μTongue: Uma plataforma de imagem funcional baseada em microfluidics para a língua in vivo

Resumo

O artigo introduz o dispositivo μTongue (microfluidos-em-uma-língua) para imagens de células de paladar funcional in vivo, integrando microfluidos em uma janela de imagem intravital na língua.

Resumo

A microscopia de fluorescência intravital é uma ferramenta amplamente utilizada para estudar a dinâmica multicelular em um animal vivo. No entanto, não foi usado com sucesso no órgão sensorial de sabor. Ao integrar microfluidos na janela de imagem intravital da língua, o μTongue fornece imagens funcionais confiáveis de células de paladar in vivo sob exposição controlada a vários tastants. Neste artigo, é apresentado um procedimento passo a passo detalhado para utilizar o sistema μTongue. São cinco subseções: preparação de soluções tastant, criação de um módulo microfluido, montagem de amostras, aquisição de dados de imagem funcionais e análise de dados. Algumas dicas e técnicas para resolver as questões práticas que podem surgir ao usar o μTongue também são apresentadas.

Introdução

O microscópio de fluorescência intravital é amplamente utilizado para estudar a dinâmica espostetemporal em tecidos vivos. Pesquisadores estão desenvolvendo rapidamente sensores geneticamente codificados que fornecem transformações específicas e sensíveis dos processos biológicos em sinais de fluorescência - que podem ser registrados prontamente usando microscópios de fluorescência que estão amplamente disponíveis^1,2. Embora a maioria dos órgãos internos em roedores tenham sido investigados usando o microscópio, sua aplicação bem sucedida na língua ainda não foi bem sucedida³.

Estudos anteriores sobre a imagem de cálcio das células gustativas foram realizados ex vivo por secção fina de um tecido da língua para obter papilas gustativas circunvaloladas^4,5,⁶ ou descascando o epitélio de sabor para obter papilas gustativas fungiformas^7,8. A preparação dessas amostras foi inevitavelmente invasiva, assim, os microambientes naturais, como a inervação dos nervos, as barreiras de permeabilidade e a circulação sanguínea, foram em grande parte perturbados. A primeira janela intravital de imagem da língua foi relatada em 2015 por Choi et al., mas a gravação funcional confiável não foi alcançável devido ao movimento e artefatos ópticos causados pelo estímulo tastante fluido⁹.

Recentemente, microfluidos-em-uma-língua (μTongue) foi introduzido¹⁰. Este dispositivo integra um sistema microfluido com uma janela de imagem na língua do rato. Ao atingir um fluxo de estado quase estável de estímulos tastantes durante todo o período de imagem, artefatos do movimento fluido poderiam ser minimizados(Figura 1). A porta de entrada é alimentada por uma série de controladores de pressão multicanal, enquanto a porta de saída está conectada a uma bomba de seringa, que mantém 0,3 mL/min. Além disso, artefatos ópticos causados pela diferença nos índices de refração das soluções tastant foram minimizados pela análise ratiométrica introduzindo um indicador insensível de cálcio (tdTomato) bem como o indicador de cálcio (GCaMP6)¹¹. Este design proporcionou estabilidade microscópica das células de paladar in vivo mesmo com a troca abrupta entre canais fluidos. Consequentemente, o μTongue implementa uma triagem funcional confiável de vários tastants para as papilas gustativas do mouse in vivo.

Neste protocolo, os procedimentos experimentais são explicados em detalhes para a imagem de cálcio das papilas gustativas fungiformas do camundongo in vivo usando μTongue. Em primeiro lugar, descreve-se a preparação de saliva artificial e soluções saborosas. Em segundo lugar, a configuração do sistema microfluido para alcançar o fluxo de estado quase estável é introduzida. Em terceiro lugar, os procedimentos utilizados para montar a língua do rato no μTongue para permitir a aquisição de imagens são delineados. Por fim, cada passo para análise de imagem, incluindo correção de artefatos de movimento lateral e razãometria, é especificado. Este protocolo pode ser adaptado prontamente para qualquer laboratório de pesquisa com uma instalação de mouse e um microscópio de dois fótons ou equipamento equivalente.

Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e da Universidade Nacional de Seul.

1. Preparação de soluções: saliva artificial e tastants

1. Prepare a saliva artificial dissolvendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO₃, 3 mM KHCO₃, 0,25 mM CaCl₂, 0,25 mM MgCl₂, 0,12 mM K₂HPO₄, 0,12 mM KH₂PO₄e 1,8 mM HCl em água destilada (>1 L), e ajuste o pH da solução para 7 (ver Tabela de Materiais)¹².
2. Preparar tastants, como azedo: ácido cítrico de 10 mM; salgado: 400 mM NaCl, opcionalmente com 50 μM de amiloride; doce: 40 mM acesulfame K; amargo: uma mistura de 5 mM de quinina, 5 mM de denatonium e cicloheximida de 20 μM, dissolvendo o produto químico degustação na saliva artificial preparada na etapa 1.1.

2. Preparação do sistema microfluido

NOTA: Os tastants foram entregues na língua do rato usando um sistema de entrega de fluidos multicanais pressurizados (consulte Figura 1 e Tabela de Materiais).

1. Encha os reservatórios do sistema de perfusão de fluxo pressurizado com saliva artificial e tastants.
2. Conecte a linha de ar comprimido à entrada do regulador e coloque a pressão de ar entre 30 e 50 psi no sistema de entrega fluida.
3. Defina a pressão de saída do regulador para 0,4 psi e verifique se o líquido sai do tubo sob esta pressão.
4. Conecte o coletor dos reservatórios à porta de entrada de μTongue.
5. Conecte a porta de saída de μTongue a uma bomba de seringa e retire o líquido com ~300 μL∙min^-1 para estabelecer a condição de estado estável. Observe o volume constante de uma gotícula pendurada sob a μTongue. Ajuste o valor do parâmetro de configuração dependendo da altura da amostra.
6. Desconecte a linha de ar comprimido e pare a bomba de seringa até que o protocolo 3 seja concluído.

3. Preparação do mouse para imagens in vivo (Figura 2).

NOTA: Todas as preparações dos animais foram realizadas durante o dia sob condições assépticas em uma bancada de laboratório.

1. Anestesia do rato
   1. Prepare um rato de 7 semanas ou mais velho de ambos os sexos. Use uma linha de camundongos geneticamente modificada que expresse proteínas de fluorescência sensoriais de cálcio nas células de sabor.
   2. O rato é contido para anestesia. Uma mistura de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina é injetada intraperitonealmente no mouse¹³.
2. TRITC-dextran (500 kDa) em 2,5% W/V tampão de fosfato é administrado por via intravenosa no camundongo através de uma rota retro-orbital para observar a circulação sanguínea durante uma sessão de imagem.
3. Coloque um fixador de cabeça no crânio do mouse para minimizar os artefatos de movimento.
   1. A cabeça do mouse é pulverizada com 70% de ETOH, enquanto o mouse é colocado em uma posição supina. Levante levemente a pele da cabeça com fórceps e corte aproximadamente 7 mm² com uma tesoura.
   2. Limpe o cabelo ao redor do couro cabeludo, remova o periosteum sob a pele, aplique um adesivo instantâneo no crânio e anexe um fixador de cabeça personalizado.
   3. Após o adesivo instantâneo endurecer, aplique cola dentária ao redor do fixador da cabeça e ilumine com uma luz azul para solidificar a cola dentária.
4. Coloque a língua do rato na unidade inferior da μTongue.
   1. Conecte o lábio inferior do mouse à unidade inferior de μTongue com um adesivo instantâneo.
   2. Coloque o mouse na placa (placa de preparação do mouse na Figura 1B) e coloque a unidade inferior do μTongue nos postes (μTongue mantenha o poste na Figura 1B). Certifique-se de que os orifícios na borda da unidade inferior estejam alinhados ao poste.
   3. Aperte o fixador da cabeça do mouse no suporte do fixador de cabeça na placa. Em seguida, ajuste a distância entre a cabeça do mouse e o dispositivo. Gire a cabeça do mouse suavemente aproximadamente 45° usando o suporte do fixador de cabeça. Este processo impede o contato físico do nariz do mouse com o objetivo do microscópio.
   4. Desenhe a língua do rato suavemente usando pinças de plástico e conecte o lado ventral da língua ao lado superior da unidade inferior da μTongue. Em seguida, limpe a superfície da língua do rato com um cotonete molhado.
   5. Mergulhe um pedaço de papel na saliva artificial e coloque-o sobre a superfície exposta da língua do rato para manter uma condição úmida.
   6. Coloque as arruelas curvas nos postes que seguram as duas extremidades da parte inferior do μTongue.
5. Coloque a preparação do mouse no estágio do microscópio. Posicione a língua do rato exposta sob o centro aproximado da área objetiva do microscópio. Certifique-se de não se desviar do alcance dinâmico do palco. Em seguida, aperte a placa do mouse no palco com parafusos.
6. Coloque a almofada de aquecimento sob o corpo do mouse e mantenha a temperatura em 36,5 °C-37,5 °C. Monitore a temperatura do corpo do mouse com um sensor de temperatura e controle a temperatura da almofada de aquecimento usando um sinal de feedback do sensor de temperatura.
7. Torça um pedaço fino de papel e coloque-o na boca do mouse para evitar que o líquido entre na traqueia do rato.
8. Retire o tecido molhado da língua do rato e coloque o μTongue preparado na língua do rato. Coloque um canal microfluido na língua e ajuste sua posição para observar a superfície da língua através da janela de imagem.
9. Fixar o μTongue aparafusando suavemente em ambas as extremidades com pressão compressiva mínima.

4. Aquisição de imagens

1. Ligue o laser de 920 nm de dois fótons e o microscópio antes do uso.
2. Monte o objetivo de imersão em água (16x, NA 0,80 ou 25x, NA 1.1) no microscópio. Solte a água destilada na janela de imagem do μTongue e mergulhe o objetivo.
3. No modo câmera, acenda a luz usando lâmpada de mercúrio e ilumine a superfície da língua.
4. Ajustando o eixo Z, procure o sinal autofluorescente a partir das papilas filiformes para encontrar o plano focal aproximado. Em seguida, usando o botão de ajuste X e Y, localize uma papila gustativa.
5. Mude para o modo multifotônio. Definir as condições de aquisição de imagem da seguinte forma: comprimento de onda de excitação: 920 nm; conjunto de filtro de emissão: 447/60 nm, 525/50 nm e 607/70 nm; modo de varredura rasteral bidirecional, tamanho do quadro: 512 x 512.
6. Ajuste as posições X e Y para colocar a papila gustativa no centro da janela da imagem.
7. Procure nos vasos sanguíneos ao redor da papila gustativa a cerca de dois terços da altura da papila gustativa. Visualize a circulação sanguínea pela injeção TRITC-dextran (500 kDa) a partir da etapa 3.2 do protocolo. Se o fluxo sanguíneo obstruír, solte ligeiramente os parafusos de fixação para permitir o fluxo sanguíneo.
8. Ajuste o eixo Z e encontre o plano Z da papila gustativa que contém um número adequado de células de sabor.
9. Proceda a imagem de cálcio com 2-6 Hz para 80 s. Forneça uma solução de sabor de 20 s ligando o reservatório do sistema fluido após o início da imagem. Depois de 20 s de estimulação de sabor, mude o reservatório de volta para saliva artificial.
10. Depois que a imagem sequencial estiver concluída, aguarde cerca de 3-4 minutos de antecedência para a próxima sessão de imagem. Mantenha a saliva artificial fluindo para a língua do rato para lavar o remanente tastant da sessão de imagem anterior. Dependendo do desenho do experimento, repita a sessão conforme necessário.
11. Quando a imagem in vivo de cálcio estiver completa, eutanize o mouse de acordo com o procedimento iACUC. O rato sob anestesia é sacrificado na câmara de CO_2.
    NOTA: Verifique a profundidade da anestesia usando um reflexo de dedo do dedo do dedo do sol. Durante uma sessão de imagem, a saliva artificial dos reservatórios deve ser fornecida de forma consistente. Se aparecerem bolhas na janela de imagem do μTongue, remova as bolhas empurrando-as através da entrada ou da saída do μTongue usando forte pressão líquida.

5. Análise de imagem(Figura 3)

1. Conversão de imagem
   1. Abra os arquivos de imagem bruta usando Fiji¹⁴ ou um software de análise de imagem semelhante.
   2. Converta o arquivo de imagem em um arquivo de pilha RGB para usar o código NPL Bud Analyzer.
      1. Imagem > cores > canais divididos
      2. Imagem > Color > Mesclar canais e selecione a imagem a partir da etapa 5.2.1.
      3. Imagem > Color > Stack para RGB
2. Registro de imagem
   NOTA: Use o código personalizado para análise de dados. Por favor, consulte https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
   1. Execute o código chamado Taste_GUI.m; uma janela GUI chamada NPL Bud Analyzer aparecerá. Clique no botão Nova Análise no canto superior direito e, em seguida, carregue a imagem convertida a partir da etapa 5.1. Defina a taxa de quadros acima da imagem carregada.
   2. Desenhe a região de interesse (ROI) sobre a imagem carregada para registro. Clique duas vezes no ROI selecionado e um registro calculado automaticamente será inicial.
3. Obtenha as alterações relativas da intensidade da fluorescência (ΔF/F)
   1. Volte para a janela NPL Bud Analyzer para mostrar a imagem registrada da etapa 5.2 automaticamente. Se o usuário já tiver um arquivo reg, clique no botão Dados de carga e selecione o arquivo _reg.tif.
   2. Clique no botão CIRCLE ou POLYGON e posicione o ROI da célula de paladar sobre a imagem da papila gustativa.
   3. Isso apresenta a intensidade da fluorescência bruta e o traço de cálcio (ΔF/F) da célula de paladar selecionada automaticamente sob a imagem da papila gustativa.
   4. Clique em Salvar traço para apresentar o traço de cálcio (ΔF/F) no lado direito da GUI, enquanto o ROI é mostrado sobre a imagem da papila gustativa. Repetição de passos 5.3.2-5.3.4 até que a seleção do ROI seja concluída.
      NOTA: Clique no botão Excluir traço se o ROI for selecionado erroneamente para eliminar o último traço de ROI e cálcio selecionados.
   5. Após a seleção do ROI terminar, escreva o nome do arquivo no canto inferior direito e clique no botão Terminar para exportar o traço de cálcio ΔF/Fcomo um formato de .xls e a imagem do botão tase com ROIs em um formato .bmp.
4. Análise do traço de cálcio
   1. Analise o traço de cálcio obtido a partir da etapa 5.3. Considere que as células de paladar reagiram ao sabor quando a intensidade da fluorescência aumenta mais de dois desvios padrão da linha de base após a entrega do tastant⁴, e p-valores são inferiores a 0,01, usando testes t-10emparelhados ou não não pagos .
   2. Considere a célula de paladar como uma célula de resposta, se ela responder a um certo tastant mais de duas vezes em três ensaios (~60%)¹⁵.
   3. Obtenha os traços representativos de cálcio, obtendo traços de cálcio individuais adquiridos a partir da etapa 5.4.1.

Resultados

O mouse Pirt-GCaMP6f-tdTomato foi usado para obter uma imagem de paladar. A superfície da língua do rato estava coberta com papilas filiformes filiformes autofluorescentes. As papilas gustativas são espalhadas esparsamente sobre a superfície da língua(Figura 4A). As imagens da papila gustativa e sua estrutura foram adquiridas utilizando três detectores de filtros diferentes. Utilizando o conjunto de filtros de 607/70 nm, o sinal tdTomato das células gustares foi obtido para análise ratiométr...

Discussão

Descrito aqui é um protocolo detalhado para aplicar μTongue à investigação de atividades funcionais de células de paladar in vivo. Neste protocolo, é realizada a imagem funcional nas células gusticuladas utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificados. Além do uso de camundongos transgênicos, o carregamento eletroforético de corantes de cálcio (ou corantes de sensoriamento de tensão) nas células gustativas pode ser uma opção alternativa.

Todas as soluções de sabor inferiore...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
acessulfame K	Sigma Aldrich	04054-25G	Saliva artificial / solução de
cloreto de cálcio	Sigma Aldrich	21115-100ML	Saliva artificial /
ácido cítrico	Sigma Aldrich	C0759-100G	Saliva artificial / saborizante
cicloheximida	Sigma Aldrich	01810-5G	Saliva artificial / saborizante
denatônio	Sigma Aldrich	D5765-5G	Saliva artificial / saborizante
Cola dental	Denkist	P0000CJT-A2	Preparação de animais
Imagem J	NIH	ImageJ	Análise de dados
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	Saliva artificial / saborizante
Adesivo instantâneo	Loctite	Loctite 4161, Henkel	Preparação de animais
Saliva artificial de K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	/tastant
Saliva artificial de KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	/
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	Preparação animal
KH2PO4	Sigma	Aldrich P0662-25G	Saliva artificial/saboroso
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	artificial saliva / saborizante
MATLAB	Mathwork	MATLAB	Análise de dados
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	Saliva artificial / saborizante
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	Saliva artificial / saborizante
Mutiphoton microscópio	Thorlab	Microscópio Bergamo II
	NaCl Sigma Aldrich	S3014-500G	Saliva artificial / saborizante
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	Saliva artificial / sabortante
Objetiva	Nikon	N16XLWD-PF	Microscópio
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	Controle fluídico
PC	LG	Lg15N54	Medidor de pH de controle fluídico
	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	Saliva artificial / saborizante
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma Aldrich	806562	Saliva artificial / saborizante
quinino	Sigma Aldrich	Q1125-5G	Saliva artificial / saborizante
Bomba de seringa	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	Controle fluídico
TRITC-dextran	Sigma Aldrich	52194-1G	Preparação animal
Laser de fibra ultrarrápida	Toptica	FFultra920 01042	Microscópio
Xylazine	Bayer Coréia	Rompun	Preparação animal