Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.
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Artigo de método
Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tecido adiposo marrom (BAT) é responsável pela termogênese não trêmula em mamíferos, e os adipócitos marrons (BAs) são as unidades funcionais dos BAT. Os BAs contêm gotículas lipídicas multiloculares e mitocôndrias abundantes, e expressam a proteína de desacoplamento 1 (UCP1). Os BAs são categorizados em dois subtipos com base em sua origem: BAs clássicos derivados de embriões (cBAs) e BAs derivados de adipócitos brancos. Devido à sua densidade relativamente baixa, os BAs não podem ser isolados do MTD com o método tradicional de centrifugação. Neste estudo, um novo método foi desenvolvido para isolar BAs de camundongos para análise de expressão gênica e proteica. Neste protocolo, a MTD interescapular de camundongos adultos foi digerida com solução de colagenase e dispase, e os BAs dissociados foram enriquecidos com solução de iodixanol a 6%. BAs isolados foram então lisados com reagente Trizol para isolamento simultâneo de RNA, DNA e proteína. Após o isolamento do RNA, a fase orgânica do lisado foi utilizada para a extração proteica. Nossos dados mostraram que a solução de iodixanol a 6% enriqueceu eficientemente os BAs sem interferir nos estudos de acompanhamento de expressão gênica e proteica. O fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) é um fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais. Em comparação com o tecido adiposo marrom, os BAs isolados apresentaram expressão significativamente maior de Pdgfa. Em resumo, este novo método fornece uma plataforma para estudar a biologia dos adipócitos marrons em um único nível de tipo celular.
Introdução
Tanto camundongos quanto humanos possuem dois tipos de tecido adiposo: tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT)1. WAT armazena energia na forma de triglicerídeos em adipócitos brancos, e os adipócitos marrons (BAs) de MTD dissipam energia química como calor2. Com base em sua origem desenvolvimentista, os BAs são categorizados em BAs clássicos (cBAs) que se formaram durante o desenvolvimento embrionário e os BAs derivados de adipócitos brancos (células bege/brite, convertidas de adipócitos brancos sob condições de estresse)3. Os BAs são multiloculares e expressam a proteína termogê....
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Protocolo
Todos os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da pesquisa médica maçônica. UCP1::Cre9 e Rosa 26tdLinhagens de camundongos tomateiro13 foram relatadas anteriormente. Todos os camundongos foram mantidos à temperatura ambiente com um ciclo claro/escuro de 12 h.
1. Preparação das Soluções e do tecido adiposo castanho (MTD)
- Preparar a solução de digestão e a solução de separação em tubos de centrífuga de 15 ml.
- 10 mL de solução de digestão MT....
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Resultados
Preparação de MTD interacapular para isolamento de adipócitos marrons
O processo de isolamento dos adipócitos marrons (BAs) está representado na Figura 1A. Todo o processo, desde a preparação das MTD e das soluções de digestão/separação até à obtenção de AG isoladas, demorará cerca de 4 h.
Em camundongos adultos, existe MTD abundante na região interescapular. Esta MTD interescapular (BATi) é recoberta por camadas musculares e WAT (
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Discussão
Neste estudo, um novo método de isolamento de BAs para análise de expressão gênica e proteica foi desenvolvido.
Em um protocolo de isolamento de BAs publicado, uma solução de BSA a 3% foi utilizada para enriquecer os BAs12. No entanto, os BAs enriquecidos alcançados por este protocolo publicado não puderam ser usados diretamente para a análise da expressão proteica. Isso ocorre porque a BSA concentrada existente na solução de BAs interfere no acompanhamento da extração .......
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Agradecimentos
Z. Lin foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde HL138454-01 e fundos do Instituto de Pesquisa Médica Maçônica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpos | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R& D sistema | IC6158P | |
| Químico e soluções | |||
| Colagenase, Tipo II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-cloropropano | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Cloreto de cálcio | Bio Basic | CT1330 | |
| Clorofórmio | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Etanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Cloreto de Magnésio Hexahidratado | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Cloreto de Potássio | Boston BioProducts | P-1435 | |
| Mancha segura SimplyBlue | Invitrogen | LC6060 | |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Reagente Trizol | Tecnologias de vida | 15596018 | |
| Primers | |||
| Nome do gene (Espécie) | Pdgfra para frente | e para trás | |
| (mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4 (mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| strong>Equipamento | |||
| Nome | Empresa | Aplicação | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging adipócitos | |
| Agitador magnético | VWR | Dissociar BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Sistema de PCR em Tempo Real | Aplicado Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |
Referências
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013)....
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Reimpressões e permissões
