Method Article

CcCIPK14 Análise da função gênica para iluminar o sistema transgênico radicular eficiente

DOI:

10.3791/62304

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September 23rd, 2021

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1College of Forestry, Beijing Forestry University, 2Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University

In This Article

Summary

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Aqui apresentamos um sistema de transformação eficiente e estável para a análise funcional do gene CcCIPK14 como exemplo, fornecendo uma base técnica para o estudo do metabolismo de plantas não-modelo.

Abstract

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Um sistema de transformação eficiente e estável é fundamental para o estudo da função gênica e melhoramento molecular de plantas. Aqui, descrevemos o uso de um sistema de transformação mediado por Agrobacterium rhizogenes em guandu. O caule está infectado com A. rhizogenes carregando um vetor binário, que induziu calos após 7 dias e raízes adventícias 14 dias depois. A raiz pilosa transgênica gerada foi identificada por análise morfológica e um gene repórter GFP. Para ilustrar ainda mais a faixa de aplicação deste sistema, CcCIPK14 (proteínas quinases de interação com proteínas semelhantes à calcineurina B) foi transformado em feijão bóer usando este método de transformação. As plantas transgênicas foram tratadas com ácido jasmônico (JA) e ácido abscísico (ABA), respectivamente, com o objetivo de testar se o CcCIPK14 responde a esses hormônios. Os resultados demonstraram que (1) hormônios exógenos podem regular significativamente o nívelde expressão de CcCIPK14, especialmente em plantas de superexpressão (OE) de CcCIPK14 ; (2) o teor de genisteína nas linhagens CcCIPK14-OE foi significativamente maior do que o controle; (3) o nível de expressão de dois genes-chave da flavonóide sintase a jusante, CcHIDH1 e CcHIDH2, foi regulado positivamente nas linhagens CcCIPK14-OE; e (4) o sistema transgênico de raiz pilosa pode ser usado para estudar genes metabolicamente funcionais em plantas não modelo.

Introduction

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A transformação é uma ferramenta básica para avaliar a expressão de genes exógenos 1,2. Muitos aspectos biológicos das plantas de recursos são comuns a todas as plantas; portanto, estudos funcionais de certos genes podem ser realizados em plantas modelo (como Arabidopsis)3. No entanto, muitos genes em plantas são únicos em sua função e padrões de expressão, exigindo estudos em espécies próprias ou intimamente relacionadas, especialmente para plantas de recursos 3,4. As células vegetais ....

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Protocol

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NOTA: O feijão bóer é uma leguminosa diplóide que pertence à família Fabaceae. As sementes de feijão bóer usadas neste experimento são da Universidade Florestal do Nordeste da China e são codificadas como 87119. As etapas principais deste protocolo são ilustradas na Figura 1A. A incubação das mudas foi realizada em ambiente de alta umidade a 25 °C sob luz fluorescente a 50 μmol fótons por m-2 s-1 em fotoperíodo de 16 h. As cepas K599 (NCPPB2659) de A. rhizogenes foram preservadas em laboratório. Eles foram armazenados em meio manitol de levedura (YEP) com glicerol a....

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Results

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Transformação de raiz peluda mediada por A. rhizogenes em guandu
Este estudo descreveu os protocolos passo a passo para a transformação genética de raízes pilosas mediadas por A. rhizogenes, que tem significado no campo das moléculas vegetais. Demorou cerca de 5 semanas para obter raízes peludas das raízes do feijão bóer infectado por A. rhizogenes. A Figura 1A mostrou uma visão geral de todo o processo de tran.......

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Discussion

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A rápida caracterização da função gênica é o objetivo comum no estudo da maioria das espécies e é particularmente importante para o desenvolvimento de plantas de recursos. A transformação mediada por A. rhizogenes tem sido amplamente utilizada na cultura de raízes pilosas. A cultura de raízes pilosas (HRC), como fonte única de produção de metabólitos, desempenha um papel fundamental na engenharia metabólica18,28. A aplic.......

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Disclosures

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Acknowledgements

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Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31800509, 31922058), Fundo de Jovens Talentos de Destaque na Universidade Florestal de Pequim" (2019JQ03009), os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2021ZY16), Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (6212023) e Programa Nacional de P&D da China (2018YFD1000602,2019YFD1000605-1) e Centro de Inovação Avançada de Pequim para Melhoramento de Árvores por Design Molecular. Gostaria de agradecer a Zhengyang Hou por sua orientação ao escrever o artigo e ao professor Meng Dong por sua orientação sobre a ideia do art....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubo de 8 tiras qPCR de 0,1 mL (com tampas ópticas)KIRGEN, Xangai, ChinaKJ2541
ABASolarbio Life Science, Pequim, ChinaA8060
Solarbio Life Science, Pequim, ChinaCentrífuga A8190
Osterode am Harz, Alemanhad37520
CFX Connect TW Optics ModuleBio-rad, EUA1855200
incubadora de temperatura constanteShanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Xangai, ChinaBPX-82
Placa de Petri DiposableCorning, US
Dry BathGingko Bioscience Company/Coyote bioscience, ChinaH2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50Promega, Pequim, ChinaLS1030
Balança eletrônicaTianjin, ChinaTD50020
Filtro papeHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, China
FiveEasy PlusMettler Toledo, Xangai, China30254105
Flowerpot 9*9China
JASolarbio Life Science, Pequim, ChinaJ8070
KanSolarbio Life Science, Pequim, ChinaK8020
MagicSYBR MixtureCWBIO, Pequim, China
Mini MicrocentrífugaScilogex, Pequim, ChinaS1010E
NaClSolarbio Life Science, Pequim, ChinaS8210
NanPhotometer N50 TouchIMPLEN GMBH, AlemanhaT51082
Purelab untra
RifampicinaSolarbio Life Science, Pequim, ChinaR8010
Caixa de mudas 30*200China
Thermal  Cicladora  PCRBio-rad, UST100
oscilador termostáticoPequim donglian Har lnstrument Manufacture Co., Ltd, ChinaDLHE-Q200
Tomy AutoclaveTomy, JapãoSX-500
TryptoneSolarbio Life Science, Pequim, ChinaLP0042
UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis (com dsDNase)US Everbright INC, Jiangsu, ChinaR2028
Extrato de levedura em póSolarbio Life Science, Pequim, ChinaLP0021
Pó de ágar CW3008M

References

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  1. Poland, J. A., Rife, T. W. Genotyping-by-sequencing for plant breeding and genetics. The Plant Genome. 5 (3), (2012).
  2. Barabaschi, D., et al. Next generation breeding. Plant Science. 242, 3-13 (2016).
  3. Petri, C., Webb, K., Hily, J. -M., Dardick, C., Scorza, R.

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