Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

As bactérias usam várias pequenas moléculas de sinalização para se adaptar em ambientes em constante mudança^1,2. Por exemplo, os autoindutores, N-acylhomoserine lactones e seus oligopeptídeos modificados, mediam a comunicação intercelular entre bactérias para coordenar o comportamento populacional, um fenômeno conhecido como quórum sensoriando². Outro grupo de pequenas moléculas de sinalização são os NSMs, incluindo o monofosfato de adenosina cíclica amplamente estudado (cAMP), di-AMP cíclico, monofosfato de di-guanosina cíclico (di-GMP cíclico), e penta-e tetra fosfatos (p)ppGpp¹. As bactérias produzem esses NSMs como resposta a uma variedade de diferentes condições de estresse. Uma vez produzidas, essas moléculas se ligam às suas proteínas-alvo e regulam várias vias fisiológicas e metabólicas diferentes para lidar com as tensões encontradas e aumentar a sobrevivência bacteriana. Portanto, a identificação das proteínas alvo é um pré-requisito inevitável para decifrar as funções moleculares dessas pequenas moléculas.

A última década testemunhou um boom de conhecimento dessas pequenas moléculas de sinalização, principalmente devido a várias inovações técnicas que revelaram as proteínas-alvo dessas pequenas moléculas. Estes incluem a técnica do composto de captura^3,4,5, e a ação capilar radial diferencial do ensaio de ligantes (DRaCALA)⁶ a ser discutido neste artigo.

Inventado por Vincent Lee e colegas de trabalho em 2011^6,o DRaCALA implanta a capacidade de uma membrana nitrocelulose para sequestrar diferencialmente ligantes livres e ligados à proteína. Moléculas como proteínas não podem se difundir em uma membrana de nitrocelulose, enquanto pequenos ligantes, como os NSMs, são capazes de. Ao misturar o NSM (por exemplo,ppGpp) com a proteína a ser testada e localizá-las na membrana, dois cenários podem ser esperados (Figura 1): Se (p)ppGpp se ligar à proteína, o radiolabeled (p)ppGpp será mantido no centro do local pela proteína e não se difundirá para fora, dando um pequeno ponto intenso (i.e., forte sinal radioativo) sob um fosforrimager. No entanto, se (p)ppGpp não se ligar à proteína, ele irá difundir livremente para fora para produzir um grande ponto com sinal radioativo de fundo uniforme.

Além disso, o DRaCALA pode detectar a interação entre uma pequena molécula e uma proteína não purificada em uma célula inteira lysate se a proteína estiver presente em uma quantidade suficiente. Essa simplicidade permite o uso de DRaCALA na identificação rápida de alvos proteicos usando uma biblioteca de expressão ORFeome. De fato, as proteínas-alvo de cAMP^7,cíclico di-AMP^8,di-GMP^{ciclic 9,10}e (p)ppGpp^11,12,13 foram sistematicamente identificadas pelo uso de DRaCALA. Este artigo de vídeo usa (p)ppGpp como um exemplo para demonstrar e descrever as etapas e considerações críticas na realização de uma triagem DRaCALA bem sucedida. Note-se que uma descrição mais completa do DRaCALA¹⁴ é altamente recomendada para ler em combinação com este artigo antes de realizar o DRaCALA.

Figura 1: O princípio da DRaCALA. (A) Esquema do ensaio DRaCALA. Consulte o texto para obter detalhes. (B) Quantificação e cálculo da fração vinculante. Consulte o texto para obter detalhes. Resumidamente, as manchas DRaCALA serão analisadas desenhando dois círculos que circunscrevem todo o local e o ponto escuro interno (ou seja,o retido (p)ppGpp devido à ligação da proteína testada). O sinal de ligação específico é o sinal radioativo do círculo interno (S1) após subtrair o sinal de fundo não específico (calculado por A₁ × ((S₂-S₁)/(A₂-A₁)). A fração de ligação é o sinal de ligação específico dividido pelo sinal radioativo total (S2). Abreviaturas: DRaCALA = Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante; p)ppGpp = penta e tetrafosfatos de guanosina; RT = temperatura ambiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação de lises celulares inteiras

1. Inocular a coleção E. coli K-12 ASKA ORFeome estica¹⁵ em 1,5 mL Caldo de Lysogeny (LB) contendo 25 μg/mL chloramphenicol em placas de poços profundos de 96. Cresça durante a noite (O/N) por 18 h a 30 °C com agitação a 160 rpm. No dia seguinte, adicione isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (final de 0,5 mM) às culturas O/N para induzir expressão proteica a 30 °C por 6 h.
2. Células de pelota a 500 x g por 10 min. Congele as pelotas a -80 °C até usar. Para lise as células, adicione 150 μL de tampão de lise L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonyl de 2 mM (PMSF), 40 μg/mL DNase 1 e 0,5 mg/mL de lysozime) para ressususpensar a pelota.
3. Congele as células a -80 °C por 30 min e descongele a 37 °C por 20 min. Repita este ciclo três vezes para lise as células. Armazene as lises a -80 °C antes de usar.

2. Purificação de Rel_seq e GppA

NOTA: As proteínas recombinantes Rel_seq de Streptococcus equisimilis e GppA de E. coli K-12 são usadas para sintetizar o pppGpp radiolabeled e ppGpp, respectivamente.

1. Crescer e coletar células superexpressando cada proteína.
   1. Cresça a cepa E. coli BL21 DE3 até a fase exponencial (densidade óptica (OD) ~0,3-0,4) em caldo LB, e gire 1 mL de cultura a 6000 x g por 5 min. Decante o supernascimento, e resuspenja as células com 100 μL de caldo TSB gelado (caldo LB suplementado com 0,1 g/mL PEG3350, 0,05 mL/meL dimetilsulfoxida, 20 mM MgCl₂).
   2. Misture os plasmídeos com o rel_seq e gppAmarcados por histidina, cada 100 ng, com as suspensões celulares acima em TSB, e incubar no gelo por 30 minutos. Choque térmico das células a 42 °C para 40 s. Coloque a mistura no gelo por 2 min, e adicione 1 mL de caldo LB à temperatura ambiente para permitir que as células se recuperem por 1h a 37 °C com agitação a 160 rpm.
   3. Placa as células recuperadas em placas de ágar LB suplementadas com os antibióticos correspondentes (Rel_seq:100 μg/mL ampicillin; GppA: 30 μg/mL kanamycin). No dia seguinte, inocular as colônias em caldo LB para iniciar as pré-culturas O/N de ambas as cepas a 37 °C.
   4. Após 18 h, inocular 500 mL de meio LB com 10 mL das culturas O/N e os antibióticos correspondentes. Cresça as culturas agitando a 160 rpm a 37 °C. Quando o OD_600nm atingir 0,5-0,7, induzir expressão proteica adicionando 0,5 mM IPTG e crescendo por 3h a 30 °C com agitação a 160 rpm.
   5. Colete as células girando a 6084 x g por 10 min a 4 °C. Resuspense a pelota em 20 mL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS) e re-centrífuga a 1912 x g por 20 min a 4 °C. Decante o supernatante e congele as pelotas a -20 °C antes de usar.
2. Purificação de afinidade do ácido nitrilotriactico de níquel (Ni-NTA)
   NOTA: A partir deste ponto, certifique-se de que as amostras estão frias.
   1. Adicione 40 mL de tampão de lise gelada L2 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% glicerol, 10 mM imidazol, 10 mM β-mercaptoetanol complementado com inibidores de protease (comprimido livre de EDTA; ver a Tabela de Materiais) para resuspensar a pelota. Lise as células através de sônica (60% de amplitude, 2 s ON/ 4 s OFF por 8 min ON). Limpe o lise girando a 23.426 x g por 40 min a 4 °C, e continue com o sobrenatante para a purificação.
   2. Durante a centrifugação acima, prepare a resina Ni-NTA.
      1. Transfira 500 μL de resina Ni-NTA homogeneizada para uma coluna de cromatografia de polipropileno em pé, e deixe-a se contentar com 15 minutos e a solução de armazenamento escorra. Lave a resina com 15 mL de água ultrauso duas vezes e depois lave a coluna com 15 mL do tampão de lise L2.
   3. Carregue o supernanato limpo de lise celular do passo 1 para a coluna, e deixe-o fluir. Lave a coluna com 30 mL de tampão de lavagem (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerol, 20 mM imidazole).
   4. Elute as proteínas com 400 μL do tampão de eluição (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% glicerol, 500 mM imidazol) três vezes. Em seguida, repita a elução com outros 300 μL do buffer de eluição. Combine as proteínas elucidas a um volume final de 700 μL.
3. Filtragem de gel
   1. Prepare o tampão de filtragem de gel (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerol). Lave a coluna de exclusão de tamanho com um volume de coluna (25 mL) do tampão de filtragem de gel.
   2. Carregue a amostra acima de 700 μL usando um loop de 500 μL, execute a 0,5 mL/min e colete 2-3 frações, cada uma de 0,5 mL de volume, contendo as respectivas proteínas.
   3. Combine e concentre as frações que contêm cada uma das proteínas usando uma coluna de spin, e meça a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford.

3. Síntese de PPPGpp e ppGpp com etiqueta em P de ³²P

1. Monte uma reação rel_seq em pequena escala em um tubo de tampa de parafuso (ver Tabela 1).
   NOTA: Trabalhe com reagentes radioativos apenas em local licenciado e com equipamento de proteção individual.

Tabela 1: A montagem de informações para as reações de síntese de pequena e grande escala de pppGpp. *10x Relseq buffer contém 250 mM Tris-HCl, pH 8.6; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. Abreviação: pppGpp = pentafosfato de guanosina.

2. Incubar o tubo a 37 °C em um termomixer por 1h, depois a 95 °C por 5 min, e coloque no gelo por 5 min. Gire a proteína precipitada a 15.700 x g por 5 min, e transfira o supernante ^{(sintetizado 32}P-pppGpp) para um novo tubo de tampa de parafuso.
3. Para sintetizar ³²P-ppGpp de ³²P-pppGpp, transfira metade do produto ³²p-pppGpp para um novo tubo de tampa de parafuso e adicione 1 μM GppA. Incubar o tubo a 37 °C por 10 min, a 95 °C por 5 min, e depois coloque no gelo por 5 minutos.
4. Gire a proteína precipitada a 15.700 x g por 5 min, e transfira o supernante ^{(sintetizado 32}P-ppGpp) para um novo tubo de tampa de parafuso.
5. Analise a placa ^{de 32}P-pppGpp e ³²P-ppGpp executando 1 μL das amostras em uma placa de cromatografia de camada fina (TLC) (placas TLC modificadas por polietileneimina) utilizando as placas TLC 1,5 M KH₂PO₄, pH 3.4, como fase móvel.
   NOTA: Use o α-³²P-rotulado guanosina 5'-triphosphate (³²P-α-GTP) como controle.
6. Seque completamente a placa TLC, coloque-a entre uma pasta de plástico transparente e exponha-a a uma tela de fósforo de armazenamento por 5 minutos. Visualize e quantifique os sinais usando um fósforo.
   NOTA: Quando as proporções de ³²P-pppGpp e ³²P-ppGpp forem superiores a 85%, uma reação em larga escala (500 μL, suficiente para triagem de 20 placas de 96 poços) pode ser montada e sintetizada usando a Tabela 1.

4. Triagem DRaCALA das proteínas-alvo de (p)ppGpp

1. Descongele e transfira 20 μL de lises celulares inteiras para uma placa de microtiter fundo V de 96 poços. Adicione 2,5 U/poço de endonuclease de Serratia marcescens, e incubar a 37 °C por 15 min para reduzir a viscosidade lysate. Coloque os lises no gelo por 20 minutos.
2. Misture o ^{tampão de 32}P-pppGpp e ³²P-ppGpp em uma proporção de 1:1, e adicione 1x tampão de lise L1 para tornar a concentração final de (p)ppGpp igual a 4 nM.
   NOTA: Dada a similaridade química entre o pppGpp e o ppGpp, uma mistura de ambos os produtos químicos simplificará o processo de triagem.
3. Use uma pipeta multicanal e pontas de pipeta filtradas para adicionar e misturar 10 μL da mistura (p)ppGpp com o lise celular. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 5 min.
4. Lave a ferramenta de 96 x pino colocando em 0,01% a solução de detergente não iônico para 30 s e seque em um papel de tecido para 30 s. Repita a lavagem da ferramenta do pino 3x.
5. Coloque a ferramenta de pinos nas placas de amostra acima de 96 poços e espere por 30 s. Levante a ferramenta do pino para cima e coloque-a em linha reta para baixo em uma membrana de nitrocelulose por 30 s.
   NOTA: Se faltar uma mancha, local 2 μL das amostras correspondentes com uma pipeta e pontas filtradas. É aconselhável fazer um ponto duplicado da mesma amostra que indicado abaixo.
6. Seque a membrana por 5 minutos no RT. Coloque a membrana entre uma pasta de plástico transparente e exponha-a a uma tela de fósforo de armazenamento por 5 minutos. Visualize usando um fósforo.

5. Quantificação e identificação de potenciais proteínas-alvo

1. Use o software de análise associado ao fosforrimager para abrir o arquivo .gel das placas visualizadas. Use a função de análise Array para definir os 96 pontos configurando uma grade de 12 colunas x 8 linhas.
2. Defina círculos grandes para circunscrever a borda externa de todos os pontos (ver Figura 1B). Exporte o Volumn+Background e Área dos grandes círculos definidos e economize em uma planilha.
   NOTA: Se necessário, reposicione cada círculo individual para se sobrepor perfeitamente com as manchas e redimensione cada círculo individual para torná-lo ligeiramente maior do que o local real.
3. Dimensione os círculos definidos para circunscrever os pequenos pontos internos. Exporte o Volumn+Backgrounde Área dos pequenos círculos definidos e economize em uma planilha.
4. Calcule as frações de vinculação na planilha usando a equação na Figura 1Be plote os dados. Identifique as proteínas de ligação potenciais nos poços que apresentam altas frações de ligação em comparação com a maioria dos outros poços.

Figura 2: Fluxo de trabalho global do processo de triagem DRaCALA. A produção de proteínas de uma coleção Escherichia coli ASKA é induzida, e as células são lístidas. Enquanto isso, as proteínas recombinantes Rel_seq-His e GppA-His são purificadas e usadas para sintetizar pppGpp e ppGpp de ³²P-α-GTP. As moléculas de ppGpp radioativamente rotuladas (p)ppGpp são então misturadas com os lises, e uma ferramenta de 96 pinos é usada para detectar as misturas em uma membrana nitrocelulose para posterior exposição a uma tela de armazenamento de fósforo, imagem e quantificação dos sinais radioativos. Abreviaturas: DRaCALA = Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante; p)ppGpp = penta e tetrafosfatos de guanosina; RT = temperatura ambiente; IPTG = isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosina 5'-triphosfato; SDS-PAGE = eletroforese de gel de dodecylsulfato-poliacrilamida de sódio ; TLC = cromatografia de camada fina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Seguindo o protocolo acima descrito normalmente produzirá dois tipos de resultados (Figura 3).

A Figura 3A mostra uma placa com sinais de ligação de fundo relativamente baixos (frações de ligação < 0,025) da maioria dos poços. O sinal de ligação positivo do poço H3 dá uma fração de ligação de ~0,35 que é muito maior do que a observada para os outros poços. Mesmo sem quantificação, bem H3 é notável, sugerindo que uma proteína alvo expressa em bem H3 se liga a pppGpp, ppGpp, ou ambos. De fato, a proteína superexpressa no bem H3 é a hipoxantina phosphoribosyltransferase Hpt, que é conhecida por ligar (p)ppGpp12,16.

Figura 3: Placas de triagem DRaCALA representativas (à esquerda) e quantificação (à direita). O único resultado positivo, Hpt, deu um forte sinal de ligação destacando-se tanto no local quanto no diagrama de quantitação. (B,C) Dois pontos de réplica DRaCALA da placa reorganizada 31. Círculos e setas quebrados pretos indicam as proteínas-alvo verdadeiras de (p)ppGpp, enquanto os círculos vermelhos quebrados indicam os falsos positivos. Consulte o texto para obter detalhes. Abreviaturas: DRaCALA = Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante; p)ppGpp = penta e tetrafosfatos de guanosina; RT = temperatura ambiente; IPTG = isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosina 5'-triphosfato; SDS-PAGE = eletroforese de gel de dodecylsulfato-poliacrilamida de sódio ; TLC = cromatografia de camada fina; HPT = hipoxantina fosphoribosyltransferase; PRFC = fator de liberação da cadeia de peptídeos RF3; NadR = NMN adenylyltransferase; HflX = GTPase translacional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O outro resultado típico da triagem é mostrado na Figura 3B(C). Nesta placa, vários poços apresentaram sinais de ligação de fundo relativamente maiores do que os da Figura 3A. Isso é claramente visível a partir dos pontos internos relativamente fortes para muitos poços. A quantificação também mostrou que muitos poços possuem frações vinculantes na faixa de 0,02-0,04. Um fundo mais alto do sinal de ligação é provavelmente causado por toda a célula lysate ser viscoso, apesar dos tratamentos com dNase I e endonuclease de S. marcescens, que degradam o DNA cromossômico liberado. Para placas como esta, é importante comparar os dois pontos de replicação da placa (etapa 4.5; Figura 3B,C). A quantificação de ambas as placas mostra que os alvos positivos autênticos (círculos pretos, poços A10 PrfC, B11 NadR) tendem a dar frações de ligação consistentemente altas.

Notavelmente, alguns alvos verdadeiros também poderiam dar frações de ligação variável (Bem D5, HflX12), como os falsos positivos (círculos vermelhos). A razão para essa variabilidade reside no fato de que nem todas as proteínas de uma biblioteca são expressas em forma solúvel e em quantidades necessárias. Se a concentração de uma proteína estiver próxima ou um pouco abaixo do valor Kd, podem ser esperados resultados de ligação variável, mesmo para os verdadeiros alvos. De fato, grandes quantidades de proteína HflX solúvel não foram obtidas da cepa ASKA12. Para determinar se essas proteínas são verdadeiras aglutinantes ou não, as proteínas potenciais devem ser purificadas à homogeneidade e à ligação confirmada pelo uso de uma maior concentração (50-100 μM) das proteínas.

Através dessa triagem, foram identificadas 9 das 20 proteínas-alvo conhecidas de (p)ppGpp12 (ver a seção de discussão), validando a utilidade do DRaCALA para esta tarefa. Além disso, 12 novos alvos de (p)ppGpp foram descobertos e confirmados, demonstrando que o DRaCALA é uma técnica poderosa para descobrir novas proteínas-alvo de (p)ppGpp.

Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.