Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica

Tanto camundongos quanto humanos possuem dois tipos de tecido adiposo: tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT)¹. WAT armazena energia na forma de triglicerídeos em adipócitos brancos, e os adipócitos marrons (BAs) de MTD dissipam energia química como calor². Com base em sua origem desenvolvimentista, os BAs são categorizados em BAs clássicos (cBAs) que se formaram durante o desenvolvimento embrionário e os BAs derivados de adipócitos brancos (células bege/brite, convertidas de adipócitos brancos sob condições de estresse)³. Os BAs são multiloculares e expressam a proteína termogênica de desacoplamento da proteína 1 (UCP1)⁴. O depósito de MTD interescapular (iBAT) é um dos principais depósitos de cBAs em pequenos mamíferos⁵, enquanto as células beges estão dispersas no WAT⁶.

Devido à sua natureza de dissipação de energia, os BAs têm recebido muita atenção como alvo terapêutico para a redução da obesidade⁷. Para explorar os BAs com a finalidade de tratar a obesidade, é essencial entender os mecanismos moleculares que controlam a função, a sobrevivência e o recrutamento dos BAs. Os tecidos adiposos, incluindo MTD e MTD, são heterogêneos. Com exceção dos adipócitos, os tecidos adiposos contêm muitos outros tipos de células, como células endoteliais, células-tronco mesenquimais e macrófagos⁸. Embora ferramentas genéticas para esgotar especificamente genes candidatos em BAs de camundongos estejam disponíveis, como UCP1::Cre linha⁹, as técnicas para purificar BAs de BAT ou WAT são limitadas, dificultando o estudo de BAs em um nível de tipo de célula única. Além disso, sem a obtenção de BAs puros, a relação entre BAs e não-BAs não será claramente delineada. Por exemplo, o receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) tem sido usado como um marcador para células mesenquimais indiferenciadas, e é expresso nas células endoteliais e intersticiais de BAT. Em MTD estressadas a frio, as células progenitoras positivas para PDGFRα dão origem a novas BAs¹⁰. O PDGFRα é ativado por seu ligante PDGF, fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais¹¹; no entanto, não está claro se os BAs influenciam o comportamento das células progenitoras positivas para PDGFRα secretando PDGF.

Recentemente, foi publicado um protocolo de isolamento de BAs, que se baseia na classificação celular ativada por fluorescência (FACS)¹². Neste protocolo, a solução de albumina sérica bovina (BSA) a 3% foi usada para separar BAs de não-BAs, e os BAs enriquecidos foram purificados por FACS. A aplicação deste protocolo é limitada pela exigência do processo FACS, que depende de equipamentos e experiências de operação FACS. Neste estudo, um novo protocolo para o isolamento de BAs de MTD foi desenvolvido. Os BAs isolados por este protocolo podem ser usados diretamente para estudos de expressão gênica e proteica. Além disso, os dados deste estudo sugerem que os BAs são um importante recurso do PDGF.

Todos os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da pesquisa médica maçônica. UCP1::Cre⁹ e Rosa 26^tdLinhagens de camundongos tomateiro¹³ foram relatadas anteriormente. Todos os camundongos foram mantidos à temperatura ambiente com um ciclo claro/escuro de 12 h.

1. Preparação das Soluções e do tecido adiposo castanho (MTD)

1. Preparar a solução de digestão e a solução de separação em tubos de centrífuga de 15 ml.
2. 10 mL de solução de digestão MTD: Para 10 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), adicionar 3,5 mg/mL Dispase II, 1 mg/mL de colagenase II e 10 mM CaCl₂ para fazer solução de digestão MTD.
3. 10 mL de solução de iodixanol a 12% (solução de separação): Misture 1 mL de PBS 10x, 2 mL de iodixanol a 60%, 0,01 mL de 1 M MgCl 2, 0,025 mL de 1 M KCl, 0,1 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,2 M e 6,865 mL de ddH₂O para obter iodixanol a 12%.
4. Eutanasiar um rato adulto com sobredosagem de CO₂ . Resumidamente, encha a gaiola do rato com 100% de CO₂ a uma taxa de deslocamento de 10-30% do volume da gaiola por minuto. 5 min depois, confirme a morte verificando a ausência de respiração visível.
5. Dissecar o animal e recolher os MTD interescapulares. Remova as camadas WAT e muscular sob um microscópio estéreo.
6. Para uma digestão suficiente, corte cada lóbulo MTD em ~ 3 mm³ partes e coloque-as num balão limpo de 50 ml com uma barra de agitação metálica e uma solução de digestão de 5 ml. Antes de iniciar a digestão, deixar o balão contendo MTD e o tampão de digestão assentar no gelo durante 1 h.
   NOTA: Nas etapas a seguir, cerca de 80 mg de MTD foram utilizados para o isolamento de adipócitos marrons.

2. Procedimento de isolamento das BAs

1. Colocar o balão num agitador magnético fechado numa incubadora. Regule a velocidade de agitação a 60 rpm e a temperatura da incubadora a 35 °C, respectivamente. A digestão durará cerca de 30 minutos. Se as fatias MTD formarem aglomerados ao redor da barra do agitador durante a digestão, use uma ponta de pipeta de 1 mL para interromper os tecidos agregados.
2. Coloque um filtro de filtro de 70 μm em cima de um tubo de centrífuga limpo de 50 mL. Pipeta em torno de 4 mL de suspensão celular através do filtro. Lave o coador com 4 mL de solução de iodixanol a 12%. Pipetar para cima e para baixo para misturar as células e a solução de iodixanol. Transfira a mistura celular para dois tubos de ensaio de poliestireno transparentes de 5 mL.
   NOTA: No final da digestão, a solução de digestão deve estar turva, indicando digestão suficiente. Use solução de digestão fresca todas as vezes. Uma vez preparada, a solução de digestão deve ser usada dentro de 2 h.
3. Repetir os passos 2.2 e 2.3 mais uma vez se a digestão não for suficiente.
4. Deixar os tubos de poliestireno transparentes que contêm a solução de separação e os BAs no gelo durante 1 h. Os BAs formarão uma camada no topo.
5. Retirar 20 μL dos BAs isolados para exame microscópico.

3. RNA e isolamento proteico de BAs

1. Pipetar a camada de BAs em dois tubos de microcentrífuga de 1,7 mL para isolamento de RNA e proteína. Remova cuidadosamente a solução excessiva de iodixanol sem interromper a camada de BAs.
2. Adicione 1 mL de Trizol para isolar simultaneamente RNA, DNA e proteína na solução celular. Misture o suficiente para lisar as células.
3. Adicionar 200 μL de clorofórmio para separar as fases.
4. Centrifugar o tubo por 9,981 x g durante 10 min a 4 °C.
5. Após a centrifugação, use a fase aquosa para isolamento de RNA. Neste estudo, o RNA total foi utilizado para transcrição reversa, e a RT-PCR quantitativa foi realizada com PCR em Tempo Real. As sequências de primer estão listadas na Tabela de Materiais.
6. Transferir 300 μL da fase orgânica para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
7. Para a fase orgânica, adicione 2,5 volumes 100% etanol e vórtice por 10 s.
8. Adicionar 200 μL de 1-Bromo-3-cloropropano e vórtice por 10 s.
9. Adicione 600 μL de água destilada dupla e vórtice por 10 s.
10. Deixar repousar a solução misturada durante 10 minutos à temperatura ambiente.
11. Centrífuga a 9,981 x g durante 10 min a 4 °C. Nesta etapa, as fases serão separadas. A fase proteica está localizada na camada intermediária.
12. Remova a solução aquosa superior. Adicionar 1 ml de etanol a 100% à solução restante.
13. Centrífuga por 10 min, 9.981 x g, 4 °C. Após a centrifugação, o pellet de proteína se formará. Descarte o sobrenadante.
14. Lave o pellet com 1 mL de etanol a 100%.
15. Centrífuga por 10 min, 9981 x g, 4 °C. Salve o pellet e descarte o sobrenadante.
16. Seque o pellet ao ar por 10 minutos à temperatura ambiente.
17. Meça o peso do pellet molhado. Adicionar uma solução de SDS a 1% na proporção de 20 μL/mg de pellet.
18. Dissolva o pellet colocando o tubo em um agitador aquecido. Defina a temperatura em 55 °C e a velocidade em 11 x g. Geralmente leva 5-10 minutos para dissolver completamente o pellet de proteína.
    NOTA: A concentração da proteína dissolvida pode ser medida pelo ensaio de BCA¹⁴.

Preparação de MTD interacapular para isolamento de adipócitos marrons
O processo de isolamento dos adipócitos marrons (BAs) está representado na Figura 1A. Todo o processo, desde a preparação das MTD e das soluções de digestão/separação até à obtenção de AG isoladas, demorará cerca de 4 h.

Em camundongos adultos, existe MTD abundante na região interescapular. Esta MTD interescapular (BATi) é recoberta por camadas musculares e WAT (Figura 1B). Antes de iniciar o procedimento de digestão, as camadas musculares e o WAT precisam ser removidos para produzir iBAT limpo (Figura 1C). Em um protocolo de isolamento de BAs publicado, a MTD picada foi utilizada para o isolamento de BAs12. Neste estudo, a digestão de MTD de tamanho3 mm 3 (Figura 1D) produziu mais BAs do que os MTD picados.

Separação de BAs de não-BAs com solução de BSA a 3%
Após a digestão iBAT, BAs dissociados foram misturados com não-BAs no produto de digestão. Como os BAs contêm gotículas lipídicas, sua densidade é menor do que os não-BAs; no entanto, a densidade de BAs não é baixa o suficiente para deixá-los flutuar eficientemente para o topo de uma solução PBS regular. PBS contendo albumina sérica bovina (BSA) a 3% tem sido utilizada para separar BAs de não-BAs12, o que foi repetido com sucesso neste estudo (Figura 2A).

Rosa 26tdTomato é uma linhagem de camundongos repórteres, que expressa forte proteína de fluorescência tdTomato (tdTom) após recombinação mediada por Cre13. Ucp1::Camundongos transgênicos Cre expressam Cre recombinase nos BAs9. A linha de camundongos Ucp1::Cre foi cruzada com camundongos Rosa 26tdTomato para rotular geneticamente os BAs com tdTom (Figura 2B). Para validação do procedimento de isolamento de BAs, o iBAT de camundongos Ucp1::Cre;tdTom/+ foi dissociado. A maioria das células enriquecidas na camada superior da solução de BSA era em forma de framboesa e continha gotículas lipídicas multiloculares. Além disso, a maioria dessas células em forma de framboesa era tdTom positiva (Figura 2C), confirmando que eram adipócitos marrons.

Separação de BAs de não-BAs com solução de iodixanol a 6%
Solução de separação BSA a 3% enriquecida com BAs. Não ficou claro se esses BAs isolados poderiam ser usados para análise de expressão gênica e proteica. O RNA e a proteína foram então extraídos dos BAs enriquecidos. A extração de RNA foi realizada com sucesso de acordo com o procedimento padrão de isolamento de RNA. No entanto, o protocolo padrão de isolamento da proteína Trizol, também conhecido como método de tiocianato-fenol-clorofórmio de Guanidinium (método GTPC), não funcionou bem, o que foi tedioso e teve um rendimento proteico muito baixo. Portanto, um método melhorado de isolamento proteico foi adotado para extrair proteínas de BAs lisados por Trizol.

Neste protocolo GTPC melhorado, etanol, bromo-cloropropano e água foram utilizados para a extração de proteínas da fase orgânica15. Após adição de etanol, bromocloropropano e água na fase orgânica, e após centrifugação, formou-se pelota proteica entre a fase aquosa e a fase orgânica (Figura 3A). O pellet proteico foi então lavado com etanol a 100% e dissolvido em SDS a 1%. Este método GTPC melhorado foi usado para extrair proteínas de BAs enriquecidos com solução iBAT e BSA. Embora o pellet de proteína MTD tenha sido facilmente dissolvido em SDS a 1%, a maior parte do pellet de proteína BAs isolados não foi solúvel. Em seguida, a proteína dissolvida foi examinada com gel SDS-PAGE. Como mostrado em um gel SDS-PAGE corado com azul de Coomassie (Figura 3B), uma banda proteica maciça em torno de 60 kDa estava presente nos BAs isolados, mas não nas amostras de MTD. Como o peso molecular da BSA é de 66 kDa, e existe uma BSA abundante na solução de separação de BAs, essa banda proteica dominante deve ser a BSA. Esses dados sugerem que a BSA da solução de separação de BAs interfere na extração de proteínas.

O iodixanol é um meio gradiente não iônico e iso-osmótico16 que tem sido amplamente utilizado para purificação celular 17 e adeno-vírus associado (AAV)18. Para evitar a interferência da ASC nos estudos de expressão proteica, o iodixanol foi utilizado para substituir a ASC em uma nova solução de separação de BAs. A solução de BSA a 3% tem uma densidade de 1,03, que é semelhante com iodixanol a 6%. Em solução de iodixanol a 6%, os BAs flutuaram para o topo em 30-60 min (Figura 3C). Os BAs isolados com esta solução apresentaram formato típico de framboesa e continham gotículas lipídicas multiloculares (Figura 3D). As proteínas extraídas desses BAs isolados foram bem separadas em gel SDS-PAGE (Figura 3E).

Para verificar se a solução de iodixanol a 6% separou eficientemente os BAs dos não-BAs, marcamos geneticamente os BAs com tdTom e examinamos as células que residiam na solução clara de iodixanol a 6%. Após a separação dos BAs dos não-BAs (etapa 2.4), a solução de iodixanol a 6% abaixo da camada de BAs foi diluída 6 vezes com PBS e então centrifugada a 600 x g por 5 min. Após a centrifugação, uma pequena pelota de células vermelhas foi formada no fundo, que pode ser células de fração vascular estromal. Como mostra a Figura 3, as células da camada de BAs foram células positivas para tdTom (Figura 3F); no entanto, as células recuperadas do pellet foram tdTom negativas (Figura 3G). Além disso, nenhuma gotícula lipídica óbvia foi visível nas células tdTom negativas. Esses dados sugerem que nosso novo protocolo pode separar eficientemente os BAs das células sem gordura.

Juntos, esses dados demonstram que o isolamento de BAs com solução de BSA a 3% interfere no acompanhamento de estudos bioquímicos e sugere que a solução de iodixanol a 6% é melhor do que a solução de BSA a 3% para isolar BAs.

Análise da expressão gênica e proteica com BAs isolados.
Para validar este novo procedimento de isolamento de BAs em nível molecular, a expressão de três genes foi comparada entre BAT e BAs isolados: Ucp1, Pdgfa e Pdgfra. Em BAT, a Pdgfra é expressa em células endoteliais e células intersticiais, e as células PDGFRα positivas são supostas células progenitoras10. Os níveis de RNAm de Ucp1 e Pdgfa foram significativamente maiores nos BAs isolados do que no MTD (Figura 4A,B). Pelo contrário, o RNAm da Pdgfra só foi detectado na MTD (Figura 4B).

PPARγ é um fator transcricional que controla o desenvolvimento do tecido adiposo, UCP1 é uma proteína mitocondrial e PDGFRα é uma proteína receptora de membrana. Estas três proteínas representam proteínas distribuídas em diferentes compartimentos celulares. Western blots foram realizados para testar se a proteína extraída de BAs e MTD de Trizol era adequada para a análise da expressão proteica. UCP1 e PPARγ foram detectados em ambos os BAs e MTD (Figura 4C,D), confirmando que a proteína total isolada dos BAs ou MTD de Trizol é adequada para western blot. Além disso, consistente com os resultados da qRT-PCR, a proteína UCP1 foi enriquecida em BAs (Figura 4C); enquanto o PDGFRα só foi detectado em MTD, mas não em BAs puros (Figura 4D). Em resumo, esses dados demonstram que nosso novo método de isolamento de BAs é eficiente e sugerem que os BAs enriquecidos por esse método podem ser usados diretamente para estudos de expressão gênica e proteica.

Figura 1: Preparação do iBAT para isolamento de adipócitos marrons. (A) Fluxo de trabalho do procedimento de isolamento de adipócitos marrons. (B) Vista ventral do tecido interescapular contendo BAT, WAT e camadas musculares. (C) MTD Interescapular (iBAT). As camadas musculares e o WAT adjacentes ao iBAT foram removidos. (D) Imagem representativa de peças de iBAT utilizadas para isolamento de adipócitos castanhos. B-D, Barra de escala = 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Separação de adipócitos marrons da solução de digestão. (A) Imagens de adipócitos marrons dissociados antes e após a separação. Solução de BSA a 3% foi utilizada para separar adipócitos marrons de adipócitos não marrons. Barra de escala = 1 cm. (B) Visão esquemática da marcação genética de adipócitos marrons com proteína de fluorescência tdTomateiro. (C) Imagens de adipócitos marrons isolados. DIC, contraste de interferência diferencial. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Extração de proteína total de adipócitos marrons lisados . (A) Separação da fase proteica da fase orgânica. (B) Coloração Coomassie do gel SDS-PAGE. A proteína total foi extraída de adupócitos marrons purificados com solução de BAB ou BSA a 3%. A banda proteica da BSA foi indicada por uma seta. (C) Camada de adipócitos marrons formada em cima de solução de iodixanol a 6%. Barra de escala = 1 cm. (D) Adupócitos marrons isolados com solução de iodixanol a 6%. Os adipócitos marrons foram indicados por setas amarelas. Barra de escala = 50 μm. (E) Coloração de Coomassie do gel SDS-PAGE. A proteína total foi extraída de BAs enriquecidos com MTD ou solução de iodixanol a 6%. (F) Imagens de adipócitos marrons marcados com tdTom. (G) Imagens de células recuperadas da solução de iodixanol abaixo da camada de BAs. F e G, barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise da expressão gênica e proteica de adipócitos marrons isolados. Adipócitos marrons isolados com o método do iodixanol foram utilizados nesses estudos de expressão gênica e proteica. (A,B) medição qRT-PCR da expressão gênica. Os níveis de mRNA foram normalizados para 36B4. N=3. Teste t de Student, *, P<0,01; **, P<0,01. (C) Western blotting de PPARγ e UCP1. (D) Western blotting de PDGFRα. C e D, membrana corada com S de Ponceau foram utilizadas como controle de carga. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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