Artigo de método

Imagem tridimensional de organoides para estudar a ciliogênese primária durante a organogênese ex vivo

DOI:

10.3791/62365

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14 de maio de 2021

 ,  ,  , 
1Univ Rennes, CNRS, IGDR (Institut de Génétique et Développement de Rennes), 2CRBM, CNRS, University Montpellier, 3CRCINA, INSERM, CNRS, Université d’Angers, Université de Nantes

Neste artigo

Resumo

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Os organoides derivados de células-tronco facilitam a análise de processos moleculares e celulares que regulam a autorrenovação e diferenciação de células-tronco durante a organogênese em tecidos de mamíferos. Aqui apresentamos um protocolo para a análise da biologia do cílio primário em organoides mamários de camundongos.

Resumo

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Organoides são estruturas tridimensionais derivadas de células-tronco que reproduzem ex vivo a complexa arquitetura e fisiologia dos órgãos. Assim, os organoides representam modelos úteis para estudar os mecanismos que controlam a autorrenovação e diferenciação de células-tronco em mamíferos, incluindo a ciliogênese primária e a sinalização ciliar. A ciliogênese primária é o processo dinâmico de montagem do cílio primário, um centro de sinalização celular chave que controla a auto-renovação e/ou diferenciação das células-tronco em vários tecidos. Aqui apresentamos um protocolo abrangente para a coloração de imunofluorescência de linhagem celular e marcadores de cílios primários, em organoides mamários de camundongos de montagem inteira, para microscopia de folha de luz. Descrevemos o método de imagem microscópica e uma técnica de processamento de imagem para a análise quantitativa da montagem e comprimento do cílio primário em organoides. Este protocolo permite uma análise precisa dos cílios primários em estruturas tridimensionais complexas no nível de uma única célula. Este método é aplicável para coloração de imunofluorescência e imagem de cílios primários e sinalização ciliar em organoides mamários derivados de células-tronco normais e geneticamente modificadas, de tecidos saudáveis e patológicos, para estudar a biologia do cílio primário na saúde e na doença.

Introdução

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O desenvolvimento de organismos multicelulares e a manutenção da homeostase em seus tecidos adultos residem em uma regulação afinada entre a auto-renovação e a diferenciação de células-tronco, que orquestram no tempo e no espaço o desenvolvimento e a regeneração normal do tecido1. A subversão dessa regulação causa anomalias de desenvolvimento e cânceres2. Assim, compreender os mecanismos moleculares e celulares que orquestram a auto-renovação e diferenciação das células-tronco é de interesse fundamental na biologia do desenvolvimento e do câncer.

O desenvolvimento recente de métodos de organogênese ex vivo, nos quais as células-tronco teciduais geram organoides tridimensionais, transformou nossa capacidade de estudar a dinâmica das células-tronco durante a organogênese de mamíferos e a manutenção da homeostase tecidual em uma placa3. Os organoides representam uma boa alternativa aos complicados modelos animais geneticamente modificados para estudar esses processos. Protocolos para o desenvolvimento de organoides a partir de células-tronco teciduais de muitos órgãos já foram desenvolvidos3, incluindo intestino delgado e cólon, estômago, fígado, pâncreas, próstata e glândula mamária3. Além disso, o desenvolvimento de técnicas somáticas de edição de genoma em células-tronco formadoras de organoides agora permite interrogar rapidamente os mecanismos moleculares e celulares que controlam sua biologia 4,5.

O cílio primário é uma estrutura baseada em microtúbulos que é montada na superfície do tronco e/ou células diferenciadas de vários tecidos6. Geralmente é imóvel e é montado como uma única estrutura por célula7. A ciliogênese primária é o processo dinâmico de montagem do cílio primário7. Na superfície celular, o cílio atua como uma plataforma de sinalização celular8. Assim, acredita-se que o cílio primário atue como um regulador chave da auto-renovação e/ou diferenciação de células-tronco em muitos tecidos, incluindo o cérebro 9,10, a glândula mamária 4,11, o tecido adiposo12 e o epitélio olfatório13, entre outros. A ciliogênese primária e / ou sinalização ciliar são reguladas dinamicamente em linhagens celulares distintas e em diferentes estágios de desenvolvimento4 , 13 , 14 , mas os mecanismos subjacentes ainda precisam ser amplamente determinados.

A organogênese ex vivo mostra-se promissora para o desenvolvimento de conhecimentos básicos sobre os mecanismos moleculares e celulares que controlam a biologia das células-tronco, incluindo a ciliogênese primária e a sinalização ciliar. No entanto, ele depende da capacidade de obter imagens adequadas de organoides de montagem inteira no nível de célula única e em escalas subcelulares. Recentemente, usamos um modelo organoide derivado de células-tronco mamárias de camundongo para mostrar que os cílios primários controlam positivamente a capacidade de formação de organoides de células-tronco mamáriasde camundongo 4. Aqui apresentamos um protocolo abrangente para a coloração de imunofluorescência de organoides mamários de camundongos inteiros (Figura 1A, B), que permite a análise de cílios primários por meio de microscopia de folha de luz durante a organogênese ex vivo em três dimensões. Métodos alternativos foram publicados recentemente para a coloração de imunofluorescência e imagem de organoides por meio de microscopia confocal15,16. Este protocolo se concentra na preparação e imagem de organoides por meio de microscopia de folha de luz.

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Protocolo

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NOTA: O protocolo abaixo é recomendado para a coloração de organoides que foram cultivados em 5 poços de uma placa de 96 poços e agrupados (> 100 organoides). Os organoides foram derivados de células-tronco mamárias de camundongos. Os camundongos doadores foram alojados e manuseados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados com os Animais da Universidade de Rennes (França).

1. Reagentes

  1. Para preparar a solução fixadora, diluir 125 μL de solução comercial aquosa de paraformaldeído (PFA) a 16% em 375 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para gerar uma solução de PFA a 4%.
    CUIDADO: Manipule o PFA que é uma substância tóxica sob um capuz químico.
  2. Para preparar o tampão de permeabilização, diluir 1,5 μL de Triton X100 em 500 μL de PBS, para produzir uma solução de Triton X100 a 0,3%.
  3. Para preparar o tampão de bloqueio, diluir 1,5 μL de Tween-20 e 75 μL de soro de cabra normal em PBS, para gerar uma solução de soro de cabra a 5% e Tween 20 a 0,1%.
  4. Para preparar o meio de montagem de chapas leves, dissolva 1 g de agarose ultrapura de baixo ponto de fusão em 100 mL de dH20 ou PBS a 65 °C. Prepare alíquotas de 1 mL e armazene em temperatura ambiente.

2. Recuperação de organoides

  1. Transfira organoides dos poços de cultura para um tubo de polímero de baixa ligação de 1,7 mL, após pipetá-los para cima e para baixo 3 vezes nos poços, com uma ponta revestida com FBS para a qual a extremidade foi cortada (diâmetro mínimo da extremidade 1,5 mm).
    NOTA: O revestimento evita que os organoides grudem na ponta. O material polimérico de baixa ligação permite reduzir a fixação de organoides na lateral do tubo durante todo o procedimento de coloração.
  2. Encha o tubo com PBS e gire para baixo a 350 x g por 3 min. Remova o sobrenadante.

3. Fixação, permeabilização e bloqueio

  1. Ressuspenda os organoides em 500 μL de 4% de PFA. Incubar por 30 min em temperatura ambiente. Gire para baixo a 350 x g por 30 s. Remova o sobrenadante.
    NOTA: A partir desta etapa, ressuspenda os organoides nos diferentes tampões simplesmente adicionando os tampões no pellet de organoides sem tocá-los. Execute todas as etapas de lavagem em temperatura ambiente.
  2. Lave os organoides com 1 mL de PBS por 3 min. Gire para baixo a 350 x g por 30 s. Remova o sobrenadante.
    PAUSA: Os organoides fixos podem ser mantidos em PBS a 4 °C durante pelo menos uma semana.
  3. Permeabilize os organoides ressuspendendo-os em 500 μL de PBS-Triton X100 0,3% e incube por 30 min em temperatura ambiente. Gire os organoides a 350 g por 30 s.
  4. Lave os organoides ressuspendendo-os com 1 mL de PBS e incube por 3 min. Gire para baixo a 350 x g por 30 s. Remova o sobrenadante. Repita uma vez.
  5. Opcional: Ressuspenda os organoides em 500 μL de metanol gelado. Incubar a - 20 °C durante 10 min. Esta etapa pode ser necessária para a coloração de marcadores centrossômicos específicos.
  6. Opcional (se a etapa 5 foi realizada): Lave os organoides com 1 mL de PBS por 3 min. Gire para baixo a 350 x g por 30 s. Remova o sobrenadante. Repita uma vez.
  7. Bloqueie os locais de ligação de anticorpos não específicos em organoides, ressuspendendo-os com 500 μL de tampão de bloqueio (PBS, 5% de soro de cabra, 0,1% de Tween 20). Incubar 1 h e 30 min em temperatura ambiente. Gire a 350 g por 30 s. Remova o sobrenadante.
  8. Lave os organoides ressuspendendo-os com 1 mL de PBS e incube por 3 min. Gire para baixo a 350 x g por 30 s. Remova o sobrenadante.

4. Rotulagem

  1. Ressuspender os organoides com 200 μL de tampão de bloqueio com anticorpos primários diluídos e incubar durante a noite a 4 °C com agitação suave (60 rpm em um agitador horizontal). Coloque os tubos com um ângulo de 45° com o plano horizontal do agitador. Ele manterá os organoides na parte inferior dos tubos no tampão de coloração.
  2. Lave os organoides ressuspendendo-os com 1 mL de PBS e incube por 5 min. Gire para baixo a 350 x g por 30 s. Remova o sobrenadante. Repita duas vezes.
    NOTA: Alguns organoides na última etapa podem grudar na lateral do tubo, resultando em perda de organoides durante a aspiração do sobrenadante após centrifugação, adicionar 0,2% (p / v) de albumina de soro bovino (BSA) ao PBS nas etapas de lavagem pode reduzir a perda de organoides.
  3. Ressuspenda os organoides com 200 μL de tampão de bloqueio com anticorpos secundários e incube por 1 h e 30 min com agitação leve (60 rpm em um agitador horizontal). Coloque os tubos com um ângulo de 45° com o plano horizontal do agitador. Ele manterá os organoides na parte inferior dos tubos no tampão de coloração.
    NOTA: Hoechst (ou outros corantes nucleares, como DAPI ou DRAQ5) pode ser adicionado ao tampão com anticorpos secundários.
  4. Lave os organoides ressuspendendo-os com 1 mL de PBS e incube por 5 min. Gire para baixo a 350 x g por 30 s. Remova o sobrenadante. Repita duas vezes.
    NOTA: Alguns organoides na última etapa podem grudar na lateral do tubo, resultando em perda de organoides durante a aspiração do sobrenadante após a centrifugação, adicionar 0.2% (p / v) BSA ao PBS nas etapas de lavagem pode reduzir a perda de organoides.

5. Preparação da amostra de agarose para imagiologia

  1. Derreta o meio de montagem da folha leve incubando-o a 65 °C. Assim que o meio derreter, incube-o a 37 °C por 5 min.
  2. Ressuspenda os organoides em 100 μL de meio de montagem usando uma ponta de 200 μL, com a extremidade da ponta cortada (tamanho mínimo da extremidade: 1,5 mm), pipetando para cima e para baixo duas vezes.
  3. Sugue o meio de montagem com os organoides em um capilar de vidro (capilar verde, diâmetro interno: 1,5 mm) usando um êmbolo. Incube o capilar em temperatura ambiente por 5 min para que o meio de montagem solidifique.
    PAUSA: O capilar pode ser armazenado em PBS a 4 °C por uma semana antes da imagem.

6. Exames de imagem

  1. Usando um microscópio de folha de luz (por exemplo, ZEISS Lightsheet Z.1), crie imagens dos organoides com objetivas de imersão em água de 20x ou 40x.
    1. Colocar o capilar de vidro na câmara de observação. Localize o capilar com a câmera frontal e coloque a ponta do capilar de vidro no limite superior da objetiva de detecção.
    2. Selecione a amostra e defina o foco ideal usando a ponta do capilar de vidro na iluminação de campo claro. Empurre a amostra de agarose lentamente do capilar e localize organoides dentro da agarose solidificada.
    3. Mantenha os organoides a serem visualizados próximos à ponta do capilar, para reduzir os movimentos da amostra de agarose no PBS. Gire o capilar para definir a orientação ideal da amostra e definir o zoom desejado.
    4. Selecione o modo de aquisição. Defina os canais a serem visualizados, defina as orientações adequadas da folha de luz, defina a potência do laser para cada canal (para reduzir o fotobranqueamento, use baixa potência do laser), defina o tamanho da imagem e o(s) lado(s) de iluminação desejado(s). Exemplo de parâmetros de imagem: Tamanho da imagem 1920 x 1920, iluminação: lado duplo.
    5. Defina a pilha Z para a imagem definindo as extremidades Z da pilha usando o módulo Z-stack e defina o tamanho da etapa Z como ideal.
  2. Processe o arquivo de saída usando o módulo de processamento de imagem do software do microscópio para navegar na amostra, obter uma projeção Z e representação 3D.
  3. Vire a amostra e adquira uma nova imagem de um ângulo diferente ou imagine outros organoides.
  4. Analisar imagens com um software de análise de imagens de microscopia interativa (e.g., Imaris) possibilitando (i) a visualização da amostra em 3D (ii) a segmentação de objetos (iii) a identificação e análise quantitativa de objetos.

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Resultados

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Os métodos de organogênese ex vivo estão transformando nossas capacidades de estudar o desenvolvimento de tecidos de mamíferos e a manutenção da homeostase tecidual em um prato. A análise dos mecanismos moleculares e celulares que regulam esses processos, incluindo a ciliogênese primária e a sinalização ciliar, depende da capacidade de obter imagens de organoides em três dimensões.

O protocolo descrito acima permite a coloração de organoides mamários de montagem inteira. Eles surgem d...

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Discussão

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O protocolo detalhado apresentado aqui permite a coloração e a imagem de organoides mamários de camundongos que crescem em meio semissólido. Este protocolo é presumivelmente aplicável à coloração de organoides que imitam a arquitetura de vários tecidos que crescem em meios semi-sólidos e sólidos. Para organoides que crescem em 100% Matrigel com meio no topo, as etapas de recuperação e fixação diferem ligeiramente. O meio de cultura deve ser removido do poço de cultura. Após uma rápida la...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

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Agradecemos a Xavier Pinson pela ajuda no desenvolvimento da microscopia de folha de luz; o centro de biotecnologia Biosit, incluindo MRic, Arche, as instalações centrais de citometria de fluxo, e SFR Santé F. Bonamy, incluindo a instalação central MicroPICell, para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pela Fondation ARC, Cancéropôle Grand Ouest, Université de Rennes 1, Fondation de France. MD foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação da Universidade de Rennes. V.J.G. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da Fondation ARC.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti-rato IgG1 647Thermo-FisherA21240
Anti-rato IgG2A 488Thermo-FisherA21131
Anti-coelho 546Thermo-FisherA11035
Arl13bNeuroMab73-287
EMS 16% Paraformaldeído Solução Aquosa, Ciências deMicroscopia Eletrônica15710
FBSThermo-Fisher10270106
gtubulinaSigma-AldrichT5326
Hoechst 33342Thermo-Fisher62249
Integrin a6Biolegend313616
Light Sheet CapilarZeiss701908
Light Sheet êmboloZeiss701998
Baixa ligação Tubos de microcentrífugaBioScience27210
Solução de bloqueio de soro de cabra normalLaboratórios de vetorS-1000
PBSSigma-Aldrichp3587
Tecnologia de sinalização de célulasde lesma9585
Triton-X100Sigma-AldrichT9284
Tween-20Euromedex9005-64-5
Agarose de baixo ponto de fusão UltraPureThermo-Fisher16520050
de Grau EM

Referências

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