Usando um método de auto-organização, desenvolvemos um protocolo com a adição de COCO que poderia aumentar significativamente a geração de fotorreceptores.
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Artigo de método
Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O transplante de células da retina é uma abordagem terapêutica promissora, que poderia restaurar a arquitetura da retina e estabilizar ou mesmo melhorar as capacidades visuais da retina degenerada. No entanto, o progresso na terapia de reposição celular atualmente enfrenta os desafios de exigir uma fonte pronta para uso de retinas humanas padronizadas e de alta qualidade. Portanto, um protocolo fácil e estável é necessário para os experimentos. Aqui, desenvolvemos um protocolo otimizado, baseado em um método de auto-organização com o uso de moléculas exógenas e reagente A, bem como excisão manual para gerar os organoides tridimensionais da retina humana (RO). As RO derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) expressam marcadores específicos para fotorreceptores. Com a adição de COCO, um antagonista multifuncional, a eficiência de diferenciação de precursores e cones fotorreceptores é significativamente aumentada. O uso eficiente deste sistema, que tem os benefícios de linhagens celulares e células primárias, e sem os problemas de fornecimento associados a este último, poderia produzir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Assim, a diferenciação de PSCs para RO fornece uma plataforma ótima e biorrelevante para modelagem de doenças, triagem de medicamentos e transplante de células.
Introdução
As células-tronco pluripotentes (PSCs) são caracterizadas por sua auto-renovação e capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células somáticas. Assim, os organoides derivados de PSCs tornaram-se um recurso importante na pesquisa em medicina regenerativa. A degeneração da retina é caracterizada pela perda de fotorreceptores (bastonetes e cones) e epitélio pigmentar da retina. A substituição das células da retina pode ser um tratamento encorajador para esta doença. No entanto, não é viável obter retinas humanas para pesquisa e terapia de doenças. Portanto, os organoides da retina (ROs) derivados de PSCs, que recapitulam de forma eficaz e bem-sucedida as células nativas da retina em várias camadas, são benéficos para a pesquisa básica e translacional 1,2,3. Nossa pesquisa se concentra na diferenciação de RO para fornecer células suficientes e de qualidade para estudar a degeneração da retina4.
Métodos para diferenciar ROs estão continuamente surgindo, com diferenciação de suspensão tridimensional (3D) pioneira pelo laboratório Sasai em 20125. Introduzimos a etiqueta CRX-tdTomato nas células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para rastrear especificamente as células precursoras dos fotorreceptores e modificamos o método com a adição de COCO, um antagonista multifuncional das vias Wnt, TGF-β e BMP6. Demonstrou-se que o COCO melhora eficientemente a eficiência de diferenciação de precursores e cones fotorreceptores 6,7.
Em conjunto, modificando o método clássico de diferenciação, desenvolvemos um protocolo acessível para colher abundantes precursores e cones de fotorreceptores de ROs humanas para análise da doença retiniana associada aos fotorreceptores através de investigações laboratoriais e para posterior aplicação/transplante clínico.
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional do Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. As hESCs H9 foram obtidas do WiCell Research Institute e geneticamente modificadas para a linhagem celular marcada com tdTomato.
1. Geração de ROs humanas
- Cultive os hESCs em condições livres de alimentadores.
- Revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de 0,1 mg/mL de reagente A (Tabela de Materiais) a 37 °C por pelo menos meia hora seguindo as instruções do fabricante. Descongelar uma alíquota de 1x106 hESCs.
NOTA: Preparar 3 mL de reagente B pré-aquecido (Tabela de Materiais) e transferir as células criopreservadas (1 mL) para 3 mL de meio fresco. Não pipete as hESCs para células únicas. - Centrifugar a 200 x g durante 5 min e remover o sobrenadante.
- Semeia as células na placa revestida com A do reagente com 2 mL de reagente B e troque 2 mL de reagente B diariamente. Células de passagem quando atingem aproximadamente 80% de confluência (geralmente em torno de 4 dias).
- Revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de 0,1 mg/mL de reagente A (Tabela de Materiais) a 37 °C por pelo menos meia hora seguindo as instruções do fabricante. Descongelar uma alíquota de 1x106 hESCs.
- Dia 0
- Dissociar as hESCs de uma suspensão unicelular utilizando o meio I (Tabela 1). Preparar o meio I misturando o seguinte: 20% (v/v) de reposição sérica KnockOut (KSR), solução de aminoácidos não essenciais MEM a 0,1 mM (NEAA), piruvato de 1 mM, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL de COCO, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina (PS), 0,1 mM β-mercaptoetanol e meio essencial mínimo de Glasgow Eagle (GMEM).
NOTA: Antes do início da dissociação, preparar o meio I e transferir 12 mL do meio I com 20 μM Y-27632 para uma placa de Petri de 10 cm, 500 μL de reagente C (Tabela de Materiais) contendo 0,05 mg/mL de reagente D (Tabela de Materiais) e 20 μM Y-27632 em um tubo de 1,5 mL. Execute as etapas acima no escuro, pois o componente IWR1e no meio I é sensível à luz. - Lave as hESCs com o tampão salino tamponada com fosfato (DPBS) pré-aquecido 1x da Dulbecco.
- Adicionar o reagente preparado de 500 μL (no tubo de 1,5 ml) e incubar as hESCs durante 3,5 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Retire as células agitando o lado e o fundo da placa por alguns segundos e adicione 500 μL de meio preparado I da placa de Petri na placa hESC.
NOTA: Prepare um tubo de 1,5 mL com 900 μL de 1x DPBS e use um hemocitômetro para contagem celular. - Colha as células em um novo tubo de 1,5 mL e pipete a suspensão celular para cima e para baixo e, em seguida, retire 100 μL do tubo e, em seguida, adicione ao tubo com 900 μL de DPBS para contagem de células.
- Dispersar a suspensão celular esquerda de 900 μL e, em seguida, diluir as células com o meio preparado I na placa de Petri para 9 x 104 células/mL.
NOTA: O volume total do meio é de 12 mL; 1,08 x 106 células são necessárias no total. - Adicionar 100 μL de suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços não aderente, com fundo em V (Tabela de Materiais).
NOTA: Use uma pipeta multicanal para encurtar o tempo e garantir que cada poço contenha um número de célula equivalente. Agite a placa de Petri de cada vez antes de remover as porções de 100 μL. É importante que as células sejam uniformemente distribuídas. - Gire levemente a placa de 96 poços em um agitador de baixa velocidade por 5 minutos e, em seguida, incube a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: Mantenha a placa no escuro. Defina o dia como dia 0.
- Dissociar as hESCs de uma suspensão unicelular utilizando o meio I (Tabela 1). Preparar o meio I misturando o seguinte: 20% (v/v) de reposição sérica KnockOut (KSR), solução de aminoácidos não essenciais MEM a 0,1 mM (NEAA), piruvato de 1 mM, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL de COCO, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina (PS), 0,1 mM β-mercaptoetanol e meio essencial mínimo de Glasgow Eagle (GMEM).
- Dia 2
- Adicione 1% de reagente A (Tabela de Materiais). Preparar o reagente A (concentração proteica de 10 mg/mL) adicionando 133,4 μL de reagente A em 2 mL de meio I.
NOTA: Manter o reagente A a 4 °C durante a noite antes da utilização para obter uma fusão completa e uniforme. Observe as informações do produto e pesquise o número de catálogo e o número de lote no site oficial da empresa para ter a concentração de proteína do reagente A, pois cada frasco de reagente A está em uma concentração de proteína diferente. Se a concentração de proteína for baixa, um aumento do volume de reagente A seria útil. - Adicionar 20 μL de reagente A preparado a cada poço e pipetar duas vezes no centro para espalhar as células mortas.
NOTA: Mantenha o reagente A e a placa de 96 poços em condições frias e complete todas as etapas no gelo. Coloque o prato no escuro.
- Adicione 1% de reagente A (Tabela de Materiais). Preparar o reagente A (concentração proteica de 10 mg/mL) adicionando 133,4 μL de reagente A em 2 mL de meio I.
- Dia 2-12
- Limpar o fundo da placa de 96 poços e incubar a 37 °C e 5% de CO2 até ao dia 6. No dia 6, mude metade do meio removendo 58 μL do meio de cada poço e adicionando 60 μL de meio I.
NOTA: Use uma pipeta multicanal para concluir a meia mudança média. Conduza esta etapa com cuidado para garantir que nenhuma pelota de célula seja removida do poço. Aspirar o meio em uma placa de Petri limpa de 10 cm. Se houver pellets de células dentro, adicione-os de volta à placa de 96 poços.
- Limpar o fundo da placa de 96 poços e incubar a 37 °C e 5% de CO2 até ao dia 6. No dia 6, mude metade do meio removendo 58 μL do meio de cada poço e adicionando 60 μL de meio I.
- Dias 12-18
- Alterar o médio para o médio II (Tabela 1) no dia 12. Preparar o meio II utilizando o reagente A a 1% (v/v) misturando o seguinte: 10% de soro fetal bovino (FBS), NEAA de 0,1 mM, piruvato de 1 mM, penicilina de 100 U/mL, estreptomicina de 100 μg/mL, β-mercaptoetanol de 100 mM, dicloridrato SAG de 100 nM e GMEM. Armazene-o em condições frias e escuras.
- Colha os pellets de células em um tubo cônico de 15 mL da placa de 96 poços e deixe que os pellets se depositem naturalmente por 5 minutos à temperatura ambiente.
NOTA: Remova o meio e os pellets suavemente sob a superfície para evitar bolhas. - Remova o sobrenadante enquanto cuida dos organoides. Transferir os agregados celulares para uma placa de suspensão de 10 cm contendo 18 mL de meio preparado II com o reagente A.
NOTA: Não adicione o meio preparado II ao prato de 10 cm de antecedência, uma vez que o reagente A deve estar a 4 °C. - Incubar a 37 °C e 5% de CO2 até ao dia 18.
- A partir do dia 18
- Alterar o médio para o médio III (Tabela 1). Preparar o meio III em condições escuras misturando o seguinte: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM de ácido retinóico (AR), 100 μM de taurina, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 1:1 mistura de meio águia modificado (DMEM)/mistura de nutrientes F-12 da Dulbecco.
- No dia 18, quando uma vesícula óptica semitransparente é gerada, corte os organoides usando uma faca microcirúrgica.
NOTA: Deixe o organoide, geralmente em quatro pedaços, em uma placa de Petri com meio II. Cada peça deve crescer em um copo óptico intacto nas semanas seguintes. - Agregar todos os pellets ao centro do prato. Colha as células em um tubo de falcão cônico de 15 mL e permita a sedimentação natural. Em seguida, remova suavemente o sobrenadante.
NOTA: Devido aos seus tamanhos, os organoides podem ser agregados no centro girando a placa de Petri em uma direção por 90° em um plano horizontal algumas vezes. - Suspender e dispersar os pellets em duas placas de Petri de 10 cm, com 18 mL de meio III por prato, e transferir suavemente os pratos para a incubadora para evitar a agregação celular. Continuar a cultura em meio III a 37 °C e 5% de CO2 e mudar o meio semanalmente. A CRX expressa após o dia 45 e até o dia 120, foi possível detectar o segmento externo do fotorreceptor.
2. Analisando ROs humanas
- Análise FACS
- Monte três organoides derivados de CRX-tdTomate e três H9 ES dos pratos usando as pontas cortadas de 1 mL. Lave os organoides com 1 mL de DPBS pré-aquecido (temperatura ambiente).
- Preparar o tampão de digestão misturando solução de tripsina-EDTA a 0,25% com 0,05 mg/ml de reagente D.
- Dissociar os organoides em células únicas utilizando o tampão de digestão preparado durante 8 minutos a 37 °C. Em seguida, adicione o mesmo volume de DPBS com FBS a 10% e 0,05 mg/mL de reagente D para inativar a reação.
- Suspenda e espalhe levemente as células e, em seguida, filtre usando um filtro celular de 100 μm e use um sistema de Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) na linha de laser de excitação de 561 nm e filtro 780/60 para analisar os sinais positivos CRX-tdTomato.
NOTA: CRX expressa inicialmente no dia 45 e aumenta com a maturação dos organoides. Dez mil células são usadas para cada teste, para cada ponto de tempo, pelo menos três repetições são concluídas.
- Quantificação da intensidade de fluorescência das ROs
- Prepare os organoides viáveis aleatoriamente para imagens.
NOTA: Defina os parâmetros e use os mesmos filtros e parâmetros para todos os monitores de intensidade de fluorescência. - Capture imagens e analise a intensidade média de fluorescência usando um software adequado (por exemplo, ImageJ).
- Importe as imagens e, em seguida, converta para 8 bits usando a | de Imagem Digite.
- Ajuste o limite usando os parâmetros padrão por Image | Ajustar | Limiar.
- Determine a área medida e, em seguida, avalie o valor cinza usando Analisar | Medida.
NOTA: Os valores médios no painel de resultados são a intensidade média de fluorescência da área medida.
- Prepare os organoides viáveis aleatoriamente para imagens.
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Resultados
A ilustração esquemática retrata o protocolo de diferenciação para melhorar as células precursoras com COCO (Figura 1). De PSC a ROs, inúmeros detalhes podem causar variações de resultados. Recomenda-se registrar cada etapa e até mesmo o número de catálogo e o número de lote de cada meio para acompanhar todo o procedimento.
Aqui, fornecemos imagens de campo brilhante para os dias 6, 12, 18 e 45 (Figura 2). No dia 6, os organoides gera...
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Discussão
A diferenciação organoide retiniana é um método desejável para a geração de amplas células funcionais da retina. A RO é um composto de diferentes células da retina, como células ganglionares, células bipolares e fotorreceptores, geradas por células-tronco pluripotentes em direção à retina neural 4,5,8,9. Embora as ROs confluentes possam ser colhidas, é demorado, o que pode exigir longos período...
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Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório 502 por seus apoios técnicos e comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (Z200014) e pelo Programa Nacional de P&D da China (2017YFA0105300).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R& D Systems | 3047-CC-050 | DAN Família de domínios de antagonistas BMP |
| DMEM / F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Soro Bovino (FBS), Qualificado para Células-Tronco Embrionárias Humanas | Indústria Biológica | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Substituição de Soro - Multi-Espécies | Gibco | A3181502 | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X) | sigma | M7145 | |
| Caneta Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Agregação de células em 1.2.7 |
| Piruvato | Sigma | S8636 | |
| Reagente A | BD | 356231 | Matrigel em 1.1.1 |
| Reagente B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8, PSCs meio basal em 1.1.2 |
| Reagente C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express em 1.2 |
| Reagente D | Roche | 11284932001 | DNase I, em 1.2 |
| Ácido retinóico | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Suplemento 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Suplemento (100X), Líquido, flexível em medum III |
| Taurina | Sigma | T-8691-25G | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol | Gibco | 25200056 | dissociação de organoides em 2.1.3 |
| Wnt Antagonista I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | inibidor Wnt |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
Referências
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247(2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286(2015).
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Reimpressões e permissões
