Montagem controlada por temperatura e caracterização de um Bilayer de interface de gotícula

Summary

Este protocolo detalha o uso de um sistema de aquecimento controlado pela temperatura para promover a montagem de monocamadas lipídicas e a formação de bicamadas de interface de gotícula para lipídios com temperaturas elevadas de fusão e medidas de capacitância para caracterizar mudanças orientadas pela temperatura na membrana.

Abstract

O método de bicamadas de interface de gota (DIB) para a montagem de bicamadas lipídicas (ou seja, DIBs) entre gotículas aquosas revestidas de lipídios no óleo oferece benefícios importantes em relação a outros métodos: os DIBs são estáveis e, muitas vezes, a área bicamada de longa duração pode ser reversivelmente ajustada, a assimetria de folhetos é facilmente controlada através de composições de gotículas, e redes semelhantes a tecidos de bicamadas podem ser obtidas por muitas gotículas adjacentes. A formação de DIBs requer montagem espontânea de lipídios em monocamadas lipídicas de alta densidade nas superfícies das gotículas. Embora isso ocorra prontamente à temperatura ambiente para lipídios sintéticos comuns, uma monocamide ou bicamadas estáveis suficientes não se formam em condições semelhantes para lipídios com pontos de fusão acima da temperatura ambiente, incluindo alguns extratos lipídes celulares. Esse comportamento provavelmente limitou as composições — e talvez a relevância biológica — dos DIBs em estudos de membrana modelo. Para resolver esse problema, um protocolo experimental é apresentado para aquecer cuidadosamente o reservatório de óleo que hospeda gotículas DIB e caracterizar os efeitos da temperatura na membrana lipídica. Especificamente, este protocolo mostra como usar uma luminária de alumínio termicamente condutora e elementos de aquecimento resistivos controlados por um loop de feedback para prescrever temperaturas elevadas, o que melhora a montagem de monocamadas e a formação de bicamadas para um conjunto mais amplo de tipos lipídes. Características estruturais da membrana, bem como as transições de fase termotrópica dos lipídios que compõem a bicamada, são quantificadas medindo as alterações na capacitância elétrica do DIB. Em conjunto, este procedimento pode auxiliar na avaliação de fenômenos biofísicos em membranas modelo sobre várias temperaturas, incluindo a determinação de uma temperatura de fusão eficaz (T_M) para misturas lipídicas multicomponidais. Essa capacidade permitirá, assim, uma replicação mais próxima das transições de fases naturais nas membranas do modelo e incentivará a formação e o uso de membranas modelo a partir de uma faixa mais ampla de constituintes de membrana, incluindo aquelas que melhor captam a heterogeneidade de suas contrapartes celulares.

Introduction

As membranas celulares são barreiras seletivamente permeáveis compostas por milhares de lipídios^{tipos 1,}proteínas, carboidratos e esteróis que encapsulam e subdividem todas as células vivas. Entender como suas composições afetam suas funções e revelar como moléculas naturais e sintéticas interagem, aderem, interrompem e translocam membranas celulares são, portanto, áreas importantes da pesquisa com implicações de grande alcance na biologia, medicina, química, física e engenharia de materiais.

Esses objetivos para a descoberta se beneficiam diretamente de técnicas comprovadas para montar, manipular e estudar membranas....

Protocol

1. Preparação aquecida da luminária

1. Reúna 2 peças de borracha isolante de 1 mm de espessura aparadas a 25 mm x 40 mm de largura e comprimento, respectivamente, 2 peças de borracha de 6 mm de espessura que também são de 25 mm x 40 mm, um conjunto de luminárias de alumínio preparadas e um reservatório de óleo acrílico que se encaixa na janela de visualização da luminária base de alumínio (ver Figuras S1, S2 e S3 para detalhes sobre a fabricação e uma visão explodida de montagem). Prepare a luminária de alumínio primeiro anexando ao fundo da luminária uma janela de visualização de tampas de vidro com adesivo curável UV e aderindo 1 elemento de ....

Results

A Figura 1 mostra como a luminária de alumínio e o reservatório de óleo acrílico são preparados no estágio do microscópio para a formação de DIB. As etapas de montagem 1.2-1.4 servem para isolar termicamente a luminária do palco para um aquecimento mais eficiente. As etapas 1.5-1.7 mostram como fixar adequadamente o termopar à luminária e posicionar o reservatório de óleo, e as etapas 1.8 -1.9 mostram locais recomendados para a distribuição de óleo nessas peças.

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Discussion

O protocolo aqui descrito fornece instruções para a montagem e operação de um sistema experimental para controlar a temperatura do óleo e gotículas usadas para formar DIBs. É especialmente benéfico para permitir a formação de DIB usando lipídios que têm temperaturas de fusão acima de RT. Além disso, variando precisamente a temperatura do reservatório de óleo, a temperatura bicamada pode ser manipulada para estudar os efeitos das temperaturas elevadas em várias propriedades e características da membrana, incluindo capacit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borracha isolante de 25 mm x 40 mm x 1 mm (x2)	Any		Isola a parte inferior do acessório de alumínio da platina do microscópio
Borracha isolante de 25 mm x 40 mm x 6 mm (x2)	Any		Protege os elementos de aquecimento de serem danificados pelos clipes da platina do microscópio e isola a parte superior dos elementos de aquecimento.
Ácido propanossulfônico 3-(N-morfolino)	Sigma Aldrich	M3183	Agente tampão para solução lipídica
Substrato acrílico	Fabricado em casa	HTD_STG_2	~1000 uL de acrílico com um perfil exterior poka-yoke para fixar a orientação
Luminária de alumínio	Fabricada em casa	HTD_STG_1	Luminária de base com um poço de petróleo que segura a luminária acílica e inclui duas almofadas planas adjacentes ao poço de petróleo para os elementos de aquecimento
Extrato lipídico total do cérebro	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL extrato lipídico suíno
Chassi DAQ Compacto (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chassi para abrigar vários tipos de módulos de medição ou saída de sensores
Sistema de Aquisição de Dados (DAQ)	Dispositivos Moleculares	Digidata 1440A	Conversor analógico para digital de alta resolução
Amplificador de ganho fixo/fonte de alimentação	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifica a saída de tensão DC do módulo de saída de tensão
Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Sela a parte inferior da base de alumínio e permite a caracterização óptica do elemento de aquecimento bicamada
(x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm elemento de aquecimento kapton de filme de poliamida com um limite de potência de 5 watts.
Parafuso de Aço Inoxidável M3	McMaster Carr	90116A150	Fixa termopar a luminária de alumínio
Amplificador de braçadeira de patch	Molecular Devices	AxoPatch 200B	Mede a corrente e a tensão de saída para o headstage
Computador pessoal	Qualquer		computador com várias portas usb de alta velocidade e um mínimo de 6 Gb de ram
Cloreto de Potássio	Sigma Aldrich	P3911	Solução eletrolítica de íons dissociados Módulo de
entrada de temperatura	National Instruments	NI 9211	Permite medições de termopar de junção aberta e fria para o chassi cDAQ
Termopar	Omega	JMTSS-020U-6	Termopar tipo U com diâmetro de 0,02 polegadas e 6 polegadas de comprimento
Adesivo Curável UV	Loctite	19739	Fixa lamínula de vidro à base de alumínio
Módulo de saída de tensão	National Instruments	NI 9263	para uso com o chassi cDAQ
Gerador de forma de onda	Agilent	33210A	Usado para emitir uma forma de onda senoidal de 10 mV 10 Hz