Method Article

Análise da Composição Lipídica de Mycobacteria por Cromatografia de Camada Fina

DOI:

10.3791/62368

⸱

April 16th, 2021

 ,  , 
1Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um protocolo é apresentado para extrair o conteúdo lipídico total da parede celular de uma ampla gama de micobactérias. Além disso, são mostrados protocolos de extração e analíticas dos diferentes tipos de ácidos micólicos. Um protocolo cromatográfico de camada fina para monitorar esses compostos micobacterianos também é fornecido.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As espécies de micobactérias podem diferir umas das outras na taxa de crescimento, presença de pigmentação, morfologia da colônia exibida em mídia sólida, bem como outras características fenotípicas. No entanto, todos eles têm em comum o caráter mais relevante das micobactérias: sua parede celular única e altamente hidrofóbica. As espécies de micobactérias contêm um complexo ligado à membrana-covalente que inclui arabinogalactan, peptidoglycan e longas cadeias de ácidos micólicos com tipos que diferem entre espécies de micobactérias. Além disso, as micobactérias também podem produzir lipídios localizados, não covalentemente ligados, em suas superfícies celulares, como dimicocerosates de fleiocerol (PDIM), glicólipídios fenólicos (PGL), glicopeptidolipids (GPL), acitretros (AT) ou mannoídeos fosfatidil-inositol (PIM), entre outros. Alguns deles são considerados fatores de virulência em micobactérias patogênicas, ou lipídios antigênicos críticos na interação hospedeira-micobactéria. Por essas razões, há um interesse significativo no estudo dos lipídios micobacterianos devido à sua aplicação em diversas áreas, desde a compreensão de seu papel na patogenicidade das infecções por micobactérias, até uma possível implicação como agentes imunomodulatórios para o tratamento de doenças infecciosas e outras patologias como o câncer. Aqui, é apresentada uma abordagem simples para extrair e analisar o teor total lipídico e a composição de ácido mcólico das células de micobactéria cultivadas em meio sólido usando misturas de solventes orgânicos. Uma vez que os extratos lipíduos são obtidos, a cromatografia de camada fina (TLC) é realizada para monitorar os compostos extraídos. O experimento de exemplo é realizado com quatro micobactérias diferentes: o mycolicibacterium brumae e Mycolicibacterium fortuitum, o atenuado Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), e o patógeno oportunista de rápido crescimento Mycobacterium abscessus, demonstrando que métodos mostrados no presente protocolo podem ser usados para uma ampla gama de mycobacteria.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium é um gênero que compreende espécies patogênicas e não patogênicas, caracterizada por ter uma parede celular altamente hidrofóbica e impermeável formada por seus lipídios peculiares. Especificamente, a parede celular micobacteriana contém ácidos micólicos, que são α-alquila e β-hidroxis, nos quais o α-ramo é constante em todos os ácidos micólicos (exceto pelo comprimento) e a cadeia de β, chamada cadeia meromycolate, é uma longa cadeia alifática que pode conter diferentes grupos químicos funcionais descritos junto com a literatura (α-, α'-, metoxical Κ-, epóxi-, carboxy-, e ω-1-metoxi-mycolates), produzindo assim sete tipos de ácidos míclicos (I-VII)1. Além disso, outros lipídios com importância inquestionável também estão presentes na parede celular das espécies de micobactérias. Espécies patogênicas como Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose2 produzir fatores específicos de virulência à base de lipídios, como dimicocerosates de fleuorol (PDIMs), glicolipídio fenólico (PGL), di-, tri-, e penta-acyltrehaloses (DAT, TAT e PAT), ou sulfolipídios, entre outros3. Sua presença na superfície micobacteriana tem sido associada com a capacidade de modificar a resposta imune do hospedeiro e, portanto, a evolução e persistência do micobacterium dentro do hospedeiro4. Por exemplo, a presença de triacylglycerols (TAG) tem sido associada ao fenótipo hipervirulento da subadequação lineage 2-Pequim de M. tuberculosis, possivelmente devido à sua capacidade de atenuar a resposta imune hospedeiro5,6. Outros lipídios relevantes são lipooligosaccarídeos (LOSs) presentes em micobactérias tuberculosas e não intuberréuas. No caso de Mycobacterium marinum, a presença de LOSs em sua parede celular está relacionada à motilidade deslizante e à capacidade de formar biofilmes e interfere no reconhecimento por receptores de reconhecimento de padrões de macrófago, afetando a absorção e eliminação das bactérias por fagocitos hospedeiros7,8. Além disso, a ausência ou presença de alguns lipídios permite que membros da mesma espécie sejam classificados em diferentes morótipos com perfis virulentos ou atenuados ao interagir com células hospedeiras. Por exemplo, a ausência de glycopeptidolipids (GPL) no morfótipo áspero de Mycobacterium abscessus tem sido associado com a capacidade de induzir acidificação intrafarosômica e, consequentemente, apoptose celular9, ao contrário do morótipo liso que possui GPLs em sua superfície. Além disso, o conteúdo lipídico da parede celular micobacteriana está relacionado com a capacidade de modificar a resposta imune no hospedeiro. Isso é relevante no contexto do uso de algumas micobactérias para desencadear um perfil imunológico protetor contra diferentes patologias10,11,12,13. Foi demonstrado, por exemplo, que Mycolicibacterium vaccae, um micobacterium saprofítico, que atualmente está em ensaios clínicos de fase III como vacina imunoterapêutica para tuberculose, apresentam dois morfotipos coloniais. Enquanto o fenótipo liso, que contém um poliéster em sua superfície, desencadeia uma resposta Th2, o fenótipo áspero desprovido do poliéster pode induzir um perfil Th1 quando interage com células imunes hospedeiras14. O repertório de lipídios presentes na célula micobacteriana não depende apenas das espécies de micobactérias, mas também das condições das culturas micobacterianas: tempo de incubação15,16 ou composição do meio de cultura17,18. De fato, mudanças na composição média da cultura afetam a atividade antitumoral e imunoestimulatória de M. bovis BCG e Mycolicibacterium brumae in vitro17. Além disso, o perfil imunológico protetor desencadeado por M. bovis BCG contra M. tuberculosis desafio em modelos de camundongos também depende da mídia cultural em que M. bovis BCG cresce17. Estes poderiam então estar relacionados com a composição lipídica das micobactérias em cada condição cultural. Por todas essas razões, o estudo do conteúdo lipídico das micobactérias é relevante. Um procedimento visual para extrair e analisar a composição lipídica da parede celular micobacteriana é apresentado.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Extração do total de lipídios não covalentes da micobactéria (Figura 1)

  1. Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com tampas de parafuso de revestimento politetrafluoroethlene (PTFE). Adicione uma solução composta por 5 mL de clorofórmio e 10 mL de metanol (clorofórmio:metanol, 1:2).
    NOTA: Quando forem utilizados solventes orgânicos, apenas o recipiente de vidro deve ser utilizado. Não são permitidos recipientes plásticos. Além disso, são necessárias tampas de parafuso de forro PTFE para garrafas.
    ATENÇÃO: O clorofórmio é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O metanol é uma substância potencialmente tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  2. Deixe o tubo em constante agitação durante a noite para extrair lipídios não ligados ao covalente da superfície celular micobacteriana.
    NOTA: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível.
  3. Cubra um funil de vidro com um papel filtro, filtre os solventes orgânicos e colete-os em um tubo de vidro.
  4. Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encha o tubo com gás nitrogênio, cubra e guarde a 4 °C.
    NOTA: Conecte uma pipeta pasteur de vidro ao fluxo de gás nitrogênio para evaporar especificamente o tubo desejado. Além disso, mantenha o tubo dentro de um aquecedor de bloco seco para tubos a 37 °C. Quando o solvente evaporar, encha o tubo com gás nitrogênio antes de fechá-lo.
  5. Adicione 15 mL de uma solução de clorofórmio:metanol (2:1) aos detritos celulares. Deixe o tubo em constante agitação durante a noite para extrair lipídios não ligados ao covalente da superfície celular micobacteriana.
    NOTA: Se uma plataforma de agitação orbital não estiver disponível, a agitação constante pode ser substituída por agitação manual periódica com a maior frequência possível.
  6. Deixe a mistura descansar por 1h. Com uma pipeta Pasteur, recupere os solventes orgânicos. Cubra um funil de vidro com um papel filtro e filtre os solventes orgânicos e colete-os no mesmo tubo de vidro anteriormente utilizado na etapa 1.3. Use um fluxo de gás nitrogênio para evaporar a fase líquida no tubo. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene-o novamente a 4 °C.

2. Extração de ácido micólico por methanólise ácida (Figura 2A)

  1. Adicione 2-5 mL de solução esterificante em um tubo de vidro hermético com uma tampa de parafuso de forro PTFE. Adicione 0,2 g de biomassa de micobactéria no tubo de vidro.
    NOTA: A solução esterificante é formada pela mistura de 30 mL de metanol, 15 mL de tolueno e 1 mL de ácido sulfúrico. As células de micobactérias podem ser retiradas de culturas sólidas ou, mesmo de células delipidadas após a realização da extração de lipídios não covalentes totais de micobactérias (células remanescentes após filtragem na etapa 1.6).
    ATENÇÃO: O tolueno é uma substância inflamável e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O ácido sulfúrico é uma substância corrosiva e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  2. Misture o conteúdo por vórtice. Deixe a mistura ficar dentro de um banho seco a 80 °C durante a noite.
  3. Deixe o tubo esfriar até atingir a temperatura ambiente e, em seguida, adicione 2 mL de n-hexano ao tubo. Misture o conteúdo por vórtice por 30 s e deixe o tubo se instalar até que duas fases claras apareçam.
    ATENÇÃO: o n-hexano é uma substância inflamável, irritante, ambientalmente prejudicial e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  4. Recuperar a fase superior correspondente à fase n-hexano. Transfira para um novo tubo.
  5. Repita o passo 2.3. Recupere a fase superior novamente e transfira-a para o mesmo tubo usado na etapa 2.4.
  6. Evaporar o conteúdo do tubo usando um fluxo de gás nitrogênio. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene-o a 4 °C.

3. Extração de ácido micolico por saponificação e metilação (Figura 2B)

  1. Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com uma tampa de parafuso PTFE.
  2. Adicione 2 mL de solução metanol-benzeno (80:20) contendo hidróxido de potássio de 5%. Misture o conteúdo por vórtice. Aqueça a mistura por 3h a 100 °C.
    ATENÇÃO: O benzeno é uma substância inflamável, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  3. Deixe o tubo esfriar até a temperatura ambiente. Adicione 20% de ácido sulfúrico para acidificar as amostras para alcançar pH = 1.
  4. Adicione 3 mL de éter de dietil. Misture suavemente o conteúdo com vórtice.
  5. Que as duas fases se formem se estabelecendo. Recupere a fase do éter de dietil e transfira para um novo tubo. Repita o passo de lavagem por um total de três vezes.
  6. Lave o extrato de éter de dietil com 2 mL de água destilada e transfira a parte superior correspondente ao éter de dietil para um novo tubo. Repita o passo de lavagem por um total de três vezes.
  7. Adicione 2 g de sulfato de sódio anidro sobre o extrato de éter de dietil para secá-lo.
  8. Filtre a suspensão. Evaporar o conteúdo usando um fluxo de gás nitrogênio.
  9. Para realizar a etapa de metilação, dissolva 3 g de N-nitroso-N-metil ureia em uma solução pré-reformada formada por 45 mL de éter dietilo e 9 mL de 40% KOH em água destilada.
    ATENÇÃO: N-nitroso-N-metilurea é uma substância tóxica, irritante, cancerígena e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  10. Transfira o supernatante (diazometano) para um novo frasco resfriado em gelo contendo pelotas de hidróxido de potássio (aproximadamente 30 g).
    NOTA: Se o supernaspe não for usado imediatamente, pode ser armazenado a -20 °C por uma máxima de 1h.
    ATENÇÃO: As pelotas de hidróxido de potássio são uma substância irritante e corrosiva. Este material deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual apropriados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrílho).
    ATENÇÃO: O diazometano é altamente tóxico e potencialmente explosivo. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar com vidro de segurança usando equipamentos de proteção individual apropriados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  11. Adicione 2 mL da solução éter contendo diazometano, obtido na etapa 3.10, no extrato de éter dietil seco que contém ácidos micólicos, obtidos na etapa 3.8. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
  12. Evaporar a suspensão a 40 °C. Encha o tubo com gás nitrogênio, feche-o e armazene os lipídios metilados a 4 °C.
    NOTA: Evaporar o diazometano da solução éter sob a capa de fluxo laminar, até que o éter perca a cor amarela.

4. Análise de cromatografia de camada fina (TLC)

  1. Saturar a câmara TLC de vidro. Para isso, cubra uma das paredes da câmara TLC com um pedaço de papel filtro e deixe que ela esteja em contato com a fase móvel composta pela mistura de solventes. Coloque o volume restante do solvente na parte inferior da câmara TLC.
    NOTA: A parte inferior da câmara TLC deve ser coberta por pelo menos 1 cm da fase móvel. Nos experimentos atuais, foram utilizadas diferentes fases móveis para o desenvolvimento dos TLCs. Eles consistiam de 85 mL de n-hexano mais 15 mL de éter dietil; 100 mL de diclorometano; 90 mL de clorofórmio, 10 mL de metanol e 1 mL de água; 30 mL de clorofórmio, mais 8 mL de metanol, e 1 mL de água; 60 mL de clorofórmio, mais 35 mL de metanol, e 8 mL de água; Clorofórmio de 95 mL mais 5 mL de metanol; e 90 mL de éter de petróleo (60-80 °C) mais 10 mL de éter de ditila.
    NOTA: No TLC bidimensional, use n-hexano:acetona (95:5) na primeira direção três vezes, e use um único desenvolvimento com tolueno:acetona (97:3) na segunda direção para analisar a composição do ácido mcólico. Para analisar os PIMs, use clorofórmio:metanol:água (60:30:6) na primeira direção uma vez, e use clorofórmio:ácido acético:metanol:água (40:25:3:6) na segunda direção. Para analisar o PDIM e o AG, utilize o éter de petróleo (60-80 °C): acetato etílico (98:2) na primeira direção três vezes, e utilize um único desenvolvimento com éter de petróleo (60-80 °C): acetona (98:2) na segunda direção.
    ATENÇÃO: O éter de diethyl é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O diclorometano é uma substância potencialmente tóxica e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O éter de petróleo é uma substância inflamável, ambientalmente prejudicial e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O ácido acético é uma substância inflamável e corrosiva em potencial. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O acetato de etila é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: A acetona é uma substância inflamável e perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
  2. Feche a câmara TLC para saturar por pelo menos 20 minutos. Enquanto isso, dissolva os lipídios presentes no tubo de vidro em 0,2-1 mL de clorofórmio.
    NOTA: O volume utilizado para dissolver os lipídios pode ser modificado dependendo da concentração desejada ou esperada da amostra.
  3. Aplique 10 μL de cada suspensão usando um tubo de vidro capilar diretamente na placa TLC e deixe a amostra secar por 5 minutos à temperatura ambiente.
    NOTA: As amostras devem ser aplicadas na parte inferior da placa, deixando 1 cm de cada lado. As amostras devem ser separadas uma da outra por pelo menos 0,5 cm. Uma vez que a amostra é aplicada na placa, os tubos podem ser evaporados novamente com gás nitrogênio e armazenados a 4 °C para uso posterior.
  4. Insira a placa na câmara TLC saturada que contém a fase móvel. Permita que a fase móvel passe pelo TLC.
    NOTA: Qualquer movimento aplicado na câmara TLC afeta o solvente em funcionamento na placa e afeta a mobilidade lipídica. No caso de realizar tlc bidimensionais, duas câmaras TLC são necessárias para conter ambos os sistemas de elução.
  5. Retire a placa da câmara TLC quando o solvente atingir 1 cm de distância da extremidade superior da placa. Deixe a placa sob fluxo laminar até que a sílica esteja totalmente seca.
    NOTA: No caso de analisar a composição do ácido mórclico, utilizando n-hexano e diethyl-éter (85:15), repita as etapas 4.4 e 4,5 vezes mais, até executar a fase móvel três vezes sobre a placa TLC.
  6. Revelar a placa com a mancha necessária; aqueça a placa, se necessário.
    NOTA: No presente experimento, 15-20 mL das seguintes soluções foram utilizadas para pulverizar as placas TLC: 10% hidratofosfórico de ácido molybdatophosphoric no etanol até que a placa esteja amarela brilhante, seguida pelo aquecimento da placa a 120 °C; 5% no etanol de 20% α-naftol em ácido sulfúrico seguido de aquecimento da placa a 120 °C; Reagente azul de molhênio (1,3% óxido de molbênio em ácido sulfúrico de 4,2 M) até que as bandas de fosfato apareceram ou 1% de anthrone em ácido sulfúrico.
    ATENÇÃO: O hidratofosfórico de umidade é uma substância inflamável e corrosiva. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O etanol é uma substância inflamável e perigosa em potencial. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: 1-Naftil é uma substância inflamável, corrosiva e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).
    ATENÇÃO: O reagente de spray azul de molhênio é uma substância corrosiva, tóxica e extremamente perigosa. Deve ser usado em um capô de fluxo laminar usando equipamentos de proteção individual adequados (casaco de laboratório, óculos de proteção e luvas de nitrito).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Com o objetivo de mostrar uma ampla gama de lipídios presentes em diferentes espécies de micobactérias, M. bovis BCG foi selecionado por ser micobactérias ásperas e de crescimento lento. O áspero e rápido crescimento M. fortuitum e M. brumae foram adicionados no procedimento e, finalmente, o morfotipo liso de M. abscesso também foi incluído. Essas quatro espécies nos permitem visualizar um amplo espectro de lipídios derivados de micobactérias, como acitrehaloses (AT), GPLs, PDIM, PGL, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um protocolo simples considerado como o método padrão-ouro para a extração de compostos lipídicos não covalentes ligados da parede celular micobacteriana é apresentado. Uma visualização adicional por TLCs unidimensionais dos lipídios extraídos de quatro micobactérias diferentes é mostrada.

Duas misturas combinadas consecutivas de clorofórmio e metanol para recuperar o teor lipídico das células micobacterianas é a mistura de solvente mais utilizada23,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência, Inovação e Universidades da Espanha (RTI2018-098777-B-I00), pelos Feder Funds e pela Generalitat da Catalunha (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido é beneficiária de um contrato de doutorado (FI) da Generalitat de Catalunya.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ácido acéticoMerck100063CUIDADO. Anidro para análise EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur
AcetonaCarlo Erba400971NCUIDADO. ACETONA RPE-ACS-ISO PARA ANÁLISE ml 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone para síntese.
BenzenoCarlo Erba426113CUIDADO. Benzeno RPE - Para análise - ACS 2,5 l
Tubo de vidro capilarMerckBR708709BRAND®   descartável BLAUBRAND®   micropipetas, intraMark
ClorofórmioCarlo Erba412653CUIDADO. Clorofórmio RS - Para HPLC - Grau isocrático - Estabilizado com etanol 2,5 L
Aquecedor de bloco secoJ.P. Selecta7471200
DiclorometanoCarlo Erba412622CUIDADO. Diclorometano RS - Para HPLC - Grau isocrático - Estabilizado com amileno 2,5 L
Éter dietílicoCarlo Erba412672CUIDADO. Éter dietílico RS - Para HPLC - Grau isocrático - Não estabilizado 2,5 L
Acetato de etilaPanreac1313181211CUIDADO. O acetato de etilo (Reag. USP, Ph. Eur.) para análise, ACS, ISO
Álcool Etílico AbsolutoCarlo Erba4146072CUIDADO. Etanol EPR anidro absoluto - Para análise - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Funil de vidroVidraFOCDURA.2133148 1217/1
Tubo de vidroVidraFOCVFOC.45066A-16125Tubo de vidro com tampa recuperada de PTFE
MetanolCarlo Erba412722CUIDADO. Metanol RS - Para HPLC - OURO - Grau ultragradiente 2,5 L
Hidrato de ácido molibdatofosfóricoMerck51429-74-4CUIDADO.
Reagente azul do pulverizador do molibdênio, 1.3%SigmaM1942-100MLCUIDADO.
n-hexanoCarlo Erba446903CUIDADO. n-Hexano 99% RS - ATRASOL - Para análise de traços 2,5 L
n-nitroso-n-metilureiaSigmaN4766CUIDADO
Plataforma de agitação orbitalDDBiolab995018NB-205L incubadora de agitação de bancada
Éter de petróleo (60-80º C)Carlo Erba427003CUIDADO. Éter de petróleo 60 - 80° C RPE - Para análise 2,5 L
PulverizadorVidraFOC712/1
Sulfato de sódio anidroMerck238597
Ácido sulfúrico 95-97%Merck1007311000CUIDADO. Câmara de ácido sulfúrico 95-97%
TLCMerckZ204226-1EATanques de desenvolvimento retangulares TLC, L completo &vezes; H &vezes; L 22 cm &vezes; 22 cm &vezes; Placa TLC de 10 cm
Merck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Aquecedor de placasCAMAG223306CAMAG TLC Aquecedor de placas III
Tolueno Carlo Erba488551CUIDADO. Tolueno RPE - Para análise - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
VortexFisher Scientific10132562IKA  Agitador IKA vó rtex 3
1-naftolSigma-Aldrich102269427CUIDADO.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
  2. Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
  3. Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
  4. Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315(2017).
  5. Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
  6. Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985(2020).
  7. Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217(2017).
  8. Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
  9. Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185(2016).
  10. Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
  11. Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
  12. Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
  13. Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232(2016).
  14. Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
  15. Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  16. Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
  17. Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734(2020).
  18. Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
  19. Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
  20. Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
  21. Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
  22. Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
  23. Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
  24. Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
  25. Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
  26. Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
  27. Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
  28. Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
  29. Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
  32. Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
  33. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
  34. Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
  35. Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
  36. Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  37. Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
  38. Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035(2015).
  39. Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
  40. Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
  41. Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacteria LipidsLipid ExtractionThin Layer ChromatographyMycolic Acid AnalysisMycobacterial Cell WallOrganic Solvent ExtractionOne Dimensional TLCTwo Dimensional TLCPhenolic GlycolipidsGlycopeptidolipids

Related Articles