Apresentamos um protocolo para a caracterização da motilidade e comportamento de uma população de cem células de tamanho mícnico a milímetro usando microscopia de campo brilhante e rastreamento celular. Este ensaio revela que Stentor coeruleus transita por quatro fases comportamentalmente distintas ao regenerar um aparelho oral perdido.
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Artigo de método
Análise dos padrões de motilidade do Stentor durante e após a regeneração do aparelho oral usando rastreamento celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Stentor coeruleus é um organismo modelo bem conhecido para o estudo da regeneração unicelular. A análise transcriômica de células individuais revelou centenas de genes — muitos não associados ao aparelho oral (OA) — que são regulados diferencialmente em fases ao longo do processo de regeneração. Foi a hipótese de que essa reorganização sistêmica e mobilização de recursos celulares para o crescimento de um novo OA levará a mudanças observáveis de movimento e comportamento correspondentes no tempo às fases da expressão genética diferencial. No entanto, a complexidade morfológica de S. coeruleus exigiu o desenvolvimento de um ensaio para capturar as estatísticas e a escala de tempo. Um script personalizado foi usado para rastrear células em vídeos curtos, e as estatísticas foram compiladas sobre uma grande população (N ~100). Após a perda do OA, S. coeruleus inicialmente perde a capacidade de movimento direcionado; em seguida, a partir de ~4 h, ele exibe uma queda significativa na velocidade até ~8 h. Este ensaio fornece uma ferramenta útil para a triagem de fenótipos de motilidade e pode ser adaptado para a investigação de outros organismos.
Introdução
Stentor coeruleus (Stentor) é um organismo modelo bem conhecido que tem sido usado para estudar a regeneração unicelular devido ao seu grande tamanho, capacidade de suportar várias técnicas microcirúrgicas e facilidade de cultivo em um ambiente de laboratório 1,2,3. Os primeiros estudos de regeneração concentraram-se na maior e mais morfologicamente distinta característica em Stentor — o OA — que é completamente derramado após choque químico 4,5,6. A
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Protocolo
NOTA: Uma população de aproximadamente cem células S. coeruleus foram cultivadas de acordo com um protocolo JoVE publicado anteriormente8.
1. Preparação da amostra
- Corte um pedaço de 250 μm de espessura da folha espaçadora de silicone (Tabela de Materiais) ligeiramente menor em altura e largura do que um slide de microscópio. Usando um furo de 5/16", crie poços circulares. Tenha cuidado de deixar espaço suficiente entre os poços vizinhos para garantir um bom selo.
NOTA: Um espaço de 3 mm entre os poços vizinhos foi suficiente. Com a prática, dez poços podem ser colocados em um ú....
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Resultados
O objetivo deste ensaio é quantificar a mudança gradual dos padrões de movimento e o aumento gradual da velocidade de movimento das células dentro de uma grande (N ~100) regenerando a população de Stentor. Para auxiliar a interpretação dos resultados, o código personalizado incluído neste protocolo gera dois tipos de parcelas: uma sobreposição de todos os traços de movimento celular em um conjunto de dados de vídeo (Figura 1C-F e Figura S1
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Discussão
Muitos algoritmos de rastreamento de partículas e células existem atualmente, alguns totalmente livres. Custo e simpatia do usuário são muitas vezes trocas que requerem compromisso. Além disso, muitos dos programas de rastreamento celular existentes são projetados para rastrear o movimento lento de rastreamento das células da cultura tecidual, em vez do movimento de natação rápida de Stentor, que gira durante a natação e pode sofrer mudanças repentinas de direção. Depois de testar muitas dessas opções, o protoco.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado, em parte, pelo Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Reconhecemos Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo e Skylar Widman por ajudarem em algumas das análises preliminares e testes de código. Agradecemos a Mark Slabodnick por discussões e sugestões. A WFM reconhece o suporte da concessão do NIH R35 GM130327.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Folha de silicone de 0,25 mm de espessura | Grace Bio-Labs | CWS-S-0,25 | |
| 24 x 50 mm, #1,5 lamínula | Fisher Scientific | NC1034527 | Conforme observado na Discussão, uma lamínula menor pode ser usada se menos poços de amostra forem colocados em uma lâmina. |
| Câmera | Usamos Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT tensão | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | necessário para TrackCells.m e CleanTraces.m |
Referências
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate....
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Reimpressões e permissões
