Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

Resumo

A Ação Capilar De Ligania Diferencial do Ensaio de Ligamento (DRaCALA) pode ser usada para identificar pequenas proteínas de ligação de ligantes de um organismo usando uma biblioteca ORFeome.

Resumo

A última década teve um tremendo progresso na compreensão de pequenas moléculas de sinalização na fisiologia bacteriana. Em particular, as proteínas-alvo de vários mensageiros secundários derivados de nucleotídeos (NSMs) têm sido sistematicamente identificadas e estudadas em organismos modelo. Essas conquistas se devem principalmente ao desenvolvimento de várias novas técnicas, incluindo a técnica do composto de captura e a ação capilar radial diferencial do ensaio ligante (DRaCALA), que foram utilizadas para identificar sistematicamente proteínas-alvo dessas pequenas moléculas. Este artigo descreve o uso dos NSMs, guanosine penta e tetrafosfatos (p)ppGpp, como exemplo e demonstração de vídeo da técnica DRaCALA. Utilizando DRaCALA, 9 das 20 proteínas-alvo conhecidas e 12 novas proteínas-alvo de (p)ppGpp foram identificadas no organismo modelo, Escherichia coli K-12, demonstrando o poder deste ensaio. Em princípio, o DRaCALA poderia ser usado para estudar pequenos ligantes que podem ser rotulados por isótopos radioativos ou corantes fluorescentes. Os passos críticos, prós e contras do DRaCALA são discutidos aqui para posterior aplicação desta técnica.

Introdução

As bactérias usam várias pequenas moléculas de sinalização para se adaptar em ambientes em constante mudança^1,2. Por exemplo, os autoindutores, N-acylhomoserine lactones e seus oligopeptídeos modificados, mediam a comunicação intercelular entre bactérias para coordenar o comportamento populacional, um fenômeno conhecido como quórum sensoriando². Outro grupo de pequenas moléculas de sinalização são os NSMs, incluindo o monofosfato de adenosina cíclica amplamente estudado (cAMP), di-AMP cíclico, monofosfato de di-guanosina cíclico (di-GMP cíclico), e penta-e tetra fosfatos (p)pp....

Protocolo

1. Preparação de lises celulares inteiras

1. Inocular a coleção E. coli K-12 ASKA ORFeome estica¹⁵ em 1,5 mL Caldo de Lysogeny (LB) contendo 25 μg/mL chloramphenicol em placas de poços profundos de 96. Cresça durante a noite (O/N) por 18 h a 30 °C com agitação a 160 rpm. No dia seguinte, adicione isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (final de 0,5 mM) às culturas O/N para induzir expressão proteica a 30 °C por 6 h.
2. Células de pelota a 500 x g por 10 min. Congele as pelotas a -80 °C até usar. Para lise as células, adicione 150 μL de tampão de lise L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂

Resultados

Seguindo o protocolo acima descrito normalmente produzirá dois tipos de resultados (Figura 3).

A Figura 3A mostra uma placa com sinais de ligação de fundo relativamente baixos (frações de ligação < 0,025) da maioria dos poços. O sinal de ligação positivo do poço H3 dá uma fração de ligação de ~0,35 que é muito maior do que a observada para os outros poços. Mesmo sem quantificação, bem H3 é notável, sugerindo que uma proteína alvo e.......

Discussão

Uma das etapas críticas na realização da triagem DRaCALA é obter bons lises celulares inteiras. Em primeiro lugar, as proteínas testadas devem ser produzidas em grandes quantidades e em formas solúveis. Em segundo lugar, a lise das células deve estar completa, e a viscosidade do lysate deve ser mínima. A inclusão da lise e o uso de três ciclos de congelamento são muitas vezes suficientes para lise completamente as células. No entanto, o DNA cromossômico liberado torna o viscoso lísato e gera alto sinal de ligação de fund.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x ferramenta de pino	V& P Scientific	VP 404	96 Bolt Replicator, em centros de 9 mm, diâmetro do parafuso de 4,2 mm, 24 mm
de comprimento Placa de microtitulação de fundo em V de 96 poços	Esterilização	MIC9004	Microplaca de esterilização V Well 611V96
Ágar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Ágar nº 1
Cepa de coleção ASKA	NBRP, SHIGEN, JAPÃO		Ref: DNA Research, Volume 12, Edição 5, 2005, páginas 291-299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	SIGMA	E1014-25KU	endonuclease geneticamente modificada de Serratia marcescens
Bradford Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006	Reagent Concentrate
DMSO	SIGMA	D8418	≥ 99,9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
gel filtration10x300 coluna	GE Healthcare	28990944	contém 20% de etanol como conservante
Glicerol	PanReac AppliChem	122329.1214	Glicerol 87% para análise
Hypercassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazol	SIGMA	56750	puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
Tela de Fósforo de Armazenamento IP	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropil β-d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)	SIGMA	I6758	Isopropila β-D-tiogalactosídeo
(LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	Base de	Caldo LB de 12795027 Miller
Lisozima	SIGMA	L4949	de clara de ovo de galinha; BioUltra, pó liofilizado, ≥ 98%
MgCl2 (Cloreto de magnésio)	SIGMA	208337
MilliQ água			água ultrapura
multicanal	Thermo Scientific	4661110	F1 - Ponta de clipe; 1-10 ul, 8 x canais
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30230
Membrana de Nitrocelulose	Amersham Protran	10600003	Premium 0,45 um 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Solução salina tamponada com fosfato (Dulbecco A), Comprimidos
PEG3350 (Polietilenoglicol 3350)	SIGMA	202444
fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)	SIGMA	93482	Solução de fluoreto de fenilmetanossulfonilo - 0,1 M em etanol (T)
Gerador de imagens de fósforo	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 Pontas de pipeta de imagens de fósforo
, filtradas	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12.5 μ l coluna de
cromatografia Poly-Prep	Coluna de cromatografia de polipropileno	7311550 Bio-Rad
Inibidor de protease Mini	Pierce	A32955	Comprimidos, tubo com tampa de rosca sem EDTA
	Thermo Scientific	3488	Tubos Microcentifuge, 2,0 ml com tampa de rosca, não estéril
SLS 96 de profundidade Placas de poço	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, Fundo em V,
coluna de centrifugação	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0,5 ml Filtros centrífugos
Termomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
Placa TLC (placas PEI-celulose F TLC)	Merck Millipore	105579	DC PEI-celulose F (20 x 20 cm)
Tris	SIGMA	BP152	Base Tris para Biologia Molecular
Tween 20	SIGMA	P1379	detergente viscoso não iônico
e beta-mercaptoetanol	SIGMA	M3148	99% (GC / titulação)

Caldo de Lisogenia pipeta não estéril natural