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Artigo de método

Vitrificação de Oócitos Maduros In Vitro coletados de ovários adultos e prepubertais em ovelhas

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DOI:

10.3791/62272

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10 de julho de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, University of Sassari

Neste artigo

Resumo

O protocolo visa fornecer um método padrão para a vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e juvenis. Inclui todos os passos desde a preparação dos meios de amadurecimento in vitro até a cultura pós-aquecimento. Os oócitos são vitrificados na fase MII usando o Cryotop para garantir o volume essencial mínimo.

Resumo

Na pecuária, sistemas de produção de embriões in vitro podem ser desenvolvidos e sustentados graças ao grande número de ovários e oócitos que podem ser facilmente obtidos de um matadouro. Ovários adultos sempre carregam vários folículos antrais, enquanto em doadores pré-pubertal o número máximo de oócitos está disponível às 4 semanas de idade, quando os ovários carregam um número máximo de folículos antral. Assim, cordeiros de 4 semanas são considerados bons doadores, mesmo que a competência de desenvolvimento dos oócitos pré-púricionais seja menor em comparação com sua contraparte adulta.

Pesquisas básicas e aplicações comerciais seriam impulsionadas pela possibilidade de criopreservar oócitos vitrificados obtidos com sucesso tanto de doadores adultos quanto pré-púrias. A vitrificação do oócito coletado de doadores pré-púrias também permitiria encurtar o intervalo de geração e, assim, aumentar o ganho genético em programas de reprodução. No entanto, a perda do potencial de desenvolvimento após a criopreservação torna os oócitos mamíferos provavelmente um dos tipos de células mais difíceis de criopreservar. Entre as técnicas de criopreservação disponíveis, a vitrificação é amplamente aplicada aos oócitos animais e humanos. Apesar dos recentes avanços na técnica, exposições a altas concentrações de agentes crioprotetores, bem como lesões arrepiantes e estresse osmótico ainda induzem várias alterações estruturais e moleculares e reduzem o potencial de desenvolvimento dos oócitos mamíferos. Aqui, descrevemos um protocolo para a vitrificação de oócitos de ovelhas coletados de doadores juvenis e adultos e amadurecidos in vitro antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde oócito na maturação in vitro até o período de vitrificação, aquecimento e incubação pós-aquecimento. Os oócitos vitrificados na fase MII podem de fato ser fertilizados após o aquecimento, mas eles precisam de tempo extra antes da fertilização para restaurar os danos devido aos procedimentos criopreservadores e aumentar seu potencial de desenvolvimento. Assim, as condições e o tempo da cultura pós-aquecimento são passos cruciais para a restauração do potencial de desenvolvimento do oócito, especialmente quando o oócito é coletado de doadores juvenis.

Introdução

O armazenamento a longo prazo dos gametas femininos pode oferecer uma ampla gama de aplicações, como melhorar a reprodução animal doméstica por meio de programas de seleção genética, contribuir para preservar a biodiversidade através do programa de conservação de espécies de animais selvagens ex-situ, e impulsionar pesquisas e aplicações em biotecnologia in vitro graças à disponibilidade de oócitos armazenados a serem incorporados em programas de produção de embriões in vitro ou transplante nuclear1,2,3. A vitrificação de oócitos juvenis também aumentaria o ganho genético, encurtando o intervalo de geração nos programas de reprodução4. A vitrificação por resfriamento ultrarrápido e aquecimento de oócitos é atualmente considerada uma abordagem padrão para oócitos de pecuária criopreservação5. Em ruminantes, antes da vitrificação, os oócitos são geralmente amadurecidos in vitro, após a recuperação de folículos obtidos de ovários derivados do matadouro2. Ovários adultos, e especialmente pré-púbertos4,6, podem de fato fornecer um número praticamente ilimitado de oócitos para serem criopreservados.

No gado, após a vitrificação e oocito vitrificação e aquecimento, os rendimentos do blastocisto em >10% têm sido comumente relatados por vários laboratórios durante a última década3. No entanto, em pequenos ruminantes a vitrificação de oócitos ainda é considerada relativamente nova para os oócitos juvenis e adultos, e um método padrão para vitrificação de oócitos de ovelhas permanece a ser estabelecido2,5. Apesar dos avanços recentes, o oócito vitrificado e aquecido apresenta de fato várias alterações funcionais e estruturais que limitam seu potencial de desenvolvimento7,8,9. Assim, poucos artigos relataram o desenvolvimento de blastocistos em 10% ou mais em oócitos de ovelhas vitrificadas/aquecidas2. Várias abordagens têm sido investigadas para reduzir as alterações acima mencionadas: otimização da composição das soluções de vitrificação e descongelamento10,11; experimentando o uso de diferentes dispositivos criográficos8,12,13; e a aplicação de tratamentos específicos durante a maturação in vitro (IVM)4,14,15 e/ou durante o tempo de recuperação após o aquecimento6.

Aqui descrevemos um protocolo para a vitrificação de oócitos de ovelhas coletados de doadores juvenis e adultos e amadurecidos in vitro antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde oócito na maturação in vitro até o período de vitrificação, aquecimento e cultura pós-aquecimento.

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Protocolo

O protocolo animal e os procedimentos implementados descritos abaixo estão de acordo com as diretrizes éticas vigentes na Universidade de Sassari, em conformidade com a Diretiva da União Europeia 86/609/CE e a recomendação da Comissão das Comunidades Europeias 2007/526/CE.

1. Preparação de mídia para manipulação de oócitos

  1. Prepare o meio para o transporte de ovários coletados suplementando o soro fisco tamponado de Fosfato de Dulbecco com penicilina de 0,1 g/L e estreptomicina de 0,1 g/L (PBS).
  2. Prepare o meio para coleta e maturação de oócitos diluindo 9,5 g de Tissue Culture Medium (TCM) 199 em pó com 1 L de água Milli-Q suplementada com penicilina (0,1%) e estreptomicina (0,1%).
    1. Após a diluição, filtre 100 mL de médio e armazene-o a 4 °C como Stock Maturation Medium (SMM) a ser usado por uma semana.
    2. Prepare o meio de coleta (CM) suplementando os 900 mL restantes com HEPES de 25 mM, bicarbonato de 0,36 g/L e 0,1% (w/v) álcool polivinyl (PVA) (pH 7,3, osmolalidade 290 mOsm/kg).
  3. Prepare o meio de maturação com SMM suplementado com 0,021 g/L bicarbonato, 10% soro de ovelhas tratado a calor, 1 UI/mL FSH, 1 UI/mL LH, 100 μL de cisteamina e 8 mg/mL de piruvato.
    NOTA: O meio de maturação em um volume de 10 mL deve ser incubado em condições padrão (em uma atmosfera máxima umidificada a 39 °C em 5% de CO2 no ar) por pelo menos 4h antes do uso.
  4. Prepare o meio base (BM) para manipulação de oócito após a maturação in vitro, consistindo em PBS sem Ca++ e Mg++, suplementado com soro de bezerro fetal de 20% (FCS).

2. Coleta e maturação de oócitos

  1. Recuperar os oócitos de ovários juvenis (30-40 dias de idade, peso corporal de 6-10 kg) e ovários adultos.
  2. Transporte os ovários coletados do matadouro comercial para o laboratório dentro de 1-2 h na PBS a 27 °C.
  3. Depois de lavar em meio fresco PBS, corte os ovários em CM usando uma micro-lâmina para liberar o conteúdo do folículo.
  4. Sob um exame estereomicroscópio com ampliação de 60x, selecione complexos cumulus-oócitos (COCs) para maturação in vitro, escolhendo aqueles com 4-10 camadas de células de granulosa, oócito com um citoplasma uniforme, distribuição homogênea de gotículas lipídicas no citoplasma e com o diâmetro externo de cerca de 90 μm (média).
  5. Lave os COCs selecionados três vezes em CM e, finalmente, transfira-os em meio de maturação.
    NOTA: Para osócitos juvenis, para melhorar a sobrevida após a vitrificação, suplemente o meio de maturação com trehalose de 100 μM.
  6. Para maturação in vitro, transfira 30-35 COCs em 600 μL de meio de maturação em placas de Petri de quatro poços, cobertas com 300 μL de óleo mineral e incuba-los para 22 (oócitos adultos)/24 (oócitos juvenis) h em 5% CO2 no ar a 39 °C.
  7. Após a maturação in vitro, denude COCs de células cumulus por pipetação suavemente. Após o exame sob um estereótipo com ampliação de 60x, selecione apenas aqueles que mostram a extrusão no primeiro corpo polar e, portanto, no estágio metafase II (MII), para vitrificação.

3. Procedimentos de coleta de sêmen, congelamento e descongelamento

  1. Prepare o meio base para criopreservação de sêmen consistindo em extensor de carneiro (200 mM Tris; ácido cítrico de 70 mM; 55 mM de frutose; pH 7.2, osmolalidade 300 mOsm/kg) suplementado com gema de ovo 20% (v/v).
  2. Recolher o sêmen somente durante a estação de criação de ovinos (outubro a novembro).
  3. Obter ejaculações por vagina artificial de carneiros adultos (idades de 2 a 5 anos), mantidos em ambiente ao ar livre e alimentados com uma ração de manutenção de peso vivo. Mantenha os carneiros isolados em canetas separadas, mas com contato visual entre si.
  4. Repita a coleta de sêmen uma por semana durante toda a estação de reprodução para obter pelo menos 8 ejaculações de cada macho.
  5. Transporte as amostras de sêmen para o laboratório em temperatura ambiental dentro de 5 minutos após a coleta e processo imediato. Acumule as ejaculações de dois ou três carneiros e avalie a espectrofotometria da concentração de esperma.
  6. Após a piscina, diluir as ejaculações até 400 x 106 espermatozoides/mL com meio base para criopreservação de sêmen suplementada com 4% de glicerol. Em seguida, esfrie o sêmen diluído a 4 °C durante um período de 2h e equilibre-o por 20 minutos antes de congelar.
  7. Congele as amostras de sêmen em forma de pelotas (0,25 mL) em gelo seco e, em seguida, mergulhe-as em nitrogênio líquido.
  8. Para descongelar, coloque a pelota em um falcão de vidro esterilizado e mergulhe-a em um banho de água por 20 s a 39 °C.

4. Fertilização in vitro e cultura de embriões

  1. Prepare os estoques para a constituição do fluido oviductal sintético (SOF).
    1. Preparar estoque A: 99,4 mL de água milliq; 6,29 g de NaCl; 0,534 g de KCl; 0,161 g de KH2PO4; 0,182 g de MgSO4 ·7H2O; e 0,6 mL de Lactato de Sódio. Mantenha-se a 4 °C por até 3 meses.
    2. Preparar estoque B: 10 mL de água milliq; 0.210 g de NaHCO3; e 2-3 g de Phenol Red. Mantenha-se a 4 °C por 1 mês.
    3. Preparar estoque C: 10 mL de água milliq; e 0,051 g de piruvato de sódio. Mantenha-se a 4 °C por 1 mês.
    4. Preparar estoque D: 10 mL de água milliq; e 0,262 g de CaCl2 2H2O. Mantenha-se a 4 °C por 1 mês.
    5. Prepare 10 mL de SOF consistindo de 7.630 mL de água MilliQ, 1 mL de Estoque A, 1 mL de Estoque B, 0,07 mL de Estoque C e 0,7 mL de estoque D.
    6. Prepare o meio de fertilização in vitro (FIV): SOF suplementado com 2% de soro de ovelhas estrous tratados a calor, heparina de 10 μg/mL e hipoutarina de 1 μg/mL (osmolalidade 280-290 mOsm/kg).
      NOTA: O meio de FIV em um volume de 10 mL deve ser incubado em condições padrão (em uma atmosfera máxima umidificada a 39 °C em 5% DE CO2, 5% O2 e 90% N2) pelo menos 4 horas antes do uso.
  2. Transfira alíquotas de sêmen congelada/descongelada em um tubo cônico de vidro esterilizado abaixo de 1,5 mL de meio de FIV aquecido e incuba-os por 15 min a 39 °C em uma atmosfera umidificada a 5% de CO2 no ar.
  3. Após a incubação, os espermatozoides motil nadam em direção à porção apical da coluna líquida. Colete a camada superior e observe para avaliação de motilidade do esperma.
    NOTA: Os parâmetros de motilidade do esperma devem ser avaliados utilizando-se um sistema de análise de esperma assistido por computador (CASA) com as seguintes configurações: 25 quadros adquiridos para evitar a sobreposição de faixas de espermatozoides, contraste mínimo 10, velocidade mínima de 30 μm/s e motilidade progressiva > retidão de 80%. Este sistema tem uma configuração específica para avaliação de esperma de carneiro. Para cada amostra, 5 μL subsample de suspensão de esperma são carregados em uma câmara de análise pré-aquecida com uma profundidade de 10 μm. A motilidade do esperma é avaliada a 37 °C a 40x usando um microscópio de contraste de fase e um mínimo de 500 espermatozoides por subsampleção deve ser analisado em pelo menos quatro diferentes campos microscópicos. Foi avaliado o percentual de espermatozoides motile total e progressivo. Para a FIV, o percentual de espermatozoides motile progressivo deve ser de ≥ 30%.
  4. Diluir o espermatozoide derivado de motil derivado em 1 x 106 concentração final de espermatozoides/mL e co-incuba-los com oócitos MII em 300 μL de fiv médio coberto com óleo mineral em placas de Petri de quatro poços.
  5. Após 22 h de transferência os zigotes presuntivos em pratos petri de quatro poços contendo SOF suplementado com 0,4% de albumina de soro bovino e aminoácidos essenciais e não essenciais na concentração oviductal, conforme relatado por16 sob óleo mineral e cultural-los em condições padrão até o estágio blastocísta.
  6. Em 22-, 26-e 32-h pós-inseminação, regise o número de oócitos cerrados, mostrando dois blastomeres distintos, pelo exame sob um estereomicroscópio com ampliação de 60x.
  7. Observe os embriões diariamente a partir do quinto ao nono dia de cultura e os blastocistos recém-formados devem ser registrados pelo exame sob um estereoscópio com ampliação de 60x.

5. Vitrificação e aquecimento de Oócitos

NOTA: Realize a vitrificação seguindo o método de volume essencial mínimo (MEV) utilizando criotops do dispositivo17.

  1. Equilibre um grupo de cinco oócitos a 38,5 °C por 2 min em BM. O uso de BM garante baixa concentração de cálcio ([Ca2++] 2,2 mg/dL)10.
  2. Desidratar os oócitos com uma solução de equilíbrio de 3 minutos contendo 7,5% (v/v) sulfóxido de dimetil (DMSO) e 7,5% (v/v) glicol de etileno (EG) em BM.
  3. Transfira os oócitos para a solução de vitrificação contendo 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG e 0,5 M de trehalose em BM antes de carregá-los em um dispositivo criotop e ingô-los diretamente em nitrogênio líquido dentro de 30 s.
  4. Para aquecer a uma temperatura biológica, transfira o conteúdo de cada dispositivo de vitrificação de nitrogênio líquido para gotas de 200 μL de 1,25 M de trehalose em BM por 1 min a 38,5 °C, e mexa suavemente para facilitar a mistura.
  5. Para promover a remoção de crioprotetores intracelulares, transfira oócitos stepwise em 200 μL gotas de soluções de trehalose decrescentes (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M trehalose em BM) para 30 s a 38,5 °C antes de ser equilibrado por 10 min a 38,5 °C em BM.

6. Avaliação da qualidade do oócito pós-aquecimento

  1. Após o aquecimento, incubar os oócitos por 6h em PBS sem Ca++ e Mg++ mais 20% FCS (BM) em 5% de CO2 no ar a 38,5 °C.
    NOTA: A capacidade oócito de restaurar características biológicas e estruturais após a vitrificação é em relação às espécies e classes de oócitos usados.
  2. Uma vez que a capacidade oócito de recuperar danos criopreservadores é dependente do tempo, avalie a qualidade do oócito em diferentes pontos de tempo da cultura in vitro (0h, 2h, 4h, 6h) após o aquecimento, para definir a janela de tempo ideal para fertilização oócica.
    NOTA: No oócito de ovelhas adultas, o tempo ideal é 4h após o aquecimento; para oócito prepubertal, o tempo ideal é 2 h pós-aquecimento.

7. Avaliação de sobrevivência de Oócito

  1. Imediatamente após o aquecimento e para cada ponto de tempo da cultura pós-aquecimento, avalia morfologicamente osócitos usando um microscópio invertido com ampliação de 100x.
    NOTA: Os oócitos com alterações estruturais, como citoplasma fraco, dano zona pellucida e/ou membrana devem ser classificados como degenerados.
  2. Valide a avaliação da integridade da membrana usando uma coloração fluorescente dupla diferencial.
  3. Incubar os oócitos em 2 mL de BM contendo iodeto de propídio (PI; 10 μg/mL) e Hoechst 33342 (10 μg/mL) por 5 min em 5% CO2 no ar a 38,5 °C.
  4. Depois de lavar três vezes em BM fresco, observe os oócitos sob um microscópio fluorescente usando um filtro de excitação de 350 nm e emissão de 460 nm para Hoechst 33342 e um filtro de excitação de 535 nm e emissão de 617 nm para PI.
    NOTA: Oócitos com membrana intacta podem ser reconhecidos pela fluorescência azul do DNA colorido com Hoechst 33342. Oócito com membranas danificadas mostram uma fluorescência vermelha devido à coloração de DNA com PI.

8. Avaliação da atividade mitocondrial e dos níveis intracelulares ROS por microscopia de varredura a laser confocal

  1. Prepare a sonda MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).
    1. Diluir o teor de 1 frasco (50 μg) com 1 mL de DMSO para obter uma solução de 1 mM. Mantenha o frasco diluído em nitrogênio líquido.
    2. Diluir a solução 1 mM com o DMSO para obter a solução de estoque de 100 μM e armazená-la a -80 °C no escuro.
  2. Prepare a sonda diacetato de 2′,7'-diclorodihidrofluoresceína (H2DCF-DA).
    1. Diluir o H2DCF-DA em 0,1% de pyrrolidone polivinyl (PVA)/PBS para obter a primeira solução de 100 mM. Mantenha a solução a -80 °C no escuro .
    2. Diluir a primeira solução em PVA/PBS de 0,1% para obter a solução de estoque de 100 μM. Armazená-lo a -20 °C no escuro.
  3. Prepare o meio de montagem (MM): para 10 mL de MM, adicione 5 mL de glicerol, 5 mL de PBS e 250 mgs de azida de sódio. Armazená-lo a -20 °C até usar.
  4. Incubar os oócitos por 30 min a 38,5 °C em BM com 500 nM MT-Red (solução de estoque: 100 μM em DMSO).
  5. Após a incubação com a sonda MT-Red, lave os oócitos três vezes em BM e incubar por 20 minutos na mesma mídia contendo 5 μM H2DCF-DA (solução de estoque: 100 μM em BM).
  6. Após a exposição às sondas, lave os oócitos em BM e fixe em 2,5% glutaraldeído/PBS por pelo menos 15 min.
  7. Após a fixação, lave os oócitos três vezes em BM e monte em lâminas de vidro em uma gota de 4 μL de MM com 1 mg/mL Hoechst 33342 usando almofadas de cera para evitar a compressão das amostras.
  8. Armazene slides a 4 °C no escuro até a avaliação.
  9. Realize a análise de seções imunolabelladas com um microscópio de varredura a laser confocal. O microscópio é equipado com lasers Ar/He/Ne, usando um objetivo de óleo de 40/60x. Analise as seções por excitação sequencial.
  10. Para avaliação mitocondrial, observe as amostras com um laser multifotônio para detectar MT-Red (exposição: 579 nm; emissão: 599 nm).
  11. Use um raio laser de íons de argônio a 488 nm e o filtro B-2 A (exposição de 495 nm e emissão de 519 nm) para apontar o diclorofluoresceína (DCF)18.
  12. Em cada oócito individual, meça as intensidades de fluorescência MT-Red e DCF no plano equatorial19.
  13. Manter parâmetros relacionados à intensidade da fluorescência em valores constantes durante todas as aquisições de imagem (energia laser 26%, Configurações sequenciais 1: PMT1 ganhar 649-PMT2 ganho 482; Configuração sequencial 2: PMT1 ganhar 625-PMT2 ganho 589; compensação 0; tamanho do pinhole: 68).
  14. Realize a análise quantitativa da intensidade da fluorescência utilizando o pacote de software de análise de imagem Leica LAS AF Lite, seguindo os procedimentos padronizados até20.
  15. Capture as imagens uma vez, movendo-se no eixo Z, até chegar ao plano equatorial.
  16. Para cada foto, transformar-se em escala cinza e desligar o canal 1 (relacionado ao azul Hoechst) foi desligado. Em seguida, desenhe manualmente uma região de interesse (ROI) em uma área circunscrita, que fica ao redor do eixo meiotic.
    NOTA: O software pode ler automaticamente o valor médio do pixel no canal 2 (FITC), subtraindo o valor do plano de fundo a partir dele.
  17. Regissuas médias dos pixels e submeta-se para análise estatística.

9. Análises Estatísticas

  1. Analise as seguintes diferenças: taxas de sobrevivência em oócitos juvenis vs adultos, taxas de sobrevivência e competência de desenvolvimento no controle e oócitos juvenis tratados com trehalose, taxas de sobrevivência e ativação partenogenética e competência de desenvolvimento de oócitos adultos vitrificados com diferentes meios de concentração de cálcio, taxas de fertilização e produção de embriões em oócitos juvenis vitrificados com baixa ou alta concentração de cálcio, fenótipos mitocondrias ativos em oócitos vitrificados juvenis durante diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento e taxas de ativação partenogenética entre oócitos vitrificados adultos e juvenis usando o teste quadrado chi.
  2. Analise a taxa de decote e a saída de embriões em oócitos adultos vitrificados durante diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento, intensidade de fluorescência da atividade mitocondrial e níveis intracelulares ROS em oócitos vitrificados juvenis durante diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento pela ANOVA após análise para homogeneidade de variância pelo teste de Levene. Use um teste de tukey pós-hoc para destacar diferenças entre e entre grupos.
  3. Realizar análises estatísticas utilizando o programa de software estatístico e considerar uma probabilidade de P < 0,05 ser o nível mínimo de significância. Todos os resultados são expressos como ± S.E.M.

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Resultados

A criotolerância do oócito de doadores juvenis é menor em comparação com as adultas. O primeiro efeito observado é uma menor taxa de sobrevivência pós-aquecimento em comparação com os oócitos adultos (Figura 1A; χ2 teste P<0,001). Os oócitos juvenis apresentaram menor integridade da membrana após o aquecimento(Figura 1B). O uso de trehalose no meio de maturação destinava-se a verificar se esse açúcar poderia reduzir os crioinjuutos em oócitos juven...

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Discussão

A criopreservação de oócito em animais domésticos pode permitir não apenas a conservação a longo prazo dos recursos genéticos femininos, mas também avançar no desenvolvimento de biotecnologias embrionárias. Assim, o desenvolvimento de um método padrão de vitrificação oócito beneficiaria tanto a pecuária quanto o setor de pesquisa. Neste protocolo, é apresentado um método completo para vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e pode representar um ponto de partida sólido para o desenvolvimento de um sistema eficiente de...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores não receberam nenhum financiamento específico para este trabalho. A professora Maria Grazia Cappai e a Dra.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2′,7′-Diclorofluorescina diacetatoSigma-AldrichD-6883
Albumina fração bovina V, livre de proteaseSigma-AldrichA3059
Bisbenzimida H 33342 tricloridrato (Hoechst 33342)Sigma-Aldrich14533
Cloreto de cálcio (CaCl2 2H20)Sigma-AldrichC8106
Ácido cítricoSigma-AldrichC2404
Leica Microsystems GmbH, WetzlarTCS SP5 DMI 6000CS
Cryotop KitazatoBiological Technologies
CisteaminaSigma-AldrichM9768
D- (-) FrutoseSigma-AldrichF0127
D (+) Trealose desidratadaSigma-AldrichT0167
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco Fosfato Tampolado SalinoSigma-AldrichD8537
Gema de ovoSigma-AldrichP3556
Etilenoglicol (EG)Sigma-Aldrich324558
FSHSigma-AldrichF4021
Ácido glutâmicoSigma-AldrichG5638
GlutaraldeídoSigma-AldrichG5882
GlicerolSigma-AldrichG5516
GlicinaSigma-AldrichG8790
HeparinaSigma-AldrichH4149
HEPESSigma-AldrichH4034
HipoutarinaSigma-AldrichH1384
Microscópio invertidoDiaphot, Nikon
L-AlaninaSigma-AldrichA3534
L-ArgininaSigma-AldrichA3784
L-AsparaginaSigma-AldrichA4284
Ácido L-aspárticoSigma-AldrichA4534
L-cisteínaSigma-AldrichC7352
L-cistinaSigma-AldrichC8786
L-GlutaminaSigma-AldrichG3126
LHSigma-AldrichL6420
L-HistidinaSigma-AldrichH9511
L-IsoleucinaSigma-AldrichI7383
L-LeucinaSigma-AldrichL1512
L-lisinaSigma-AldrichL1137
L-metioninaSigma-AldrichM2893
L-ornitinaSigma-AldrichO6503
L-fenilalaninaSigma-AldrichP5030
L-prolinaSigma-AldrichP4655
L-serinaSigma-AldrichS5511
L-TirosinaSigma-AldrichT1020
L-ValinaSigma-AldrichV6504
Cloreto de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O)Sigma-AldrichM2393
Câmara de Contagem MaklerSefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.
Médio 199Sigma-AldrichM5017
Óleo mineralSigma-AldrichM8410
MitoTracker Red CM-H2XRosThermoFisherM7512
Soro de bezerro recém-nascido inativado por calor (FCS)Sigma-AldrichN4762
Penicilina G sal de sódioSigma-AldrichP3032
Fenol VermelhoSigma-AldrichP3532
Álcool polivinílico (87-90% hidrolisado, peso médio mol 30.000-70.000)Sigma-AldrichP8136
Cloreto de Potássio (KCl)Sigma-AldrichP5405
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
Iodeto de propídioSigma-AldrichP4170
Soro de ovelhaSigma-AldrichS2263
Azida de sódioSigma-AldrichS2202
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Xarope de solução de dl-lactato de sódioSigma-AldrichL4263
Piruvato de sódioSigma-AldrichP2256
Analisador de classe de espermatozóidesMicroptic S.L.S.C.A. v 3.2.0
Software estatístico Minitab 18.12017 Minitab
Microscópio estéreoOlimpusSZ61
Sulfato de estreptomicinaSigma-AldrichS9137
TaurinaSigma-AldrichT7146
TRISSigma-Aldrich15,456-3
Microscópio confocal de varredura a laser Medical

Referências

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