Neste protocolo, apresentamos os procedimentos experimentais de um ensaio de difusão celular que é baseado em microscopia de células vivas. Fornecemos uma ferramenta computacional de código aberto para a segmentação imparcial de células fluorescentes rotuladas e análise quantitativa da dinâmica da lamellipodia durante a disseminação celular.
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Artigo de método
Análise quantitativa da dinâmica da borda celular durante a disseminação celular
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A disseminação celular é um processo dinâmico no qual uma célula suspensa em mídia se conecta a um substrato e se achata de uma forma arredondada para uma forma fina e espalhada. Seguindo o acessório de substrato celular, a célula forma uma fina folha de lamellipodia emanando do corpo celular. Na lamellipodia, os monômeros globulares (G-actin) polimerizam-se em uma densa malha de ato desordenada (F-actin) que empurra contra a membrana plasmática, fornecendo assim as forças mecânicas necessárias para que a célula se espalhe. Notavelmente, os atores moleculares que controlam a polimerização de actina na lamellipodia são essenciais para muitos outros processos celulares, como migração celular e endocitose.
Uma vez que a disseminação de células forma lamellipodia contínua que abrange toda a periferia celular e se expande persistentemente para fora, ensaios de disseminação celular tornaram-se uma ferramenta eficiente para avaliar a cinética das protrusões lamellipodial. Embora várias implementações técnicas do ensaio de disseminação de células tenham sido desenvolvidas, uma descrição detalhada do fluxo de trabalho, que incluiria um protocolo passo a passo e ferramentas computacionais para análise de dados, está atualmente em falta. Aqui, descrevemos os procedimentos experimentais do ensaio de disseminação celular e apresentamos uma ferramenta de código aberto para análise quantitativa e imparcial da dinâmica da borda celular durante a disseminação. Quando combinado com manipulações farmacológicas e/ou técnicas de silenciamento de genes, este protocolo é favorável a uma tela em larga escala de jogadores moleculares que regulam saliências lamellipodiais.
Introdução
As saliências lamellipodias são estruturas citoesqueléticos proeminentes formadas na frente de uma célula migratória. Em lamellipodia, a polimerização do actin com o auxílio do complexo Arp2/3 e formins cria um trabalho de malha de actina ramificada de rápido crescimento que empurra contra a membrana plasmática1,2. A força de empurrão gerada pelo trabalho de malha de actina impulsiona fisicamente a célula para a frente1,3,4,5. Esgotamento do complexo Arp2/3 ou interrupção de vias de ....
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Protocolo
1. Semeadura celular
NOTA: O protocolo de disseminação de células descrito foi realizado utilizando fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) expressando PH-Akt-GFP (um marcador fluorescente para PIP3/PI(3,4)P2). Esta linha celular foi gerada pela integração genomicamente de uma construção de expressão para PH-Akt-GFP (Addgene #21218) pela edição de genes mediada pelo CRISPR. No entanto, outros marcadores fluorescentes que são expressos transitoriamente ou integrados no genoma também podem ser usados neste ensaio. Para a segmentação de imagem ideal, recomendamos o uso de marcadores fluorescentes que são distribuído....
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Resultados
O protocolo acima descreve os procedimentos experimentais para a imagem de células vivas de células disseminadas e uma ferramenta computacional para a análise quantitativa da dinâmica de disseminação celular. A ferramenta computacional pode ser usada em um formato de baixo ou alto rendimento para identificar os atores moleculares que regulam o maquinário de polimerização de actina na borda principal da célula.
A representação esquemática dos procedimentos experimentais é retratada na
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Discussão
O ensaio de disseminação de células descrito permite o rastreamento contínuo de alterações morfológicas (por exemplo, tamanho e forma da célula) e movimentos de borda celular(ou seja, velocidade de saliência e frequência de retração), que são características ausentes na maioria dos protocolos de disseminaçãocelular 19,24. Embora os ensaios de disseminação de células de ponto final comumente usados permitam a determinação da velocidade de expansã.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (bolsas RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% de tripsina (0,05%), 0,53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10,0 cm Placa de Petri, Poliestireno, Tratado TC, Ventilado | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL Tubo de Centrífuga PP de Alta Clareza, Fundo Cônico, com Tampa de Rosca de Vedação de Cúpula, Estéreis | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS para 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| Placa de cultura de células estilo fácil de segurar tratada com TC de 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tubo de centrífuga de 50 mL, transparente, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| Placas de cultura de células de 6,0 cm tratadas para maior fixação celular, Estéril | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Inibidor de Complexo I, CK-666 | Câmera Millipore Sigma | 182515 | |
| , Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimetil Sulfóxido, Estéril | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4,5 g/L de Glicose, com L-Glutamina, Piruvato de Sódio e Fenol Vermelho | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, Sem Vermelho de Fenol | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Soro bovino fetal | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Proteína Purificada de Fibronectina Plasmática Humana 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Óleo de Imersão | Cargille | 16241 | |
| Solução de L-Glutamina (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Quadrado, Nº 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| , Eclipse Ti2-E | Objetiva Nikon | ||
| , CFI Plan Apo Lambda 60X Óleo | Nikon | MRD01605 | |
| Penicilina-estreptomicina | Sigma | P4333 | |
| Disco de giro, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubadora | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| pinças, Estilo 2 | Microscopia Eletrônica Ciências | 78326-42 |
Referências
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T.
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Reimpressões e permissões
