CcCIPK14 Análise da função gênica para iluminar o sistema transgênico radicular eficiente

Tengyue Liu; Zhihua Song; Tingting Du; Wanlong Yang; Ting Chen; Ying Han; Biying Dong; Hongyan Cao; Lili Niu; Rohul Amin; Haojie jin; Qing Yang; Dong Meng; Yujie Fu

doi:10.3791/62304

Artigo de método

CcCIPK14 Análise da função gênica para iluminar o sistema transgênico radicular eficiente

DOI:

10.3791/62304

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23 de setembro de 2021

Tengyue Liu^*¹ , Zhihua Song^*¹ , Tingting Du¹ , Wanlong Yang¹ , Ting Chen¹ , Ying Han¹ , Biying Dong¹ , Hongyan Cao¹ , Lili Niu¹^,² , Rohul Amin¹ , Haojie jin¹ , Qing Yang¹^,² , Dong Meng¹^,² , Yujie Fu¹^,²

¹College of Forestry, Beijing Forestry University, ²Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui apresentamos um sistema de transformação eficiente e estável para a análise funcional do gene CcCIPK14 como exemplo, fornecendo uma base técnica para o estudo do metabolismo de plantas não-modelo.

Resumo

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Um sistema de transformação eficiente e estável é fundamental para o estudo da função gênica e melhoramento molecular de plantas. Aqui, descrevemos o uso de um sistema de transformação mediado por Agrobacterium rhizogenes em guandu. O caule está infectado com A. rhizogenes carregando um vetor binário, que induziu calos após 7 dias e raízes adventícias 14 dias depois. A raiz pilosa transgênica gerada foi identificada por análise morfológica e um gene repórter GFP. Para ilustrar ainda mais a faixa de aplicação deste sistema, CcCIPK14 (proteínas quinases de interação com proteínas semelhantes à calcineurina B) foi transformado em feijão bóer usando este método de transformação. As plantas transgênicas foram tratadas com ácido jasmônico (JA) e ácido abscísico (ABA), respectivamente, com o objetivo de testar se o CcCIPK14 responde a esses hormônios. Os resultados demonstraram que (1) hormônios exógenos podem regular significativamente o nívelde expressão de CcCIPK14, especialmente em plantas de superexpressão (OE) de CcCIPK14 ; (2) o teor de genisteína nas linhagens CcCIPK14-OE foi significativamente maior do que o controle; (3) o nível de expressão de dois genes-chave da flavonóide sintase a jusante, CcHIDH1 e CcHIDH2, foi regulado positivamente nas linhagens CcCIPK14-OE; e (4) o sistema transgênico de raiz pilosa pode ser usado para estudar genes metabolicamente funcionais em plantas não modelo.

Introdução

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A transformação é uma ferramenta básica para avaliar a expressão de genes exógenos ^1,2. Muitos aspectos biológicos das plantas de recursos são comuns a todas as plantas; portanto, estudos funcionais de certos genes podem ser realizados em plantas modelo (como Arabidopsis)³. No entanto, muitos genes em plantas são únicos em sua função e padrões de expressão, exigindo estudos em espécies próprias ou intimamente relacionadas, especialmente para plantas de recursos ^3,4. As células vegetais ....

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Protocolo

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NOTA: O feijão bóer é uma leguminosa diplóide que pertence à família Fabaceae. As sementes de feijão bóer usadas neste experimento são da Universidade Florestal do Nordeste da China e são codificadas como 87119. As etapas principais deste protocolo são ilustradas na Figura 1A. A incubação das mudas foi realizada em ambiente de alta umidade a 25 °C sob luz fluorescente a 50 μmol fótons por ^m-2 ^s-1 em fotoperíodo de 16 h. As cepas K599 (NCPPB2659) de A. rhizogenes foram preservadas em laboratório. Eles foram armazenados em meio manitol de levedura (YEP) com glicerol a....

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Resultados

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Transformação de raiz peluda mediada por A. rhizogenes em guandu
Este estudo descreveu os protocolos passo a passo para a transformação genética de raízes pilosas mediadas por A. rhizogenes, que tem significado no campo das moléculas vegetais. Demorou cerca de 5 semanas para obter raízes peludas das raízes do feijão bóer infectado por A. rhizogenes. A Figura 1A mostrou uma visão geral de todo o processo de tran.......

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Discussão

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A rápida caracterização da função gênica é o objetivo comum no estudo da maioria das espécies e é particularmente importante para o desenvolvimento de plantas de recursos. A transformação mediada por A. rhizogenes tem sido amplamente utilizada na cultura de raízes pilosas. A cultura de raízes pilosas (HRC), como fonte única de produção de metabólitos, desempenha um papel fundamental na engenharia metabólica^18,28. A aplic.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

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Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31800509, 31922058), Fundo de Jovens Talentos de Destaque na Universidade Florestal de Pequim" (2019JQ03009), os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2021ZY16), Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (6212023) e Programa Nacional de P&D da China (2018YFD1000602,2019YFD1000605-1) e Centro de Inovação Avançada de Pequim para Melhoramento de Árvores por Design Molecular. Gostaria de agradecer a Zhengyang Hou por sua orientação ao escrever o artigo e ao professor Meng Dong por sua orientação sobre a ideia do art....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo
Tubo de 8 tiras qPCR de 0,1 mL (com tampas ópticas)	KIRGEN, Xangai, China	KJ2541
ABA	Solarbio Life Science, Pequim, China	A8060
	Solarbio Life Science, Pequim, China	Centrífuga A8190
	Osterode am Harz, Alemanha	d37520
CFX Connect TW Optics Module	Bio-rad, EUA	1855200
incubadora de temperatura constante	Shanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Xangai, China	BPX-82
Placa de Petri Diposable	Corning, US
Dry Bath	Gingko Bioscience Company/Coyote bioscience, China	H2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50	Promega, Pequim, China	LS1030
Balança eletrônica	Tianjin, China	TD50020
Filtro pape	Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, China
FiveEasy Plus	Mettler Toledo, Xangai, China	30254105
Flowerpot 9*9	China
JA	Solarbio Life Science, Pequim, China	J8070
Kan	Solarbio Life Science, Pequim, China	K8020
MagicSYBR Mixture	CWBIO, Pequim, China
Mini Microcentrífuga	Scilogex, Pequim, China	S1010E
NaCl	Solarbio Life Science, Pequim, China	S8210
NanPhotometer N50 Touch	IMPLEN GMBH, Alemanha	T51082
Purelab untra
Rifampicina	Solarbio Life Science, Pequim, China	R8010
Caixa de mudas 30*200	China
Thermal Cicladora PCR	Bio-rad, US	T100
oscilador termostático	Pequim donglian Har lnstrument Manufacture Co., Ltd, China	DLHE-Q200
Tomy Autoclave	Tomy, Japão	SX-500
Tryptone	Solarbio Life Science, Pequim, China	LP0042
UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis (com dsDNase)	US Everbright INC, Jiangsu, China	R2028
Extrato de levedura em pó	Solarbio Life Science, Pequim, China	LP0021

Pó de ágar CW3008M

Referências

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Poland, J. A., Rife, T. W. Genotyping-by-sequencing for plant breeding and genetics. The Plant Genome. 5 (3), (2012).
Barabaschi, D., et al. Next generation breeding. Plant Science. 242, 3-13 (2016).
Petri, C., Webb, K., Hily, J. -M., Dardick, C., Scorza, R.

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CcCIPK14 Gene Hairy Root Transformation Agrobacterium Rhizogenes Pigeon Pea Transgenic Hairy Root Gene Function Analysis Jasmonic Acid Treatment Abscisic Acid Response Flavonoid Synthase Genes Genistein Content

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