Protocolos digitais de PCR digital de gotícula de transcrição reversa em duas etapas para detecção e quantificação de SARS-CoV-2

Raphael Nyaruaba; Xiaohong Li; Caroline Mwaliko; Changchang Li; Matilu Mwau; Nelson Odiwour; Elishiba Muturi; Caroline Muema; Junhua Li; Junping Yu; Hongping Wei

doi:10.3791/62295

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Artigo de método

Protocolos digitais de PCR digital de gotícula de transcrição reversa em duas etapas para detecção e quantificação de SARS-CoV-2

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DOI:

10.3791/62295

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31 de março de 2021

Raphael Nyaruaba¹^,²^,³ , Xiaohong Li¹ , Caroline Mwaliko²^,³^,⁴ , Changchang Li¹ , Matilu Mwau⁵ , Nelson Odiwour¹^,²^,³ , Elishiba Muturi¹^,²^,³ , Caroline Muema¹^,²^,³ , Junhua Li¹ , Junping Yu¹ , Hongping Wei¹

¹Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, ²International College, University of Chinese Academy of Sciences, ³Sino-Africa Joint Research Center, ⁴CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, ⁵Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

Neste artigo

Resumo

Este trabalho resume as etapas no desenvolvimento de ensaios diferentes para a detecção de SARS-CoV-2 usando um sistema ddPCR de duas cores. As etapas são elaboradas e notas foram incluídas sobre como melhorar os ensaios e o desempenho do experimento. Estes ensaios podem ser usados para aplicações SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Resumo

O diagnóstico da pandemia SARS-CoV-2 em curso é uma prioridade para todos os países em todo o mundo. Atualmente, o PCR quantitativo de transcrição reversa (RT-qPCR) é o padrão ouro para o diagnóstico de SARS-CoV-2, pois nenhuma solução permanente está disponível. Por mais eficaz que essa técnica possa ser, pesquisas têm surgido mostrando suas limitações na detecção e diagnóstico, principalmente quando se trata de alvos pouco abundantes. Em contraste, o PCR digital de gotículas (ddPCR), uma tecnologia emergente recente com vantagens superiores sobre o qPCR, mostrou superar os desafios do RT-qPCR no diagnóstico de SARS-CoV-2 a partir de amostras alvo pouco abundantes. Prospectivamente, neste artigo, os recursos do RT-ddPCR são expandidos ainda mais, mostrando etapas sobre como desenvolver ensaios simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex usando um sistema de detecção de duas cores. Usando primers e sondas que visam locais específicos do genoma do SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 e RBD2), o desenvolvimento destes ensaios mostra-se possível. Além disso, protocolos detalhados passo a passo, notas e sugestões sobre como melhorar o fluxo de trabalho de ensaios e analisar dados são fornecidos. A adaptação desse fluxo de trabalho em trabalhos futuros garantirá que o número máximo de destinos possa ser detectado de forma sensível em uma pequena amostra, melhorando significativamente o custo e a taxa de transferência da amostra.

Introdução

A reação em cadeia da polimerase (PCR), uma técnica bem reconhecida, passou por diversas transformações desde seu advento para se tornar uma poderosa técnica capaz de fornecer respostas à pesquisa de ácidos nucleicos. Essas transformações têm sido um constante aprimoramento da antiga técnica. Essas transformações podem ser resumidas em três gerações¹. A primeira geração é a PCR convencional que se baseia na eletroforese em gel para quantificar e detectar alvos amplificados. A segunda geração é a PCR quantitativa em tempo real (qPCR) que pode detectar amostras em tempo real e contar com uma curva padrão para quantificar diretamente os alvos em u....