Avaliação de métricas funcionais da saúde muscular esquelética em microtissues musculares esqueléticas humanas

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para produzir matrizes de microtissues musculares esqueléticos humanos 3D e minimamente invasivos a jusante em ensaios de função situ, incluindo força contraítil e análises de manuseio de cálcio.

Resumo

Modelos tridimensionais (3D) in vitro de músculo esquelético são um avanço valioso na pesquisa biomédica, pois oferecem a oportunidade de estudar a reforma muscular esquelética e funcionar em um formato escalável que é favorável a manipulações experimentais. Os sistemas de cultura muscular 3D são desejáveis, pois permitem que os cientistas estudem ex vivo muscular esquelético no contexto das células humanas. Modelos in vitro 3D imitam de perto aspectos da estrutura tecidual nativa do músculo esquelético adulto. No entanto, sua aplicação universal é limitada pela disponibilidade de plataformas simples de fabricar, custos e fáceis de usar, e produzem quantidades relativamente altas de tecidos musculares esqueléticos humanos. Além disso, uma vez que o músculo esquelético desempenha um importante papel funcional que é prejudicado ao longo do tempo em muitos estados da doença, uma plataforma experimental para estudos de microtissue é mais prática quando medidas minimamente invasivas de cálcio transitório e força contratil podem ser conduzidas diretamente dentro da própria plataforma. Neste protocolo, descreve-se a fabricação de uma plataforma de 96 poços conhecida como "MioTACTIC", e a produção em massa de microtissues musculares esqueléticos 3D (hMMTs). Além disso, são relatados os métodos para uma aplicação minimamente invasiva de estimulação elétrica que permite medições repetidas da força muscular esquelética e do manuseio de cálcio de cada microtissue ao longo do tempo.

Introdução

O músculo esquelético é um dos tecidos mais abundantes no corpo humano e suporta funções fundamentais do corpo, como locomoção, homeostase de calor e metabolismo¹. Historicamente, modelos animais e sistemas bidimensionais (2D) de cultura celular têm sido utilizados para estudar processos biológicos e patogênese de doenças, bem como para testar compostos farmacológicos no tratamento de doenças musculares esqueléticas^2,3. Embora os modelos animais tenham melhorado muito nosso conhecimento sobre músculo esquelético em saúde e em doenças, seu impacto translacional tem sido dificultado por a....

Protocolo

1. Fabricação de placas mioTACTIC PDMS

NOTA: A fabricação da placa myoTACTIC PDMS requer um molde negativo pu, que pode ser fabricado como descrito anteriormente³⁰. O arquivo SolidWorks (Computer-aided Design, design aided design" para o design da placa MyoTACTIC foi disponibilizado no GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).

1. Prepare ~ 110 g de solução de polímero PDMS em um copo de plástico descartável a uma proporção de 1:15 de monômero para agente de cura usando os componentes no kit de elastômero de silicone. Mexa a solução de polímero por 2-3 min usando uma pipeta soroló....

Resultados

Descritos aqui são métodos para lançar uma plataforma de cultura mioTACTIC baseada em PDMS de 96 poços a partir de um molde pu, para fabricar matrizes de tecidos de réplica hMMT, e para analisar dois aspectos da função hMMT dentro da geração de força de dispositivo de cultura e manuseio de cálcio. A Figura 1 oferece uma visão geral esquemática da preparação dos poços de cultura MioTACTIC antes da semeadura do HMMT. PDMS é um polímero à base de silicone amplamente utilizado, que pode ser faci.......

Discussão

Este manuscrito descreve métodos para fabricar e analisar um modelo de cultura 3D hMMT que pode ser aplicado a estudos de biologia muscular básica, modelagem de doenças ou para testes de moléculas de candidatos. A plataforma MyoTACTIC é amigável ao custo, fácil de fabricar, e requer um número relativamente pequeno de células para produzir microtissues musculares esqueléticas. os hMMTs formados dentro da plataforma de cultura MioTACTIC são compostos por miótubos alinhados, multinucleados e estriados, e respondem a estímul.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina a 0,9%, Sterile	House Brand	1010	Alíquotas de 10 mL da solução são feitas e armazenadas a 4° C
25G Agulha	BD, Medstore, Universidade de Toronto	2548-CABD305127
Ácido 6-Aminocapróico, ≥ 99% (titulação), Pó	Sigma - Aldrich	A2504-100G	Uma solução estoque de 50 mg / mL é gerada pela dissolução de 5 mg de pó de ácido 6-aminocapróico em 100 mL de água destilada autoclavada. A solução é filtrada a vácuo e alíquotas de 10 mL são armazenadas a 4° C
6.35 mm ID Tubing	VWR	60985-528
AB1167 Myoblast Cell Line	Institut de Myologie (Paris, França)
Gerador de Forma de Onda Arbitrária	Rigol	DG1022Z
Extrato de Membrana de Basement (Geltrex)	Thermo Fisher Scientific	A14132-02	Armazenado como alíquotas de 50 µ L ou 100 µ L a -80° C
Câmara de Vácuo de Bancada	Sigma - Aldrich	D2672
Cabo BNC para Clipe			Encomendado da Amazon
Culture Plastics	Sarstedt		Inclui placas de cultura, pipetas sorológicas, etc
Dimetil Sulfóxido Sigma	- Aldrich	D8418-250ML
DPBS, Pó, Sem Cálcio, Sem Magnésio	Thermo Fisher Scientific
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	Este é um DMEM de alta glicose com L-glutamina e piruvato de sódio
Soro Fetal Bovino	Fisher Scientific	10437028
Fibrinogen de Plasma Bovino	Sigma - Aldrich	F8630-5G	Alíquotas variando de 7 - 10 mg de pó de fibrinogênio são feitas e armazenadas a -20°
Filtro de Seringa C Filtropur, Tamanho do Poro 0.22um	Sarstedt	83.1826.001
Soro de Cavalo	Gibco	16050-122
Insulina Recombinante Humana	Sigma - Aldrich	91077C	A solução estoque é 100X e feita dissolvendo 1 mg de insulina recombinante humana em 1 mL de DMEM e 1 µ L de NaOH 10N. A solução é filtrada e armazenada como alíquotas de 1 mL a 4&graus; Software
aquisição de imagem	Olympus	cellSens Dimension
Software de processamento de imagem	National Institutes of Health	ImageJ
Isotemp Oven	Thermo Fisher Scientific	201
Microscópio	Olympus	IX83
Microscópio - Montagem em câmera	Labcam Labcam	para iPhone	Encomendado da Amazon
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Seringas Descartáveis de Plástico, 1cc	BD	2606-309659
Seringas Descartáveis de Plástico, 50cc	BD	2612-309653
Plurônico F-127, Pó, BioReagente	Sigma - Aldrich	P2443-250G	Uma solução estoque de ácido plurônico a 5% é feita dissolvendo 5 g de pó de ácido plurônico em 100 mL de água destilada gelada, autoclavada. A solução é filtrada a vácuo e alíquotas de 10 mL são armazenadas a 4° C
Polidimetilsiloxano (Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184)	Os	Dow 4019862	também estão disponíveis na Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Molde Negativo de Poliuretano	em Agente
Bomba de Vácuo de Palhetas Rotativas
	Almedic, Medstore, Universidade de Toronto	2586-M36-0100
Lâmina de Barbear de Borda Única	VWR	55411-050
Medium	Promocell	C-23260	30 mL aliquotes são gerados e armazenados a 4°C.
Meio de crescimento de células musculares esqueléticas (pronto para uso)	Promocell	C-23060	Alíquotas de 42 mL são geradas e armazenadas a 4 graus Celsius.
Smartphone (iPhone)	Apple	SE
Bomba de Vácuo Seca de Serviço Padrão	Welch	2546B-01
Saco de Esterilização	Alliance	211-SCM2
Thimble	Igege		Encomendado da Amazon
Trombina de plasma humano	Sigma - Aldrich	T6884-250UN	100 unidades de trombina são dissolvidas em 1 mL de uma solução de BSA a 0,1%. 10 µ As alíquotas L são preparadas e armazenadas a - 20 graus C.
Fio de cobre revestido de estanho	Arco	B8871K48	Encomendado da Amazon
Trypan Blue Solution, 0,4%	Thermo Scientific	15250061
Tripsina-EDTA, 0,25%	Thermo FIsher Scientific	25200072
Câmara de Vácuo 2	SP Bel-Art	F42027-0000

de Jacaré 21600069 de C kits de Liberação Interna Mann Release Technologies 200 Bisturi A65401906 Edwards Célula Muscular Esquelética Basal