Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Summary

Usando um método de auto-organização, desenvolvemos um protocolo com a adição de COCO que poderia aumentar significativamente a geração de fotorreceptores.

Abstract

O transplante de células da retina é uma abordagem terapêutica promissora, que poderia restaurar a arquitetura da retina e estabilizar ou mesmo melhorar as capacidades visuais da retina degenerada. No entanto, o progresso na terapia de reposição celular atualmente enfrenta os desafios de exigir uma fonte pronta para uso de retinas humanas padronizadas e de alta qualidade. Portanto, um protocolo fácil e estável é necessário para os experimentos. Aqui, desenvolvemos um protocolo otimizado, baseado em um método de auto-organização com o uso de moléculas exógenas e reagente A, bem como excisão manual para gerar os organoides tridimensionais da retina humana (RO). As RO derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) expressam marcadores específicos para fotorreceptores. Com a adição de COCO, um antagonista multifuncional, a eficiência de diferenciação de precursores e cones fotorreceptores é significativamente aumentada. O uso eficiente deste sistema, que tem os benefícios de linhagens celulares e células primárias, e sem os problemas de fornecimento associados a este último, poderia produzir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Assim, a diferenciação de PSCs para RO fornece uma plataforma ótima e biorrelevante para modelagem de doenças, triagem de medicamentos e transplante de células.

Introduction

As células-tronco pluripotentes (PSCs) são caracterizadas por sua auto-renovação e capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células somáticas. Assim, os organoides derivados de PSCs tornaram-se um recurso importante na pesquisa em medicina regenerativa. A degeneração da retina é caracterizada pela perda de fotorreceptores (bastonetes e cones) e epitélio pigmentar da retina. A substituição das células da retina pode ser um tratamento encorajador para esta doença. No entanto, não é viável obter retinas humanas para pesquisa e terapia de doenças. Portanto, os organoides da retina (ROs) derivados de PSCs, que recapitulam de forma eficaz e bem-sucedida as células ....

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional do Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. As hESCs H9 foram obtidas do WiCell Research Institute e geneticamente modificadas para a linhagem celular marcada com tdTomato.

1. Geração de ROs humanas

1. Cultive os hESCs em condições livres de alimentadores.
   1. Revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de 0,1 mg/mL de reagente A (Tabela de Materiais) a 37 °C por pelo menos meia hora seguindo as instruções do fabricante. Descongelar uma alíquota de 1x10⁶ hESCs.
      NOTA: Preparar 3 mL de reagente B pré-aquecido (Tabela....

Results

A ilustração esquemática retrata o protocolo de diferenciação para melhorar as células precursoras com COCO (Figura 1). De PSC a ROs, inúmeros detalhes podem causar variações de resultados. Recomenda-se registrar cada etapa e até mesmo o número de catálogo e o número de lote de cada meio para acompanhar todo o procedimento.

Aqui, fornecemos imagens de campo brilhante para os dias 6, 12, 18 e 45 (Figura 2). No dia 6, os organoides gera.......

Discussion

A diferenciação organoide retiniana é um método desejável para a geração de amplas células funcionais da retina. A RO é um composto de diferentes células da retina, como células ganglionares, células bipolares e fotorreceptores, geradas por células-tronco pluripotentes em direção à retina neural 4,5,8,9. Embora as ROs confluentes possam ser colhidas, é demorado, o que pode exigir longos período.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoetanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R& D Systems	3047-CC-050	DAN Família de domínios de antagonistas BMP
DMEM / F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Soro Bovino (FBS), Qualificado para Células-Tronco Embrionárias Humanas	Indústria Biológica	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Substituição de Soro - Multi-Espécies	Gibco	A3181502
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)	sigma	M7145
Caneta Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Agregação de células em 1.2.7
Piruvato	Sigma	S8636
Reagente A	BD	356231	Matrigel em 1.1.1
Reagente B	StemCell	5990	mTeSR- E8, PSCs meio basal em 1.1.2
Reagente C	Gibco	12563-011	TrypLE Express em 1.2
Reagente D	Roche	11284932001	DNase I, em 1.2
Ácido retinóico	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Suplemento 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Suplemento (100X), Líquido, flexível em medum III
Taurina	Sigma	T-8691-25G
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	Gibco	25200056	dissociação de organoides em 2.1.3
Wnt Antagonista I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	inibidor Wnt
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049