O artigo introduz o dispositivo μTongue (microfluidos-em-uma-língua) para imagens de células de paladar funcional in vivo, integrando microfluidos em uma janela de imagem intravital na língua.
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Artigo de método
μTongue: Uma plataforma de imagem funcional baseada em microfluidics para a língua in vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia de fluorescência intravital é uma ferramenta amplamente utilizada para estudar a dinâmica multicelular em um animal vivo. No entanto, não foi usado com sucesso no órgão sensorial de sabor. Ao integrar microfluidos na janela de imagem intravital da língua, o μTongue fornece imagens funcionais confiáveis de células de paladar in vivo sob exposição controlada a vários tastants. Neste artigo, é apresentado um procedimento passo a passo detalhado para utilizar o sistema μTongue. São cinco subseções: preparação de soluções tastant, criação de um módulo microfluido, montagem de amostras, aquisição de dados de imagem funcionais e análise de dados. Algumas dicas e técnicas para resolver as questões práticas que podem surgir ao usar o μTongue também são apresentadas.
Introdução
O microscópio de fluorescência intravital é amplamente utilizado para estudar a dinâmica espostetemporal em tecidos vivos. Pesquisadores estão desenvolvendo rapidamente sensores geneticamente codificados que fornecem transformações específicas e sensíveis dos processos biológicos em sinais de fluorescência - que podem ser registrados prontamente usando microscópios de fluorescência que estão amplamente disponíveis1,2. Embora a maioria dos órgãos internos em roedores tenham sido investigados usando o microscópio, sua aplicação bem sucedida na língua ainda não foi bem sucedida3.
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Protocolo
Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e da Universidade Nacional de Seul.
1. Preparação de soluções: saliva artificial e tastants
- Prepare a saliva artificial dissolvendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4e 1,8 mM HCl em água destilada (>1 L), e ajuste o pH da solução para 7 (ver Tabela de Materiais)12.
- Preparar tastant....
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Resultados
O mouse Pirt-GCaMP6f-tdTomato foi usado para obter uma imagem de paladar. A superfície da língua do rato estava coberta com papilas filiformes filiformes autofluorescentes. As papilas gustativas são espalhadas esparsamente sobre a superfície da língua(Figura 4A). As imagens da papila gustativa e sua estrutura foram adquiridas utilizando três detectores de filtros diferentes. Utilizando o conjunto de filtros de 607/70 nm, o sinal tdTomato das células gustares foi obtido para análise ratiométr.......
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Discussão
Descrito aqui é um protocolo detalhado para aplicar μTongue à investigação de atividades funcionais de células de paladar in vivo. Neste protocolo, é realizada a imagem funcional nas células gusticuladas utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificados. Além do uso de camundongos transgênicos, o carregamento eletroforético de corantes de cálcio (ou corantes de sensoriamento de tensão) nas células gustativas pode ser uma opção alternativa.
Todas as soluções de sabor inferiore.......
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Divulgações
Os autores declaram interesses financeiros concorrentes: J. Han e M. Choi são inventores da tecnologia patenteada μTongue descrita neste artigo, e o sistema μTongue está comercialmente disponível via SciTech Korea.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Ciência Básica (IBS-R015-D1), a Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (No. 2019M3A9E2061789), e pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) subvenção financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (nº 2019M3E5D2A01058329). Somos gratos a Eunso Kim e Eugene Lee por sua assistência técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| acessulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Saliva artificial / solução de |
| cloreto de cálcio | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Saliva artificial / |
| ácido cítrico | Sigma Aldrich | C0759-100G | Saliva artificial / saborizante |
| cicloheximida | Sigma Aldrich | 01810-5G | Saliva artificial / saborizante |
| denatônio | Sigma Aldrich | D5765-5G | Saliva artificial / saborizante |
| Cola dental | Denkist | P0000CJT-A2 | Preparação de animais |
| Imagem J | NIH | ImageJ | Análise de dados |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Saliva artificial / saborizante |
| Adesivo instantâneo | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Preparação de animais |
| Saliva artificial de K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | /tastant |
| Saliva artificial de KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | / |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Preparação animal |
| KH2PO4 | Sigma | Aldrich P0662-25G | Saliva artificial/saboroso |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | artificial saliva / saborizante |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Análise de dados |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Saliva artificial / saborizante |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Saliva artificial / saborizante |
| Mutiphoton microscópio | Thorlab | Microscópio Bergamo II | |
| NaCl Sigma Aldrich | S3014-500G | Saliva artificial / saborizante | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Saliva artificial / sabortante |
| Objetiva | Nikon | N16XLWD-PF | Microscópio |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Controle fluídico |
| PC | LG | Lg15N54 | Medidor de pH de controle fluídico |
| Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Saliva artificial / saborizante | |
| Solução salina tamponada com fosfato | Sigma Aldrich | 806562 | Saliva artificial / saborizante |
| quinino | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Saliva artificial / saborizante |
| Bomba de seringa | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Controle fluídico |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Preparação animal |
| Laser de fibra ultrarrápida | Toptica | FFultra920 01042 | Microscópio |
| Xylazine | Bayer Coréia | Rompun | Preparação animal |
Referências
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al.
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Reimpressões e permissões
