Artigo de método

Um protocolo de extração de DNA de mosquito baseado em contas magnéticas para sequenciamento de próxima geração

DOI:

10.3791/62354

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15 de abril de 2021

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1Florida Medical Entomology Laboratory, Department of Entomology and Nematology, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2U. S. Fish and Wildlife Service, Pacific Islands Fish and Wildlife Office, 3Department of Entomology and Nematology, University of California Davis

Neste artigo

Resumo

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Descrito aqui é um protocolo de extração de DNA usando contas magnéticas para produzir extrações de DNA de alta qualidade de mosquitos. Essas extrações são adequadas para uma abordagem de sequenciamento de próxima geração a jusante.

Resumo

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Um protocolo de extração de DNA recentemente publicado usando contas magnéticas e um instrumento automatizado de extração de DNA sugeriu que é possível extrair DNA de alta qualidade e quantidade de um mosquito individual bem preservado suficiente para sequenciamento de genoma a jusante. No entanto, a dependência de um caro instrumento automatizado de extração de DNA pode ser proibitiva para muitos laboratórios. Aqui, o estudo fornece um protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas, que é adequado para baixo a médio rendimento. O protocolo descrito aqui foi testado com sucesso utilizando amostras individuais do mosquito Aedes aegypti. Os custos reduzidos associados à extração de DNA de alta qualidade aumentarão a aplicação de sequenciamento de alto rendimento a laboratórios e estudos limitados de recursos.

Introdução

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O desenvolvimento recente de um protocolo de extração de DNAmelhorado 1 permitiu muitos estudos de alto impacto a jusante envolvendo sequenciamento de genoma inteiro2,3,4,5,6. Este protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas fornece um rendimento de DNA confiável de amostras individuais de mosquitos, o que, por sua vez, reduz o custo e o tempo associados à aquisição de um número suficiente de amostras de coleções de campo.

Os recentes avanços....

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Protocolo

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1. Armazenamento geral de amostras e preparações antes da extração de DNA

  1. Hidrate a amostra em 100 μL de água de grau PCR por 1h (ou durante a noite) a 4 °C se a amostra tiver sido armazenada em >70% de álcool para suavizar o tecido.

2. Interrupção da amostra

  1. Coloque uma incubadora ou bloco de calor tremendo a 56 °C.
  2. Faça a mistura tampão/enzima proteinase K (PK). 2 μL de Proteinase K (100 mg/mL) e 98 μL de Proteinase K Buffer (total de 100 μL) é necessário para cada extração individual de mosquitos. Para preparar uma mistura mestre para várias amostras, aumente a quantidade total (combinada para todas as....

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Resultados

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O rendimento médio de DNA por tecido de cabeça/tórax de mosquito individual foi de 4,121 ng/μL (N = 92, desvio padrão 3.513) medido utilizando um fluorômetro quando eluido usando 100 μL de tampão de elução. Isso é suficiente para os requisitos de entrada de DNA genômico de 10-30 ng necessários para toda a construção da biblioteca degenomas 1,7. A quantidade de DNA pode variar entre 0,3-29,7 ng/μL, dependendo do tamanho do corpo do mosquito e das condições de pres.......

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Discussão

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O protocolo descrito aqui pode ser adaptado para outras espécies de insetos. A versão original do protocolo introduzido em Nieman et al.1 foi testada em várias espécies, incluindo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, e Keiferia lycopersicella

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Reconhecemos o apoio financeiro do Centro Regional de Excelência para Doenças Transmitidas por Vetores do Pacífico financiado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (Acordo Cooperativo 1U01CK000516), cdc conceder NU50CK000420-04-04, o USDA National Institute of Food and Agriculture (Projeto Hatch 1025565), uf/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) e Florida Department of Health (Contract CODQJ). As conclusões e conclusões deste artigo são dos autores e não representam necessariamente as opiniões do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tampão AEQiagen19077Tampão de eluição Tampão
ALQiagen19075Tampão de lise
AW1 TampãoQiagen19081Tampão de lavagem 1
AW2 TampãoQiagen19072Tampão de lavagem 2
Suspensão MagAttract GQiagen1026901cordão magnético
Separador de grânulos magnéticosEpigentekQ10002-1
NanodropThermoFisherND-2000espectrofotômetro de microvolume
PK BufferThermoFisher4489111tampão Proteinase K
Proteinase KThermoFisherA25561
QubitInvitrogenQ33238fluorômetro

Referências

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  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in Califo....

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