Análise da Composição Lipídica de Mycobacteria por Cromatografia de Camada Fina

Summary

Um protocolo é apresentado para extrair o conteúdo lipídico total da parede celular de uma ampla gama de micobactérias. Além disso, são mostrados protocolos de extração e analíticas dos diferentes tipos de ácidos micólicos. Um protocolo cromatográfico de camada fina para monitorar esses compostos micobacterianos também é fornecido.

Abstract

As espécies de micobactérias podem diferir umas das outras na taxa de crescimento, presença de pigmentação, morfologia da colônia exibida em mídia sólida, bem como outras características fenotípicas. No entanto, todos eles têm em comum o caráter mais relevante das micobactérias: sua parede celular única e altamente hidrofóbica. As espécies de micobactérias contêm um complexo ligado à membrana-covalente que inclui arabinogalactan, peptidoglycan e longas cadeias de ácidos micólicos com tipos que diferem entre espécies de micobactérias. Além disso, as micobactérias também podem produzir lipídios localizados, não covalentemente ligados, em suas superfícies celulares, como dimicocerosates de fleiocerol (PDIM), glicólipídios fenólicos (PGL), glicopeptidolipids (GPL), acitretros (AT) ou mannoídeos fosfatidil-inositol (PIM), entre outros. Alguns deles são considerados fatores de virulência em micobactérias patogênicas, ou lipídios antigênicos críticos na interação hospedeira-micobactéria. Por essas razões, há um interesse significativo no estudo dos lipídios micobacterianos devido à sua aplicação em diversas áreas, desde a compreensão de seu papel na patogenicidade das infecções por micobactérias, até uma possível implicação como agentes imunomodulatórios para o tratamento de doenças infecciosas e outras patologias como o câncer. Aqui, é apresentada uma abordagem simples para extrair e analisar o teor total lipídico e a composição de ácido mcólico das células de micobactéria cultivadas em meio sólido usando misturas de solventes orgânicos. Uma vez que os extratos lipíduos são obtidos, a cromatografia de camada fina (TLC) é realizada para monitorar os compostos extraídos. O experimento de exemplo é realizado com quatro micobactérias diferentes: o mycolicibacterium brumae e Mycolicibacterium fortuitum, o atenuado Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), e o patógeno oportunista de rápido crescimento Mycobacterium abscessus, demonstrando que métodos mostrados no presente protocolo podem ser usados para uma ampla gama de mycobacteria.

Introduction

Mycobacterium é um gênero que compreende espécies patogênicas e não patogênicas, caracterizada por ter uma parede celular altamente hidrofóbica e impermeável formada por seus lipídios peculiares. Especificamente, a parede celular micobacteriana contém ácidos micólicos, que são α-alquila e β-hidroxis, nos quais o α-ramo é constante em todos os ácidos micólicos (exceto pelo comprimento) e a cadeia de β, chamada cadeia meromycolate, é uma longa cadeia alifática que pode conter diferentes grupos químicos funcionais descritos junto com a literatura (α-, α'-, metoxical Κ-, epóxi-, carboxy-, e ω-1-metoxi-mycolates), produzindo assim sete tipos de ácidos míclicos (I....

Protocol

1. Extração do total de lipídios não covalentes da micobactéria (Figura 1)

1. Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com tampas de parafuso de revestimento politetrafluoroethlene (PTFE). Adicione uma solução composta por 5 mL de clorofórmio e 10 mL de metanol (clorofórmio:metanol, 1:2).
   NOTA: Quando forem utilizados solventes orgânicos, apenas o recipiente de vidro deve ser utilizado. Não são permitidos recipientes plásticos. Além disso, são necessárias tampas de parafuso de forro PTFE para garrafas.
   ATENÇÃO: O clorofórmio é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa....

Results

Com o objetivo de mostrar uma ampla gama de lipídios presentes em diferentes espécies de micobactérias, M. bovis BCG foi selecionado por ser micobactérias ásperas e de crescimento lento. O áspero e rápido crescimento M. fortuitum e M. brumae foram adicionados no procedimento e, finalmente, o morfotipo liso de M. abscesso também foi incluído. Essas quatro espécies nos permitem visualizar um amplo espectro de lipídios derivados de micobactérias, como acitrehaloses (AT), GPLs, PDIM, PGL, .......

Discussion

Um protocolo simples considerado como o método padrão-ouro para a extração de compostos lipídicos não covalentes ligados da parede celular micobacteriana é apresentado. Uma visualização adicional por TLCs unidimensionais dos lipídios extraídos de quatro micobactérias diferentes é mostrada.

Duas misturas combinadas consecutivas de clorofórmio e metanol para recuperar o teor lipídico das células micobacterianas é a mistura de solvente mais utilizada^23,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido acético	Merck	100063	CUIDADO. Anidro para análise EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Acetona	Carlo Erba	400971N	CUIDADO. ACETONA RPE-ACS-ISO PARA ANÁLISE ml 1000
Anthrone	Merck	8014610010	Anthrone para síntese.
Benzeno	Carlo Erba	426113	CUIDADO. Benzeno RPE - Para análise - ACS 2,5 l
Tubo de vidro capilar	Merck	BR708709	BRAND®   descartável BLAUBRAND®   micropipetas, intraMark
Clorofórmio	Carlo Erba	412653	CUIDADO. Clorofórmio RS - Para HPLC - Grau isocrático - Estabilizado com etanol 2,5 L
Aquecedor de bloco seco	J.P. Selecta	7471200
Diclorometano	Carlo Erba	412622	CUIDADO. Diclorometano RS - Para HPLC - Grau isocrático - Estabilizado com amileno 2,5 L
Éter dietílico	Carlo Erba	412672	CUIDADO. Éter dietílico RS - Para HPLC - Grau isocrático - Não estabilizado 2,5 L
Acetato de etila	Panreac	1313181211	CUIDADO. O acetato de etilo (Reag. USP, Ph. Eur.) para análise, ACS, ISO
Álcool Etílico Absoluto	Carlo Erba	4146072	CUIDADO. Etanol EPR anidro absoluto - Para análise - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Funil de vidro	VidraFOC	DURA.2133148 1217/1
Tubo de vidro	VidraFOC	VFOC.45066A-16125	Tubo de vidro com tampa recuperada de PTFE
Metanol	Carlo Erba	412722	CUIDADO. Metanol RS - Para HPLC - OURO - Grau ultragradiente 2,5 L
Hidrato de ácido molibdatofosfórico	Merck	51429-74-4	CUIDADO.
Reagente azul do pulverizador do molibdênio, 1.3%	Sigma	M1942-100ML	CUIDADO.
n-hexano	Carlo Erba	446903	CUIDADO. n-Hexano 99% RS - ATRASOL - Para análise de traços 2,5 L
n-nitroso-n-metilureia	Sigma	N4766	CUIDADO
Plataforma de agitação orbital	DDBiolab	995018	NB-205L incubadora de agitação de bancada
Éter de petróleo (60-80º C)	Carlo Erba	427003	CUIDADO. Éter de petróleo 60 - 80° C RPE - Para análise 2,5 L
Pulverizador	VidraFOC	712/1
Sulfato de sódio anidro	Merck	238597
Ácido sulfúrico 95-97%	Merck	1007311000	CUIDADO. Câmara de ácido sulfúrico 95-97%
TLC	Merck	Z204226-1EA	Tanques de desenvolvimento retangulares TLC, L completo &vezes; H &vezes; L 22 cm &vezes; 22 cm &vezes; Placa TLC de 10 cm
	Merck	1057210001	TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Aquecedor de placas	CAMAG	223306	CAMAG TLC Aquecedor de placas III
	Tolueno Carlo Erba	488551	CUIDADO. Tolueno RPE - Para análise - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
Vortex	Fisher Scientific	10132562	IKA  Agitador IKA vó rtex 3
1-naftol	Sigma-Aldrich	102269427	CUIDADO.