoadjuvante, terapia gênica e antitumoral dentro de células de mamíferos¹⁷.

DDAB-MDs carregados com Dox (Dox@DDAB-MDs) aqui descritos promovem a liberação do medicamento contra células de câncer de mama triplo-negativo altamente agressivas, invasivas e pouco diferenciadas. Um protocolo simples e rápido é descrito abaixo com base na insonação de sonda de alta potência para obter DDAB-MDs estáveis e de alta densidade com uma distribuição de tamanho estreita com uma alta eficiência de carga de Dox em uma formulação de uma etapa. Tais características são competitivas mesmo para outros métodos de preparo, como dispositivos microfluídicos e homogeneizadores de alto cisalhamento¹⁶.

A outra grande questão limitante no projeto de vetores de entrega de medicamentos eficientes é que a atividade de um medicamento é uma função de vários parâmetros (por exemplo, absorção, distribuição, concentrações) obtidos em um alvo biológico real, que não podem ser considerados por modelos de células de monocamada¹⁸. Por esse motivo, a história do desenvolvimento de novas formulações antitumorais está repleta de estudos in vitro que, infelizmente, já se mostraram ineficazes no nível dos modelos pré-clínicos em animais¹⁹.

Particularmente, a necessidade de passar de culturas de células para um sistema mais complexo e confiável do que os estudos in vivo e ex vivo está ligada às limitações inerentes aos estudos farmacológicos em culturas 2D. Nesse contexto, estão incluídos os sistemas 3D in vitro, como esferoides, organoides, organ-on-chip, que simulam a morfologia, atividade e resposta fisiológica de estruturas mais complexas do que as monocamadas^{2D 20}. Em uma visão pré-clínica, os modelos celulares 3D que mimetizam o microambiente celular oferecem a possibilidade de entender melhor a biologia complexa em um quadro fisiologicamente mais pertinente no qual as culturas tradicionais de monocamada não são eficazes^21,22.

Após comprovar que os DDAB-MDs podem interagir com a membrana celular de células de câncer de mama humano, favorecendo a internalização de fármacos e a morte celular em concentração muito baixa (nanomolar) de Dox, foi testada a eficácia de tal metodologia contra esferoides 3D de células tumorais de mamíferos, MDA-MB-231.

Protocolo

NOTA: Todos os reagentes e instrumentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fabricação e caracterização de microgotículas

1. Preparando DDAB-MDs carregados com Dox
   1. Dissolver o pó de DDAB em etanol para obter uma concentração final de 10 mM e um volume final de 1 mL. Prepare 1 mL de solução estoque Dox dissolvendo 2 mg de pó de Dox em etanol.
      CUIDADO: Dox é conhecido por ter toxicidade oral aguda, categoria 4 e carcinogenicidade, categoria 1B. Use apenas sob um exaustor com luvas e máscara de saúde.
   2. Adicione 250 μL de DFP a 300 μL de solução DDAB (fase oleosa) em um tubo de centrífuga graduado de plástico de 15 mL.
      NOTA: A pureza do DFP é de 60% (GC), densidade de 1,6 g/mL (20 °C), o ponto de ebulição é de 55 °C. A pureza Dox é 98, 0-102, 0% (HPLC). A pureza do DDAB é de ≥98% (TLC). A pureza do etanol é de 97%.
   3. Adicione suavemente 2,15 mL de água deionizada na fase oleosa, resultando em uma mistura bifásica de água/óleo. Injete suavemente 10 μL de solução Dox diretamente na fase oleosa imediatamente antes da insonação para evitar a partição de uma quantidade significativa de Dox na fase aquosa.
   4. Emulsione a mistura bifásica por insonação de sonda (com uma microponta cônica de titânio de 1/8 pol) usando um equipamento processador de líquido ultrassônico de alta intensidade em modo de pulso (0,7 s ligado e 0,3 s desligado) a 20 kHz, 100 W por 10 s. Dilua imediatamente os MDs recém-preparados com água ultrafiltrada e deionizada (por exemplo, MilliQ) por um fator de 1,8.
      NOTA: O fator de diluição é indicativo, escolhido empiricamente. A solução de MDs pode ser diluída mais, desde que seja obtido pellet suficiente de centrifugações subsequentes.
   5. Tome 1 mL da suspensão obtida e centrifugue 3x, ressuspendendo em água ultrafiltrada e deionizada (por exemplo, MilliQ) para remover o excesso de Dox e etanol. Efectuar a primeira centrifugação a 25 °C, 360 x g durante 3 min, e a segunda e a terceira a 280 x g à mesma temperatura e tempo.
   6. Após a última lavagem, remova a água sobrenadante e retire 5 μL dos pellets e disperse-os em 2 mL do meio para tratamento celular, obtendo uma concentração Dox equivalente de 10 nM. As etapas do protocolo para a síntese de Dox@DDAB-MDs são mostradas na Figura 1.
      NOTA: A concentração equivalente de Dox é definida como a quantidade de Dox livre contida no mesmo volume de uma suspensão de Dox@DDAB-MDs.
2. Caracterização de DDAB-MDs carregados com Dox
   1. Meça a distribuição de tamanho usando um fotômetro de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e analise os correlogramas obtidos com o algoritmo CONTIN para extrapolar os tempos de decaimento associados. Em seguida, use os tempos de decaimento para determinar a distribuição dos coeficientes de difusão das partículas (D) e converta-os em uma distribuição de diâmetros hidrodinâmicos (2R_H) usando a relação de Stokes-Einstein R_H = k_BT / 6πηD, onde k_BT é a energia térmica do sistema e η a viscosidade do solvente.
   2. Verifique o tamanho e a distribuição de tamanho também usando microscopia de campo claro com um software de análise de imagem (por exemplo, Imagem J), medindo o tamanho de pelo menos 100 gotículas por quadro (para 3 ou 4 quadros), obtendo um valor médio e um desvio padrão.
      NOTA: Para medições DLS, dilua a solução de MDs em água ultrafiltrada e deionizada (por exemplo, MilliQ), PBS e em meio de cultura de células para evitar retroespalhamento a uma concentração fixa de 1,5 x 10⁸ MDs / mL. Para água ultrafiltrada, deionizada e PBS em meio de cultura celular, obtivemos valores médios de tamanho de 1,1 ± 0,1 μm, 1,1 ± 0,25 μm e 1,2 ± 0,2 μm, respectivamente. Os MDs recuperados dos pellets, após centrifugação, não apresentam alterações de tamanho nos erros.
   3. Use uma lâmina de câmara de contagem de células para microscopia para avaliar a concentração de MDs. A câmara é composta por duas áreas de contagem diferentes com uma espessura de 0,10 mm. Coloque 10 μL de suspensão de MDs sobre a câmara. Conte os MDs dentro do quadrado de 0,25 x 0,25 nm² da câmara usando um microscópio óptico com uma objetiva de longa distância de 40x e analise com um freeware de análise de imagem.
   4. Calcular a concentração de MD, expressa em número de MD/ml, de acordo com a equação:
      
   5. Verifique as imagens Dox internalizadas do Microscópio Confocal de Varredura a Laser (CLSM) explorando a autofluorescência Dox a 590 nm. Medir o teor de Dox utilizando um ensaio fluorimétrico, dispersando as partículas em água desionizada ultrafiltrada ou PBS, centrifugando-as a 25 °C, 360 x g durante 3 min e, em seguida, determinando a quantidade de fármaco livre avaliando a fluorescência do sobrenadante a 590 nm com uma curva de calibração (gama de linearidade para a concentração de Dox: 2-20 μmol/ml, R² = 0,99).
      NOTA: Subtraia o valor obtido da concentração total de Dox para obter a quantidade encapsulada de Dox. Realizar a experiência em triplicado. A eficiência de encapsulamento de Dox resulta em 28% ± 2%, calculada dividindo-se a quantidade de Dox do medicamento nos MDs pelo conteúdo total de Dox implantado.
   6. Realizar experiências de libertação de Dox ao longo do tempo, centrifugando e repetindo o procedimento de acordo com o passo 1.2.3 para obter a percentagem de Dox libertada no sobrenadante em relação ao número de encapsulados. Após a primeira determinação, repetir o procedimento diminuindo a velocidade de centrifugação para 280 x g para evitar a quebra das MDs. Trace uma curva de liberação ao longo do tempo. Verificar se a concentração de Dox libertada no sobrenadante no interior em 24 h atinge um máximo de 20%.
   7. Meça o potencial ζ a 37 °C usando um aparelho dedicado (por exemplo, NanoZetaSizer) e verifique se os valores obtidos estão em torno de 90-100 mV.

2. Fabricação de esferóides em substratos não adesivos micromoldados

1. Micro-moldes de fundição
   1. Coloque pequenos moldes 3D e 1 g de pó de agarose pura em recipientes adequados para esterilização. Autoclave-os durante 30 min em ciclo seco (121 °C).
   2. Em um gabinete de biossegurança, adicione 50 mL de solução salina a 0,9% (NaCl) ao frasco de vidro contendo agarose esterilizada e coloque-o em um forno de micro-ondas para ferver e dissolver o pó. Deixe a agarose derretida esfriar até 60 °C e adicione 500 μL a cada micromolde, evitando a criação de bolhas durante a pipetagem.
      AVISO: A agarose derretida pode causar queimaduras graves na pele. É necessário equipamento de proteção individual adequado.
   3. Remova a agarose gelificada flexionando cuidadosamente o molde e removendo o substrato recém-formado. Coloque os substratos em uma placa de 12 poços e adicione 2 mL de meio de cultura fresco por poço. Incube por pelo menos 15 min para equilibrar cada substrato.
      NOTA: Prepare o meio de cultura com antecedência e passe-o por um filtro de 0.22 μm para remover possíveis partículas ou contaminantes.
2. Semeando as células
   1. Cultura de células MDA-MB 231 com meio completo (DMEM suplementado com 1% de Pen/Strep, 10% de FBS e 1% de L-Glu) em uma incubadora de cultura de células a 37 °C, 5% de CO₂. Quando as células atingirem cerca de 80% de confluência em um frasco T75, descarte o meio, enxágue com 4 mL de DPBS e adicione 3 mL de tripsina/EDTA. Colocar o balão na incubadora e esperar que as células se desprendam. Inspecione o descolamento sob um microscópio invertido (a 20x) a cada 5 min.
   2. Colete as células destacadas com 3 mL de DPBS com 10% de FBS em um tubo de 15 mL e centrifugue a 235 x g por 10 min. Rejeitar o sobrenadante que contém a SPB e a tripsina/EDTA e ressuspender o sedimento das células em 3 ml de meio fresco. Pipetar 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e contar as células usando uma câmara de Neubauer.
      NOTA: Ao colher as células, neutralize a tripsina / EDTA com DPBS contendo 10% de FBS para evitar que a tripsina danifique as células durante a etapa de centrifugação.
   3. Para obter um diâmetro nominal do esferóide de 50 μm (~ 15 células / esferóide), dilua a suspensão celular até uma concentração final de 3.840 células / 190 μL, resultando em 256 esferóides no pequeno molde. Alternativamente, para um diâmetro esferóide de 200 μm (~ 1.000 células/esferóide), dilua até uma concentração final de 81.000 células/190 μL, resultando em 81 esferóides no molde grande, de acordo com as instruções do fabricante.
   4. Remova o meio de cultura da placa de 12 poços e incline os substratos para remover cuidadosamente o meio da câmara de semeadura de células. Adicione 190 μL de suspensão celular a cada substrato (de forma gota a gota) e espere que as células se assentem por 10 min na incubadora de cultura de tecidos.
   5. Adicione 2 mL do meio circundante por poço e coloque o poço múltiplo de volta na incubadora. Inspecione a formação de esferóides a cada 24 h. Substitua por um meio novo quando necessário.
3. Colheita e processamento de esferoides
   1. Coloque uma placa de Petri de 35 mm contendo 2 mL de meio fresco na incubadora para equilibrar por 10-15 min.
   2. Remova o meio de cultura celular ao redor do substrato. Com uma pinça estéril, retire o substrato do poço e inverta-o na placa de Petri. Bata suavemente na parte inferior do substrato para fazer os esferóides caírem por gravidade.
   3. Coloque a placa de Petri contendo os esferóides de volta na incubadora para processamento posterior. As etapas do protocolo para fabricação de esferoides são mostradas na Figura 2.

3. Tratamento esferóide

1. Remova o sobrenadante do molde e substitua-o por 200 μL de dispersão de Dox@DDAB-MDs, preparados conforme descrito na etapa 1.1.6.
2. Após 5 min, adicione 2 mL / poço de meio circundante para equilibrar. Após o tempo de tratamento desejado, proceda conforme o passo 2.1.

4. Caracterização do tamanho e morfologia do esferóide

1. Verifique o tamanho do esferóide após o tempo de incubação desejado com uma objetiva de 40x combinada com o software de processamento de imagem do microscópio.
2. Meça o tamanho de pelo menos 10 esferoides para coletar dados suficientes para estatísticas adequadas e analisar seus volumes conforme relatado na etapa 7.

5. Ensaio de proliferação/viabilidade: microscopia de fluorescência com coloração de células vivas

NOTA: Siga as instruções para a fabricação do esferóide até a etapa 2.2.5.

1. Remova o sobrenadante do molde e substitua-o por 200 μL de calceína-AM 4 μM em PBS e incube por 3 h em temperatura ambiente no escuro. Durante os últimos 20 minutos de incubação, adicione 10 μg/mL de iodeto de propídio para corar as células mortas.
2. Colha os esferóides invertendo o substrato na placa de Petri conforme a etapa 2.3.2.
3. Visualize os esferoides na solução de coloração usando CLSM com objetivas de 40x/60x e um laser Ar+, definindo o ganho e o orifício de maneira apropriada para obter imagens focadas.

6. Análise e aquisição de imagens

1. Transmissão e imagens 2D confocais
   1. Abra o software confocal (Suplementar File A) e selecione a objetiva (60x, 40x, etc). No painel direito, clique em Trans para selecionar o canal de transmissão.
   2. Clique em Ao vivo para visualizar a imagem e procurar o foco otimizado. Clique em Único para interromper a aquisição.
   3. Para as imagens confocais, clique em Canais de laser vermelho ou verde , dependendo do corante fluorescente usado. Na seção pinhole, selecione S-aperture no menu suspenso e defina a seção de ganho em 6,00 B.
   4. Clique em Ao vivo e defina a abertura e o ganho do orifício para otimizar o contraste. Clique em Único para interromper a aquisição e salvar a imagem. Sobreponha a transmissão e a imagem confocal selecionando o canal correto na barra de ferramentas superior.
2. Imagens 3D confocais
   1. Clique em Z no painel direito (Arquivo Suplementar B). Clique no botão vermelho para redefinir as configurações.
   2. Selecione a seção Ref , clique em Ao vivo e pesquise o plano mediano dentro do objeto movendo o foco. Selecione a seção Superior e mova o foco para cima até que o objeto fique fora de foco e desapareça.
   3. Repita a etapa 6.2.2 para a seção inferior movendo o foco para baixo.
   4. Defina o tamanho do passo para 0,75 μm. Clique em Z-stack e depois em Single para iniciar a digitalização. Salve as imagens em .ics formato.
3. Imagens ópticas e análise
   1. Abra o software do microscópio óptico, capture a imagem com um foco de 40x ou objetiva de 20x pressionando Play na barra de ferramentas superior. Pressione Parar e salve a imagem.
   2. Na barra de ferramentas superior, clique em Vista, Controle de Análise, Anotações e Medições abrindo um painel com diferentes opções (Arquivo Suplementar C). No painel Anotação e Medidas , selecione Semieixo e clique em Elipse.
   3. Na Pesquisa de imagens, procure o eixo que melhor se ajusta à forma do objeto e pressione Enter no teclado para transferir o valor obtido na tabela do painel direito.
   4. Repita a etapa 6.3.3 para pelo menos 10 objetos para obter dados suficientes. Clique em Exportar para planilha de dados do Excel para exportar os dados e salvá-los.
4. Visualização de imagens 3D Z-Stack e cálculo numérico de volume
   1. Abra a imagem 3D capturada com a microscopia confocal no software do microscópio óptico (arquivo suplementar D).
   2. Para ver a reconstrução 3D, clique em Mostrar visualização de volume na barra de ferramentas da imagem; O objeto pode ser girado em qualquer direção clicando com o botão esquerdo do mouse. Para selecionar uma parte do volume, continue pressionando ctrl + teclas esquerdas do mouse (Arquivo Suplementar E).
   3. Pressione o botão x no teclado para tirar um instantâneo da imagem 3D e salvá-la.
   4. Para calcular o volume do objeto, clique em Medir, Medidas de objetos 3D abrindo um painel (Arquivo Suplementar, Imagem F). Clique na barra de ferramentas do painel Definir limite 3D e defina o limite otimizado usando também os filtros suave e limpo (Arquivo suplementar, Imagem G). Clique em OK obtendo no painel de medições de objetos 3D diferentes parâmetros, incluindo o volume.
   5. Clique em Exportar para Excel para exportar dados e salvá-los.

7. Análise de dados esferóides

1. Para os cálculos do volume dos esferoides, aproximar a estrutura 3D com um elipsóide prolato, estimando o eixo maior e menor através da projeção 2D conforme mostrado no encarte da Figura 3.
2. Valide a aproximação do elipsóide prolato por meio de uma comparação entre o volume calculado numericamente, conforme mostrado na etapa 6.4 , e a fórmula do volume do elipsóide prolato com b>a=c onde a, b e c são o eixo do elipsóide).
3. Calcular o volume médio de, pelo menos, 10 esferoides e os respectivos desvios-padrão. Se a distribuição de volume do esferóide for normal, aplique o teste Dixon para identificar e rejeitar o valor discrepante. Em seguida, calcule a relação de volume entre as amostras tratadas e as amostras juntamente com a propagação do erro, conforme relatado na Figura 6A.

Resultados

Dox@DDAB-MDs foram desenvolvidos de acordo com o protocolo (Seção 1) conforme descrito esquematicamente na Figura 1. Os MDs obtidos são feitos de uma monocamada de DDAB encapsulando o núcleo DFP (Figura 1A). A carga catiônica do DDAB e o procedimento de sonicação evitam a formação de camadas multilamelares de DDAB empilhadas na interface DFP e água²³.

A micrografia CLSM (Fi...

Discussão

Para melhorar a eficácia das antraciclinas como drogas antitumorais, este trabalho apresenta a formação de gotículas de PFC com casca de DDAB encapsulando a droga quimioterápica doxorrubicina (Dox) e o efeito de tal formulação interagindo com as células de câncer de mama triplo-negativas altamente agressivas, MDA-MB-231.

Construção de DOX@DDAB-MDs
Os MDs carregados com Dox foram formulados pelo método de insonação com um protocolo extremame...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
µ-Placa de Petri	Ibidi	81156	35mm de altura, IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-Decafluoropentano	Sigma-Aldrich	138495-42-8	b.p. 55° C
Placa de cultura de 12 poços	Tubo
15 ml	Falcon	89039-664
Placas de 3D-Petri 12:256	Microtecidos (Sigma-Aldrich)	Z764000-6EA	Pequenas
placas de 3D-Petri 12:81	Microtecidos (Sigma-Aldrich)	Z764019-6EA	Grande
incubadora de cultura de 5%CO2, 37° C	Thermo Scienific		HERAcell 150i
tubo de centrífuga de 50 ml	Falcon	352070
Gabinete de segurança biológica, nível
Calcein	Sigma-Aldrich
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	148504-34-1	solução de estoque 4mM em
DMSO cam sCMOS Andor Zyla 4.2	Andor Instruments
Centrífuga Hettich Universal 320R	Hettich Lab. Tecnologia
DAPI	SIgma-Aldrich
Dimetildioctadecilamônio brometo em pó	Sigma-Aldrich	3700-67-2
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	15-013-CV
Cloridrato de doxorrubicina	Sigma-Aldrich	25316-40-9
DPBS (PBS modificado de Dulbecco)	Corning	21-030-CV	pH 7,4
Etanol 70%	Sigma-Aldrich
EZ-C1 eclíptica digital	Nikon Instruments		Silver versão 3.91
Soro bovino fetal (FBS)	Goniômetro Corning	35-079-CV
BI-200SM	Brookhaven Instruments Corporations
Laser Ar+	Spectra Physics
Laser He-Ne	Melles-Griot
L-Glutammine	Corning	25-005-CI
Mcroscope Nikon Eclipse Ti	Nikon Instruments
MDA-MB 231 linha celular	ATCC
Microsoft Excel	Microsoft
Microplacas leitor Spark	Tecan grupo
NanoZetaSizer ZS	Malvern Instruments LTD
Neubauer melhorou a câmara		718605
software de elementos NIS	Nikon Instruments		AR 4.30
Pen/Strepto	Corning	30-002-CI
Photocorrelacion BI-9000 AT	Brookhaven Instruments Corporations	62927-1
Fotômetro HC120	Brookhaven Instruments Corporations	N° 1275
Pipetadores e pontas, vários tamanhos	Gilson
Propidium Iodide	SIgma-Aldrich
Pipetas sorológicas, vários tamanhos	Corning
Laser de estado sólido	Suwtech Laser	N° 22368
T25 Frascos	Sarstedt	83.3910.002
Frascos T75	Sarstedt	83.3911.002
Tripsina/EDTA 0.05%	EuroClone	ECB3052D
Vibra-Cell VCX-400	Sonics & Materiais, incluindo
Banho-maria			37° O