Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

A actina de proteína citoesquelél está envolvida em múltiplas funções celulares, incluindo suporte estrutural, transporte celular, motilidade celular e divisão. A actina ocorre em equilíbrio em duas formas: actina globular monomérica (G-actin) e ato de fisordenada polimerizada (F-actin). Mudanças rápidas no status de polimerização da actina (interconversão entre suas formas G e F) resultam em rápida montagem de filamentos e desmontagem e fundamentam suas funções regulatórias na fisiologia celular. Actin forma o principal componente da estrutura citoesquelético neuronal e influencia uma ampla gama de funções neuronais^1,2. Note-se que o citoesqueleto actin forma parte integrante da plataforma estrutural dos terminais sinápticos. Como tal, é um dos principais determinantes da morfogênese sináptica e da fisiologia e desempenha um papel fundamental no controle do tamanho, número e morfologia das sinapses^3,4,5. Em particular, a polimerização dinâmica de actina-despomerização é um determinante fundamental da remodelagem sináptica associada à plasticidade sináptica subjacente aos processos de memória e aprendizagem. De fato, tanto as funções pressiná-iânfmáticas (como a liberação neurotransmissor^6,7,8,9,10) quanto as funções postsintálicas (remodelagem dinâmica relacionada à plasticidade^11,12,13,14) dependem criticamente de mudanças dinâmicas no status de polimerização do citoesqueleto actin.

Em condições fisiológicas, os níveis de F-actin são dinamicamente e firmemente regulados através de uma via multimodal envolvendo modificação pós-transacional^4,15,16, bem como proteínas de ligação de actina (ABPs)^4,17. Os ABPs podem influenciar a dinâmica da actina em vários níveis (como iniciar ou inibir a polimerização, induzir ramificações de filamentos, cortar filamentos em peças menores, promover a despomerização e proteger contra a despomerização), e estão em turno sob um rigoroso controle modulatório sensível a vários sinais extra e intracelular^18,19,20. Tais verificações regulatórias em vários níveis ditam uma regulação rigorosa da dinâmica da actina no citoesqueleto sináptico, afinando aspectos pré e postinopticos da fisiologia neuronal, tanto nos estados basais quanto induzidos pela atividade.

Dado os importantes papéis da actina na fisiologia neuronal, não é de surpreender que vários estudos tenham fornecido evidências de alterações na dinâmica da actina como eventos patogênicos críticos ligados a uma ampla gama de distúrbios neurológicos, incluindo neurodegeneração, doenças psicológicas e doenças neurodesenvolvimentares^{3,21,22,23,24,25,26,27}. Apesar da riqueza de dados de pesquisa que apontam para papéis-chave da actina na fisiologia neuronal e na fisiopatologia, no entanto, lacunas significativas ainda permanecem na compreensão da dinâmica da actina, particularmente no citoesqueleto sináptico. Mais estudos de pesquisa são necessários para ter uma melhor compreensão da actina neuronal e suas alterações em condições patológicas. Uma das principais áreas de foco nesse contexto é a avaliação do status de polimerização de actina. Existem kits comerciais baseados em manchas ocidentais (G-Actin/F-Actin in vivo assay bioquímico kit; Cytoskeleton SKU BK037^28,29) e ensaios caseiros para avaliação dos níveis de F-actin⁶. No entanto, como estes requerem isolamento bioquímico de F-actin e G-actin e porque sua quantificação subsequente é baseada em protocolos de imunobloquetação, eles podem ser demorados. Aqui relatamos um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência adaptado de um estudo anterior³⁰ com modificações que podem ser usadas para avaliar tanto os níveis basais de F-actin, como mudanças dinâmicas em sua montagem-desmontagem. Notavelmente, modificamos eficientemente o protocolo original que requer amostras adequadas para um cuvette de 1 mL para o formato atual de placa de 96 poços. O protocolo modificado reduziu significativamente a quantidade de tecido/amostra necessária para o ensaio. Além disso, fornecemos evidências de que o protocolo é adequado não apenas para homogeneizadores de tecido cerebral, mas também frações subcelulares, como terminais sinápticos isolados (sinápttos e sinápticos). Por fim, o ensaio pode ser empregado para tecidos cerebrais de roedores recém-dissecados e amostras cerebrais humanas pós-morte armazenadas a longo prazo. Note-se que, embora o ensaio seja apresentado em um contexto neuronal, ele pode ser adequadamente estendido a outros tipos de células e processos fisiológicos associados a eles.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as normas do Comitê de Ética da Universidade de Otago no Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Protocolo de Ética Nº. AUP95/18 e AUP80/17) e legislatura neozelandesa. Os tecidos cerebrais humanos foram obtidos do Neurological Tissue Bank of Hospital Clínic-IDIBAPS BioBank em Barcelona, Espanha. Todos os protocolos de coleta de tecidos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Clínic, em Barcelona, e o consentimento informado foi obtido das famílias.

1. Preparação de tampões e reagentes

1. Prepare os seguintes buffers para a homogeneização do tecido cerebral e a preparação de fração enriquecida de terminais sinápticos:
   Tampão de homogeneização: 5 mM HEPES, pH 7.4 suplementado com 0,32 M de sacarose
   Tampão de resuspensão: 5 mM Tris, pH 7.4 suplementado com sacarose de 0,32 M
   Tampão de lavagem: 5 mM Tris, pH 8.1
   1,2 M de sacarose
   1,0 M de sacarose
   0,85 M de sacarose
2. Adicione mistura caseira ou comercial de inibidores de protease e fosfatase.
   NOTA: Usamos a versão sem EDTA do mix completo do Inibidor protease (1 comprimido por tampão de 10 mL) e coquetel inibidor de fosfatase IV (1:100; volume: volume).
3. Prepare os seguintes buffers e reagentes para a fixação, permeabilização e vinculação da falooidina:
   Tampão krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 0,1 mM KH₂PO₄, 5 mM NaHCO_3,10 mM de glicose, 20 mM HEPES, pH 7.4
   1 M KCl
   Glutaraldeído 25% (solução de estoque)
   Tampão krebs contendo 0,1 % Triton X-100 e 1 mg/mL NaBH₄
   400x Alexa Fluor 647 Phalloidin em DMSO
   Tampão krebs contendo 0,32 M de sacarose
   50 μM latrunculin A em DMSO (solução de estoque)
   1 M KCl (solução de estoque)
   ATENÇÃO: A falooidina é tóxica (LD₅₀ = 2 mg/kg) e deve ser tratada com cuidado. A inalação de glutaraldeído é tóxica e deve ser manuseada em um capô de fumaça.
4. Armazene os buffers a 4 °C e a faloideína e latrunculin A a -20 °C para armazenamento a longo prazo.
   NOTA: O armazenamento a longo prazo de buffers não é recomendado. O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Homogeneização do tecido cerebral

1. Homogeneize o tecido cerebral de rato criopreservado ou recém-dissecado em 10 volumes de tampão de homogeneização em um tubo de vidroPotter-Elvehjem e pilão no gelo.
   NOTA: A homogeneização ideal é alcançada por 15-20 golpes do pilão à mão para tecidos cerebrais. A homogeneização bem sucedida pode ser confirmada pelo fluxo suave da suspensão através do tubo de vidro. O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Determine a concentração de proteína no homogeneizar usando um ensaio de Bradford³¹.
   NOTA: Ensaios caseiros ou comerciais alternativos para estimativa de proteínas também podem ser usados.
3. Diluir amostras homogeneizadas no tampão krebs a uma concentração de 2-3 mg de proteína/mL em um volume de 50 μL.
   NOTA: Em alguns de nossos experimentos, incubamos homogeneizadores com 2 μM latrunculin A ou DMSO (controles) a 37 °C por 1 h. Para isso, os homogeneizadores são resuspended em 48 μL de buffer Krebs, e 2 μL de 50 μM latrunculin A ou 2 μL de DMSO é adicionado. Além disso, para a imunoblotação, uma pequena quantidade de amostra (10 μg) é coletada após a incubação.
4. Fixar as amostras homogeneizais (seção 5).

3. Preparação de terminais nervosos isolados

1. Preparação de sinástomos
   NOTA: Protocolos alternativos^32,33 para sináttoso também podem ser usados.
   1. Centrífuga cerebral homogeneiza a 1.200 x g por 10 min a 4 °C.
   2. Descarte a pelota, que é a fração nuclear bruta.
   3. Mais centrífuga o supernascido (S1) obtido na etapa 3.1.1 a 12.000 x g para 15 min a 4 °C.
   4. Remova o supernatante (S2), que é a fração citosolica solúvel.
   5. Resuspend a pelota (P2) obtida na etapa 3.1.3, que é a fração sintásica bruta no tampão de resuspensão.
      NOTA: O volume do tampão de ressuspensão depende da quantidade de tecido inicial e da quantidade de pelotas obtida. Por exemplo, quando começa com 150-300 mg de tecidos cerebrais, a pelota obtida pode ser resuspended em 200 μL de tampão de resuspensão.
   6. Carregue os sinapstos brutos resuspendados em um gradiente de sacarose descontínuo feito de volumes iguais de 0,85-1.0-1,2 M de sacarose.
      NOTA: Normalmente usamos 1 mL cada uma da solução de sacarose (para tecido de 150-300 mgs). Isso pode ser alterado de acordo com quantidades maiores de tecido. Gradientes descontínuos podem ser feitos usando uma seringa 25G pressionada contra a parede interna do tubo ultracentrífuga e camadas suaves das camadas de sacarose.
   7. Centrifugar a 85.000 x g por 2 h a 4 °C.
      NOTA: Devido à alta velocidade da centrifugação, é necessário um ultracentrifuge capaz de criar um vácuo para reduzir o aquecimento.
   8. Colete a fração sinapstosômica na interface entre 1,0 e 1,2 M de sacarose usando uma ponta de tubulação de 200 μL.
   9. Lave a fração sinaptosômica com tampão de lavagem gelado por centrifugação a 18.000 x g por 10 minutos a 4 °C.
      NOTA: Para a lavagem, a fração sinaptosômica obtida na interface de 1,0 e 1,2 M de sacarose é coletada em um tubo fresco de 1,5 mL, e um volume igual de tampão de lavagem é adicionado, garantindo a remoção de alta sacarose do meio.
   10. Lave a pelota sinaptosômica novamente com tampão de homogeneização gelada a 12.000 g durante 10 minutos a 4 °C.
   11. Resuspense os sinapstosos no tampão de homogeneização no gelo.
       NOTA: O protocolo pode ser brevemente pausado aqui.
   12. Determine a concentração de proteínas usando um ensaio de Bradford.
   13. Resuspenda os sinapstosmos em tampão krebs a uma concentração de 2-3 mg de proteína/mL em um volume de 50 μL (47,5 μL se os sináceos devem ser despolarizados por KCl; ver seção 4).
       NOTA: Para a resuspensão, a fração sinapstosômica é primeiramente girada em 12.000 x g por 5 min a 4 °C e o supernascido (tampão) é removido. A pelota sinaptosômica é então resuspendida no tampão Krebs por pipetação suave usando uma ponta de tubulação de 200 μL.
   14. Prossiga com a despolarização (seção 4).
2. Preparação de sináticos
   NOTA: Protocolos alternativos^34,35 para sináptos também podem ser usados.
   1. Passe o cérebro homogeneizar através de um filtro de rede pré-molhado de 100 μm de tamanho de poro em um suporte de filtro usando uma seringa de 1 mL.
      NOTA: A pré-motação de todos os filtros é importante para evitar a perda da amostra e deve ser feita usando tampão de homogeneização. Para isso, o tampão de homogeneização é passado através dos filtros no suporte do filtro usando uma seringa de 1 mL até que o buffer flua.
   2. Colete o filtrado (F1) em um tubo pré-refrigerado de 1,5 mL no gelo.
   3. Repita o processo (etapas 3.2.1 e 3.2.2) para a fração F1 para obter o segundo filtrado (F2).
   4. Passe f2 filtrado através de um filtro líquido de 5 μm tamanho de poros.
   5. Colete o filtrado (F3) em um tubo pré-refrigerado de 1,5 mL no gelo.
   6. Centrífuga filtra F3 a 1.500 x g por 10 min a 4 °C.
   7. Resuspend a pelota (sináptogoso) em tampão de Krebs no gelo a uma concentração de 2-3 mg de proteína/mL em um volume de 50 μL (47,5 μL se os sináceos devem ser despolarizados pela KCl; ver seção 4).
      NOTA: O protocolo pode ser brevemente pausado aqui.
   8. Estime a concentração de proteínas usando um ensaio de Bradford.
   9. Prossiga com a despolarização (seção 4).

4. Despolarização mediada por KCl de terminais sinápticos isolados

1. Equilibre os sináceos/sináptosmos a 37 °C por 5-10 min.
2. Estimule os sinápstosmos/sináptorias adicionando KCl para aumentar k extracelular⁺ para 50 mM para 30 s a 37 °C e adicionar o mesmo volume de tampão Krebs ao respectivo conjunto de controle não estimulado.
   NOTA: Por exemplo, adicione 2,5 μL de 1 M KCl aos sinápstoses resuspentados em 47,5 μL de buffer Krebs; e adicionar 2,5 μL de tampão Krebs ao respectivo sinaptosomo de controle não estimulado. Para experimentos em que um grande número de amostras estão envolvidas, proceda com no máximo 2 amostras por vez para que o tempo de despolarização não exceda os 30 s.
3. Finalce a estimulação adicionando glutaraldeído (seção 5).

5. Fixação e mancha de faloideína de amostras

1. Adicione glutaraldeído a amostras homogeneizas/sinapstosômicas/sinapstoneurosomais a uma concentração final de 2,5% para 2-3 min à temperatura ambiente.
   NOTA: Adicionamos 6 μL de solução de glutaraldeído de 25% para que a concentração final de glutaraldeído nas amostras de 50 μL (homogeneizados/sinápitos/sinapontorosos) fosse de cerca de 2,5%. A fixação é crítica e deve ser rápida e, portanto, imediatamente após a adição de glutaraldeído, a amostra deve ser vigorosamente vórticada.
2. Sedimente as amostras a 20.000 x g por 5 min.
3. Remova o supernatante.
   NOTA: Descarte o supernatante em uma capa de fumaça, pois o glutaraldeído é tóxico.
4. Permeabilize a pelota por resuspensão em 100 μL de tampão Krebs contendo 0,1% Triton X-100 e 1 mg/mL NaHB₄ para 2-3 min em temperatura ambiente.
5. Sedimente as amostras a 20.000 x g por 5 min.
6. Remova o tampão de permeabilização.
7. Lave a pelota com 200 μL de tampão Krebs por centrifugação a 20.000 x g por 5 min.
8. Resuspend e colora a pelota com 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (correspondente a 500 μU) em 100 μL de tampão Krebs por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente.
   NOTA: Outras variedades de análogos fluorescentes de faloideína estão disponíveis comercialmente e podem ser substituídas para o ensaio. A concentração de faloidina e o volume total de amostra de incubação podem ter que ser modificados de acordo com a quantidade e o tipo de tecido/amostra que está sendo testado e as condições ideais devem ser padronizadas em conformidade.
9. Centrifugar as amostras manchadas a 20.000 x g por 5 min.
10. Remova a falooidina desvinculada (supernante).
11. Lave a amostra com 200 μL de tampão krebs por centrifugação a 20.000 x g por 5 min.
12. Resuspend em 200 μL de tampão Krebs contendo 0,32 M de sacarose.
    NOTA: O protocolo pode ser brevemente pausado aqui.

6. Análise fluorométrica e dispersão de luz

1. Dispense alexa fluor 647 amostras manchadas de phalloidina em uma placa preta de 96 poços.
2. Meça a intensidade da fluorescência em um comprimento de onda de excitação de 645 nm e um comprimento de onda de emissão de 670 nm em um leitor de placas à temperatura ambiente.
3. Transfira as amostras da placa preta de 96 poços para a placa transparente de 96 poços usando pontas de tubulação de 200 μL.
4. Meça a dispersão de luz em 540 nm para corrigir quaisquer perdas que possam ter ocorrido durante as etapas anteriores de fixação, permeabilização e coloração.
   NOTA: Variações no material biológico retido nas amostras manchadas podem ser mais proeminentes para quantidades menores de material inicial (ver Discussão).
5. Inclua um conjunto de Alexa Fluor 647 Phalloidin no buffer Krebs em diferentes concentrações (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x e 1x correspondente a 25, 50, 125, 175, 250, 375 e 500 μU) para cada lote do ensaio como curva padrão.
   NOTA: Esta é uma etapa opcional e não afeta os resultados do ensaio especialmente quando os níveis de F-actin estão sendo expressos de forma relativa (Seção 7). O protocolo pode ser pausado aqui.

7. Análise de dados

1. A quantidade de F-actin nas amostras é diretamente proporcional à intensidade de fluorescência da faloideina ligada. Expresse em termos absolutos de unidades de faloideína encadernadas calculadas a partir da curva linear do padrão de faloideina marcada.
   NOTA: Como exemplo, ver Figuras 2A-B, 3A, 4A-B e Figura Suplementar 2.
2. Expresse níveis de F-actin como uma fração das amostras de controle.
   NOTA: Como exemplo, consulte figuras 5A-B.

Linearidade do ensaio para avaliação dos níveis de F-actin
Primeiro, foi verificada uma curva padrão para o aumento linear da fluorescência de Alexa Fluor 647 Phalloidin e repetida para cada conjunto de experimentos(Figura 1). Para investigar a faixa linear do ensaio, foram processadas diferentes quantidades de homogeneizadores cerebrais de roedores(Figuras 2A e 2B) e indivíduos humanos pós-morte(Figura 3A e 3B). O ensaio foi encontrado como linear na faixa de 50-200 μg de proteína, conforme avaliado por quantidades de fálica rotulada retidas. A dispersão de luz a 540 nm foi utilizada para confirmar as diferentes quantidades de amostras(Figura 2C e Figura 3C).

Latrunculin, um agente despolimerizador actin reduz a vinculação da fáliceina rotulada
Latrunculin A é conhecido por despolimerizar filamentos actin e reduzir os níveis de F-actin36,37,38,39. Homogeneados de roedores ou tecidos cerebrais humanos foram incubados com 2 μM latrunculin A por 1 hora a 37 °C para despolimerizar filamentos de actina. Os respectivos conjuntos de controle não tratados foram incubados com DMSO durante a mesma duração de 1 hora a 37 °C. O ensaio mediu robustamente a perda dos níveis de F-actin de 95,7 ± 6,6 (média ± SEM) em amostras de controle para 72,0 ± 3,2 (média ± SEM) μU de faloideina amarrada em amostras tratadas com latrunculina em homogeneados cerebrais roedores(Figura 4A). Também foi observada uma redução semelhante (de 83,7 ± 3,9 para 66,9 ± 4,2 μU) na retenção de faloideina rotulada quando homogeneizados de tecidos cerebrais humanos submetidos ao tratamento de latrunculina A(Figura 4B). Notavelmente, os níveis totais de actina, conforme avaliado pela imunoblotação, não alteraram no tratamento com latrunculina A tanto em ratos (Figura Suplementar 1A-B) quanto em homogeneizadores cerebrais humanos(Figura Suplementar 1C-D).

Despolarização de terminais sinápticos isoladosestimula polimerização e formação de filamentos
A despolarização ex vivo de terminais sinápticos isolados tem sido demonstrada como resultado de rápida estimulação da polimerização de actina6,30,40, e esse fenômeno foi utilizado como mais uma confirmação do ensaio aqui relatado. Frações bioquímicas enriquecidas em terminais sinápticos foram preparadas de duas maneiras diferentes; um método de ultracenrifugação baseado em gradiente para obter "sinátulas"41,42,43,44 e um protocolo sequencial baseado em filtração para obter "sinatoneuros"43,45,46. Como o rendimento para este último é maior, usamos para tecidos cerebrais pós-morte humanos, onde as quantidades de tecido são muitas vezes limitantes. Por outro lado, preferimos usar sinapstosomos com maior grau de enriquecimento dos fragmentos sinápticos41 para nossos experimentos de tecido cerebral de ratos.

A despolarização de sinástomos ou sinápitos e estimulação da polimerização da actina foram alcançadas por uma pequena (30 segundos) de aumento em K extracelular+ para 50 mM. A exposição à LCL resultou no aumento da ligação com a faloideina em quase 40% em sinatos cerebrais roedores em comparação com os respectivos controles simulados estimulados(Figura 5A; ver também Figura Suplementar 2A). Um menor (em torno de 20%) mas o aumento consistente também foi observado em sináptos humanos tratados com LCL (Figura 5B; ver também Figura Suplementar 2A). Esses experimentos validam a robustez de nosso ensaio na determinação de alterações nos níveis de F-actin em amostras de tecido cerebral, incluindo terminais sinápticos isolados.

Figura 1. Curva padrão para fluorescência de Alexa Fluor 647 Phalloidin.  A linearidade da emissão de fluorescência de diferentes quantidades (25-500 μU) de fhalloidina rotulada foi confirmada por espectroscopia de fluorescência a uma excitação de 645 nm e emissão de 670 nm (R2 = 0,9942). Os dados são representados como média ± SEM (n=3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Linearidade da fhalloidina ligando-se a homogeneizadores de células inteiras do tecido cerebral de rato.  (A) Foi avaliada a ligação da falooidina a diferentes quantidades de homogeneizadores (50-300 μg de proteína). (B) A ligação foi linear na faixa de 50-200 μg de proteína (R2 = 0,9602). (C) A dispersão a 540 nm foi utilizada para confirmar diferentes quantidades das amostras (R2 = 0,8319). Os dados são representados como média ± SEM (n=4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. A faloidina liga-se a homogeneizadores de células inteiras do tecido cerebral humano pós-morte.  (A) A retenção de falooidina em uma gama de quantidades de homogeneizadores (50-300 μg de proteína) foi avaliada. (B) A ligação com a faloideina foi encontrada linear na faixa de 50-200 μg de proteína (R2 = 0,8832). (C) A dispersão a 540 nm confirmou as quantidades variadas das amostras (R2 = 0,9730). Os dados são representados como média ± SEM (n=4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Efeitos da latrunculina A nos níveis de A-actin.  O tratamento de homogeneizações cerebrais com o agente despolimerizador de actina Latrunculin A (2 μM, 1 h a 37°C) resultou em diminuição significativa nas quantidades de filamentos de actina em comparação com as respectivas amostras de controle tratadas simuladas, avaliadas pela retenção de fápio rotulado tanto em roedor (p = 0,0034; emparelhado t-testede duas caudas do aluno) (A) e tecidos humanos pós-morte (p = 0,0011; emparelhado t-teste de duascaudas) (B). Os dados são representados como ± MÉDIOS (n=6 pares). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Efeitos da despolarização mediada por KCl em quantidades de F-actin em terminais sinápticos isolados.  (A) Incubação de sinápstoses do cérebro de rato com 50 mM KCl para 30 s a 37°C estimulada polimerização de actina que resultou em um aumento na ligação de faloideina (p = 0,0014; emparelhado teste t-tdo aluno de duas caudas). (B) Um aumento menor também foi observado na fração sináptonista dos tecidos cerebrais humanos pós-morte (p = 0,014; emparelhado t-testedo aluno de duas caudas). Os dados são representados como ± MÉDIOS (n=6 pares). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1. Efeitos da latrunculina A nos níveis totais de actina.  Os homogeneizadores cerebrais foram incubados com latrunculina A (2 μM, 1 h a 37°C) ou igual volume de DMSO (1 h a 37°C). Foram coletados 10 μg de proteína por amostra (latrunculin A tratado e controles tratados com mock- treated DMSO) antes da fixação. Os níveis totais de actina foram avaliados por imunoblotação. Manchas representativas são mostradas para homogeneizadores cerebrais de ratos (A) e humanos(C). Latrunculin A não alterou os níveis totais deactin em ambos os ratos (B; p = 0,40; emparelhado t-teste do aluno de duas caudas) e humano(D; p = 0,42; emparelhado t-testedo aluno de duas caudas). Os dados são representados como média ± SEM (n=3 pares). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2. Efeitos da despolarização mediada por KCl nos níveis de F-actin em sinátutos de ratos e sinapontorosos humanos.  (A) Incubação de sinápstoses do cérebro de rato com 50 mM KCl (30 s a 37 °C) estimulada polimerização deactina e um consequente aumento na ligação de faloideina (p = 0,0019; emparelhado t-teste do aluno de duas caudas). (B) O aumento da retenção de falooidina também foi observado na fração sinatoneurosomal humana despolarizada pela LCI em comparação com os respectivos controles não estimulados (p = 0,015; emparelhado t-testedo aluno de duas caudas). Os dados são representados como ± MÉDIOS (n=6 pares). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não têm nada a revelar.