Artigo de método

Um protocolo de extração de DNA de mosquito baseado em contas magnéticas para sequenciamento de próxima geração

DOI:

10.3791/62354

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15 de abril de 2021

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1Florida Medical Entomology Laboratory, Department of Entomology and Nematology, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2U. S. Fish and Wildlife Service, Pacific Islands Fish and Wildlife Office, 3Department of Entomology and Nematology, University of California Davis

Neste artigo

Resumo

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Descrito aqui é um protocolo de extração de DNA usando contas magnéticas para produzir extrações de DNA de alta qualidade de mosquitos. Essas extrações são adequadas para uma abordagem de sequenciamento de próxima geração a jusante.

Resumo

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Um protocolo de extração de DNA recentemente publicado usando contas magnéticas e um instrumento automatizado de extração de DNA sugeriu que é possível extrair DNA de alta qualidade e quantidade de um mosquito individual bem preservado suficiente para sequenciamento de genoma a jusante. No entanto, a dependência de um caro instrumento automatizado de extração de DNA pode ser proibitiva para muitos laboratórios. Aqui, o estudo fornece um protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas, que é adequado para baixo a médio rendimento. O protocolo descrito aqui foi testado com sucesso utilizando amostras individuais do mosquito Aedes aegypti. Os custos reduzidos associados à extração de DNA de alta qualidade aumentarão a aplicação de sequenciamento de alto rendimento a laboratórios e estudos limitados de recursos.

Introdução

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O desenvolvimento recente de um protocolo de extração de DNAmelhorado 1 permitiu muitos estudos de alto impacto a jusante envolvendo sequenciamento de genoma inteiro2,3,4,5,6. Este protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas fornece um rendimento de DNA confiável de amostras individuais de mosquitos, o que, por sua vez, reduz o custo e o tempo associados à aquisição de um número suficiente de amostras de coleções de campo.

Os recentes avanços na genômica populacional e paisagística estão diretamente correlacionados com a diminuição dos custos de sequenciamento de genomas inteiros. Embora o protocolo anterior de extração de DNA1 aumente a eficiência associada ao sequenciamento de alto rendimento, laboratórios/estudos menores sem os fundos podem optar por não usar essas novas poderosas ferramentas de genômica paisagística e populacional devido aos custos de implementação do protocolo (por exemplo, custos de instrumentos especializados).

Aqui, é apresentado um protocolo de extração de DNA modificado que usa um passo de extração de contas magnéticas semelhante ao Neiman et al.1 para obter DNA de alta pureza, mas não conta com instrumentos de alto custo para lise tecidual e extração de DNA. Este protocolo é adequado para experimentos que exigem >10 ng de DNA de alta qualidade.

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Protocolo

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1. Armazenamento geral de amostras e preparações antes da extração de DNA

  1. Hidrate a amostra em 100 μL de água de grau PCR por 1h (ou durante a noite) a 4 °C se a amostra tiver sido armazenada em >70% de álcool para suavizar o tecido.

2. Interrupção da amostra

  1. Coloque uma incubadora ou bloco de calor tremendo a 56 °C.
  2. Faça a mistura tampão/enzima proteinase K (PK). 2 μL de Proteinase K (100 mg/mL) e 98 μL de Proteinase K Buffer (total de 100 μL) é necessário para cada extração individual de mosquitos. Para preparar uma mistura mestre para várias amostras, aumente a quantidade total (combinada para todas as amostras individuais) em ~15% para garantir a disponibilidade de volume adequado.
  3. Se as amostras foram hidratadas antes da extração, descarte a água de cada tubo amostral.
  4. Em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL contendo tecido de mosquito, adicione 100 μL de mistura de tampão/enzima PK.
  5. Homogeneize o tecido usando pilão de tubo de microcentrífuga.
  6. Centrifugar as amostras por 1 min a 9.600 x g em temperatura ambiente.
  7. Incubar a amostra por 2-3 h a 56 °C.
  8. Durante a incubação, prepare os outros reagentes utilizando a etapa de extração de DNA (etapa 3).

3. Extração de DNA

  1. Faça uma mistura de mestre de contas magnéticas. Para cada amostra, misture 100 μL de tampão de lise, 100 μL de Isopropanol e 15 μL de contas magnéticas (total de 215 μL). Para preparar uma mistura mestre para múltiplas reações, aumente a quantidade total (combinada para todas as amostras individuais) em ~20% para garantir a disponibilidade de volume adequado.
  2. Após o tempo de incubação (etapa 2.7), transfira cada lise para um tubo de microcentrifuuge limpo ou um poço de microplacão usando pipeta.
  3. Adicione 100 μL de lysate e 215 μL da mistura mestre de contas magnéticas a cada amostra.
  4. Use uma pipeta para misturá-la bem por 10-20 s e depois deixe-a ficar por 10 minutos à temperatura ambiente. Agite suavemente o tubo ocasionalmente para maximizar a ligação de contas magnéticas e DNA.
  5. Coloque o tubo/placa no separador de contas magnéticas e espere até que a solução esteja clara.
  6. Descarte o líquido do tubo/placa usando pipeta. Ao remover o supernaspe, tente não tocar ou perturbar as contas magnéticas que seguram o DNA.
  7. Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 325 μL de tampão de lavagem 1 a cada poço.
  8. Misture bem por pipetar e incubar por 1 min a temperatura ambiente.
  9. Repetir as etapas 3.5-3.6.
  10. Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 250 μL de tampão de lavagem 1 a cada poço.
  11. Misture bem por pipetar e incubar por 1 min a temperatura ambiente.
  12. Repetir as etapas 3.5-3.6.
  13. Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 250 μL de tampão de lavagem 2 a cada amostra.
  14. Misture bem e incubar por 1 min a temperatura ambiente.
  15. Repetir as etapas 3.5-3.6.
  16. Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 250 μL de tampão de lavagem 2 a cada poço.
  17. Misture bem e incubar por 1 min a temperatura ambiente.
  18. Repetir as etapas 3.5-3.6.
  19. Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 100 μL de tampão de eluição a cada poço.
  20. Misture bem e incubar por 2 minutos à temperatura ambiente.
  21. Mova o tubo/placa sobre o separador de contas magnéticas e espere até que a solução esteja clara.
  22. Pipeta o supernante em um novo tubo de microcentrifuuagem limpo de 0,5 ou poço de microplacão.
  23. Armazene amostras de DNA a 4 °C (até 1 semana) ou -80 °C.  Se uma microplacão estiver sendo usada, cubra-a com parafilme.
  24. Determine os rendimentos de DNA usando qualquer método apropriado.
    NOTA: Neste estudo, foram utilizadas leitura e absorvância do fluorômetro de DNA a 260/280 nm.

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Resultados

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O rendimento médio de DNA por tecido de cabeça/tórax de mosquito individual foi de 4,121 ng/μL (N = 92, desvio padrão 3.513) medido utilizando um fluorômetro quando eluido usando 100 μL de tampão de elução. Isso é suficiente para os requisitos de entrada de DNA genômico de 10-30 ng necessários para toda a construção da biblioteca degenomas 1,7. A quantidade de DNA pode variar entre 0,3-29,7 ng/μL, dependendo do tamanho do corpo do mosquito e das condições de pres...

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Discussão

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O protocolo descrito aqui pode ser adaptado para outras espécies de insetos. A versão original do protocolo introduzido em Nieman et al.1 foi testada em várias espécies, incluindo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, e Keiferia lycopersicella

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Reconhecemos o apoio financeiro do Centro Regional de Excelência para Doenças Transmitidas por Vetores do Pacífico financiado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (Acordo Cooperativo 1U01CK000516), cdc conceder NU50CK000420-04-04, o USDA National Institute of Food and Agriculture (Projeto Hatch 1025565), uf/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) e Florida Department of Health (Contract CODQJ). As conclusões e conclusões deste artigo são dos autores e não representam necessariamente as opiniões do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tampão AEQiagen19077Tampão de eluição Tampão
ALQiagen19075Tampão de lise
AW1 TampãoQiagen19081Tampão de lavagem 1
AW2 TampãoQiagen19072Tampão de lavagem 2
Suspensão MagAttract GQiagen1026901cordão magnético
Separador de grânulos magnéticosEpigentekQ10002-1
NanodropThermoFisherND-2000espectrofotômetro de microvolume
PK BufferThermoFisher4489111tampão Proteinase K
Proteinase KThermoFisherA25561
QubitInvitrogenQ33238fluorômetro

Referências

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  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473(2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211(2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

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