Difração de Elétrons Microcristal de Pequenas Moléculas

Summary

Aqui, descrevemos os procedimentos desenvolvidos em nosso laboratório para a preparação de pós de cristais de pequenas moléculas para experimentos de difração eletrônica de microcristais (MicroED).

Abstract

Um protocolo detalhado para a preparação de amostras de pequenas moléculas para experimentos de difração eletrônica de microcristais (MicroED) é descrito. O MicroED foi desenvolvido para resolver estruturas de proteínas e pequenas moléculas usando equipamentos de criomicroscopia eletrônica padrão (cryo-EM). Dessa forma, pequenas moléculas, peptídeos, proteínas solúveis e proteínas de membrana foram recentemente determinadas com altas resoluções. Protocolos são apresentados aqui para a preparação de grades de fármacos de pequenas moléculas usando o fármaco carbamazepina como exemplo. Protocolos para triagem e coleta de dados são apresentados. Etapas adicionais no processo geral, como integração de dados, determinação de estrutura e refinamento são apresentadas em outro lugar. Estima-se que o tempo necessário para preparar as grades de moléculas pequenas seja inferior a 30 min.

Introduction

A difração eletrônica de microcristais (MicroED) é um método de criomicroscopia eletrônica (crio-EM) para determinar estruturas de resolução atômica a partir de cristais de tamanho submicrométrico ^1,2. Os cristais são aplicados a grades de microscópio eletrônico de transmissão padrão (TEM) e congelados mergulhando em etano líquido ou nitrogênio líquido. As grades são então carregadas em um MET operando em temperaturas criogênicas. Os cristais são localizados na grade e peneirados para a qualidade inicial da difração. Os dados MicroED de rotação contínua são coletados de um subconjunto dos cristais peneirados, ....

Protocol

1. Preparação de amostras de pequenas moléculas

1. Transfira uma pequena quantidade (0,01 - 1 mg) de pó, líquido ou sólidos para um pequeno frasco ou tubo.
2. Para amostras já em pó, sele o tubo usando a tampa até que a amostra seja necessária. Secar as amostras líquidas em pós antes das tentativas do método 1 (passo 3) ou 2 (passo 4).
   NOTA: As amostras dissolvidas em líquido podem utilizar o método 3 (5.X) abaixo

2. Preparação de grades de ETM

NOTA: Alguns TEMs com sistemas de carregador automático exigem que as grades sejam cortadas e colocadas em um antes de carregar na coluna TEM. O clipp....

Results

O MicroED é um método crioEM que aproveita as fortes interações entre elétrons e matéria, o que permite a investigação de cristais pequenos^que desaparecem12,13. Após essas etapas, espera-se ter um filme de difração em formato cristalográfico coletado de microcristais (Filme 1). Aqui, a técnica é demonstrada com o uso da carbamazepina¹². Os resultados mostram um conjunto de dados MicroED de rotação contínua a partir de um m.......

Discussion

A preparação da amostra é tipicamente um processo iterativo, onde as otimizações são feitas após sessões de triagem e coleta de dados. Para amostras de moléculas pequenas, muitas vezes é prudente tentar primeiro a preparação da grade sem descarga de brilho das grades, uma vez que muitos fármacos tendem a ser hidrofóbicos^10,11. Se as grades tiverem poucos depósitos nanocristalinos, é uma boa ideia tentar novamente após a primeira descarga de brilho das grades. Pod.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos Eppendorf de 0,1-1,5mL	Fisher Scientific	14-282-300	Qualquer frasco ou tubo serve.
Clipes de grade automática	Thermo-Fisher	1036173	grades recortadas não são necessárias para MicroED. Eles são necessários para TEMs Thermo-Fisher equipados com um sistema de carregamento automático.
Anéis C Autogrid	Thermo-Fisher	1036171
Carbamazapina	Sigma	C4024-1G	Qualquer quantidade será suficiente para esses experimentos
Detector baseado em CMOS	Thermo-Fisher	CetaD 16M	Usamos um CetaD 16M, mas qualquer detector com modo de obturador rotativo ou leitura suficientemente rápida é aceitável.
Software Delphi	Thermo-Fisher	N/A	Software em sistemas Thermo-Fisher TEM que permite a rotação manual do estágio de amostra
Software EPU-D	Thermo-Fisher	N/A	Software comercial para aquisição de dados MicroED
Corrediças de cobertura de vidro	Hampton	HR3-231
Descarregador de brilho	Pelco	easiGlow
High PrecisionPinças	EMS	78325-AC	Qualquer pinça de alta precisão servirá
Vaso de nitrogênio líquido	Spear Lab	FD-800	Um vaso de espuma padrão para manuseio de amostras sob nitrogênio líquido - 800mL
SerialEM software	UC Boulder	N/A	Software livre distribuído pela D. Mastronarde. Grades TEM do Departamento de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento
Grades de malha	Quantifoil/EMS	Q310CMA	Multi-A 300 foram usadas aqui, mas qualquer grade de carbono fina funcionará. Para essas pequenas moléculas, sugerimos começar com carbono contínuo.
microscópio eletrônico de transmissão (TEM)	Thermo-Fisher	Talos Arctica
Whatman papel de filtro circular	Millipore-Sigma	WHA1001090	90mm ou maior