Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Resumo

Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.

Resumo

Xenoenxertos larval de zebrafish estão sendo amplamente utilizados para pesquisas sobre câncer para realizar estudos in vivo e em tempo real do câncer humano. A possibilidade de visualizar rapidamente a resposta às terapias anticâncgenas (quimioterapia, radioterapia e biológica), angiogênese e metástase com resolução celular única, coloca o modelo de xenoenxerto de zebrafish como uma das principais escolhas para desenvolver estudos pré-clínicos.

O ensaio larval de xenoenxerto de zebrafish apresenta várias vantagens experimentais em comparação com outros modelos, mas provavelmente o mais marcante é a redução da escala de tamanho e, consequentemente, do tempo. Essa redução de escala permite imagens de células únicas, o uso de um número relativamente baixo de células humanas (compatível com biópsias), triagens de medicamentos de alto rendimento, mas o mais importante permite uma redução significativa do tempo do ensaio. Todas essas vantagens tornam o ensaio de xenoenxerto de zebrafish extremamente atraente para futuras aplicações de medicamentos personalizados.

Muitos protocolos de xenoenxerto de zebrafish foram desenvolvidos com uma ampla diversidade de tumores humanos; no entanto, ainda falta um protocolo geral e padronizado para gerar xenoenxertos larval de zebrafish. Aqui fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.

Introdução

O zebrafish (Danio rerio) está emergindo como um poderoso organismo modelo vertebrado para estudar o desenvolvimento e a doença. O zebrafish compartilha características genéticas altamente conservadas (~70% de homologia genética e ~84% de genes relacionados à doença) e características morfológicas básicas de órgãos com humanos^1,2. Essa conservação permite o uso de zebrafish para modelar várias doenças humanas, incluindo o câncer^3,4.

O manuseio e manutenção de zebrafish é muito mais fácil e econômico do que os camundongos devido ao seu pequeno tamanho, alta fecundidade durante todo o ano e fertilização externa^3,5. Os embriões de zebrafish não necessitam de alimentação viva durante seus primeiros 5-7 dias de vida e têm sido usados como um modelo eficaz para o desenvolvimento, infecção e câncer^1,4,6,7. Os embriões de zebrafish chocam a 48 horas após a fertilização (hpf) e são animais de natação livre com todos os órgãos formados, um sistema circulatório pulsante e funcional, fígado, cérebro, medula renal, etc.^1,3. Além disso, nesta fase de desenvolvimento apenas a imunidade inata está em jogo, a imunidade adaptativa ainda está em desenvolvimento, permitindo um enxerto eficiente geral de células humanas sem necessidade de uso de mutantes imunocomprometidos^7,8. No entanto, é importante notar que nem todas as células humanas engrafam igualmente⁹ e que, por exemplo, para as células de leucemia foi demonstrado que os fagocitos (neutrófilos e macrófagos) precisam ser esgotados para um enxerto eficiente¹⁰.

A trato genética dos zebrafish e a transparência óptica de seus estágios embrionários iniciais permitem imagens intravitais de célula única em alta resolução e, portanto, para o estabelecimento de técnicas de imagem de última geração em diversos campos da biologia. Além disso, no contexto do câncer, essas características são úteis para estudos em tempo real dos estágios iniciais das interações hospedeira-tumor, como o estudo do potencial angiogênico e metastático, bem como interações com o sistema imunológico inato^8,9,11,12,13.

Embora no curto ensaio xenoenxerto não haja tempo para "evolução" metastática- é possível analisar a capacidade metastática das células tumorais (ou seja, sua eficiência para passar por etapas metastáticas como invasão, intravasão, sobrevivência em circulação, extravasão e colonização, e, portanto, estudar esses processos in vivo e em tempo real^8,11,13,14).

As características de seu ciclo de vida colocam o zebrafish como um modelo único para a medicina personalizada no câncer. Os ensaios podem ser realizados em um período de tempo mais curto e os resultados obtidos em poucas semanas^{7,8,9,11,12,15,16}. A celeridade e a viabilidade desses ensaios proporcionam aos médicos e pesquisadores a possibilidade de obter resultados translacionais que possam ser úteis para pacientes com câncer, para os quais o tempo é uma necessidade essencial.

Apesar das tentativas crescentes de gerar xenoenxertos de embrião de zebrafish bem sucedidos, ainda há necessidade da padronização do procedimento de injeção, bem como da avaliação da viabilidade celular e do comportamento tumoral após a injeção.

Neste protocolo, fornecemos aos pesquisadores um guia passo a passo claro e detalhado para a injeção de linhas de células cancerígenas humanas em embriões de zebrafish e posterior fixação, imunostaining, imagem e quantificação do comportamento das células tumorais.

Protocolo

O modelo de zebrafish (Danio rerio) foi manuseado e mantido de acordo com os protocolos padrão da Legislação Europeia de Bem-Estar Animal, Diretiva 2010/63/UE (Comissão Europeia, 2016) e Champalimaud Fish Platform. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Champalimaud e pelas organizações institucionais portuguesas-ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/Corpo de Ética Animal/Animal) e DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Diretoria Geral de Alimentação e Veterinária).

NOTA: Antes de iniciar o experimento principal, pratique com a linha celular HCT116 (Câncer colorretal) humano (CRC). Esta linha celular é fácil de preparar (altamente proliferativa), fácil de injetar e engrafia de forma muito eficiente (em torno de 95-100%). Comece com células em excesso (~12x10⁶ células, frasco T-75) e peixes em excesso (400 peixes) até se tornar proficiente na técnica, já que muitas células e peixes serão perdidos durante o treinamento. Os experimentadores estão prontos assim que o engrafamento de ~95% for alcançado em xenoenxertos HCT116. Consulte a Figura 1 para obter um esquema do protocolo completo.

1. Configuração para injeção

1. Duas semanas antes da injeção, expanda as células na cultura (ver Tabela 1 para um guia detalhado da confluência in vitro ideal para injeção de várias linhas celulares).
2. Três dias antes da injeção, cruze o zebrafish do fundo desejado.

2. 24 h antes da injeção

1. Limpe as placas de embrião de zebrafish (descarte todos os embriões mortos e não desenvolvidos) e refresque o meio E3.
2. Na sala de cultura celular, descarte o meio de cultura celular dos frascos planejados para injeção, lave uma vez com 1x de soro fisco tamponado (PBS) para remover as células mortas e adicionar meio fresco.
3. Prepare as ferramentas para o procedimento de injeção, tais como: agulhas de microinjeção, placas de ágarose e grampos de cabelo para alinhar embriões para injeção (Figura 2A-D, detalhado abaixo).
   1. Agulhas de microinjeção(Figura 2A)
      1. Use capilares de vidro borossilicato (4 polegadas, OD 1,0 mm, Sem Filamento em um puxador de micropipette (calor: ≈500; fil: 10; vel: 50; dez: 60; puxar: 100).
   2. Preparação da placa (Figura 2B)
      1. Prepare 2% de agarose em H₂O, aqueça-o e despeje uma camada de agarose dissolvida na tampa de uma placa de Petri limpa. Deixe polimerizar e com a ajuda de uma régua, faça de três a quatro linhas retas de agarose para o alinhamento dos embriões.
   3. Montagem hairpin (Figura 2C-D)
      1. Coloque 1 cabelo dentro de um tubo capilar de vidro deixando aproximadamente 1 centímetro de cabelo fora do tubo.
      2. Enrole a ponta externa do cabelo com a ajuda de fórceps no tubo capilar de vidro formando um laço de ~0,5 mm de comprimento.
      3. Sele a borda do tubo capilar com uma gota de esmalte. Isso também ajudará a corrigir o loop no lugar. Deixe secar. Repita o procedimento na outra borda do tubo.
      4. Corte um pedaço de fita elétrica (mais resistente, impermeável e rígido do que a fita adesiva normal).
      5. Sele a fita ao redor do capilar para protegê-la de quebrar.

3. Dia da injeção

1. Separe os embriões eclodidos de ovos não-descomparáveis. Adicionar 1x pronase (0,6 mg/mL, Tabela 3) ao meio do embrião nesta fase pode impulsionar a eclosão. Coloque os embriões na incubadora (a 28 °C) até a injeção.
   NOTA: Não deixe os embriões na solução de pronase por mais de 1 hora, uma vez que a enzima atuará nos embriões eclodidos aumentando o risco de mortalidade. Assegurar que o estágio de desenvolvimento dos embriões seja aquele correspondente a 48 hpf (Figura 3A, A)para evitar o risco de edema e mortalidade.
2. Prepare 1x Tricaine (a partir de um estoque de 25x).
   NOTA: Uma receita detalhada pode ser encontrada na Tabela 3 e na Rede de Informações zebrafish - página¹⁷da ZFIN .

4. Rotulagem celular para injeção

NOTA: A rotulagem das células pode ser realizada diretamente em um frasco ou em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL após o descolamento enzimático. Consulte Discussão para obter mais informações.

1. Remova o meio de cultura celular e lave o frasco duas vezes (2x) com 1X PBS.
2. Rotule as células com um corante lipofílico de escolha diretamente no frasco (solução de 2 mL/frasco T75) ou em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL após o descolamento enzimático. Evite a exposição à luz e incuba as células a 37 °C (ver Tabela 1 e Tabela 2 para condições/soluções).
3. Se rotular no frasco
   1. Retire o corante, lave com 1x PBS e desprende as células com EDTA e um raspador de células.
   2. Transfira células para tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Centrifugar por 5 minutos a 300 x g, em seguida, ir para o passo 4.5.
4. Se rotular no tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL:
   1. Centrifugar 5 minutos a 300 x g para remover o corante e descartar o supernatante. Resuspend em 1x PBS para lavar.
   2. Centrifugar 5 minutos a 300 x g e depois ir para o passo 4.5.
5. Descarte o supernaspetivo e resuspenque a pelota com meio de cultura celular (para um adoto de pelota de 50 μL ~ 150-200 μL de meio).
6. Quantifique a viabilidade celular usando uma câmara de Neubauer com exclusão azul trypan ou outro método de escolha.
7. Centrifugar por 4 minutos a 300 x g e descartar o supernatante. Resuspenda as células no meio de injeção.
   NOTA: A concentração celular recomendada (em geral a partir de 0,25-0,5x10⁶ células/μL) e média pode ser encontrada na Tabela 1.
8. A partir deste ponto, mantenha as células no gelo.

5. Procedimento de injeção

1. Anestesiar os embriões em 1x Tricaine por 5 minutos.
2. Com uma pipeta pasteur de plástico, transfira uma pequena quantidade (~50) de embriões anestesiados para a placa de agarose e alinhe-os cuidadosamente com a ajuda de um laço de grampo. Certifique-se de manter distância entre os embriões, especialmente entre a gema de um e a cabeça da próxima(Figura 4A).
   NOTA: O número de embriões a se alinhar vai variar de acordo com o nível de experiência do pesquisador que realiza as injeções. Comece com alguns (~10-20). Para obter um esquema do posicionamento correto dos embriões na placa ágar/agarose, consulte a Figura 4A.
3. Certifique-se de que os embriões alinhados não sequem na placa de agarose para evitar a mortalidade, adicionando cuidadosamente 1-3 gotas de 1x solução tricaina à placa.
4. Toque levemente no tubo de microcentrifuge para resususpensar as células. Recarregue a agulha de injeção com a suspensão celular usando uma ponta de microcarregador evitando bolhas de ar, pois podem comprometer a integridade dos embriões.
5. Abra a válvula de pressão de ar (40 psi), configure o microinjetor e coloque cuidadosamente a agulha de microinjeção no suporte.
   NOTA: Use as seguintes configurações recomendadas de microinjetor: Segurar pressão - ventilação (3 psi); Pressão de ejetar - ventilação; Alcance - 100 ms.
6. Corte a agulha de microinjeção perto da ponta com fórceps Dumont #5 ou similar sob o estereóscópio.
   NOTA: A ponta deve ser cega e fina o suficiente para permitir que as células passem sem entupimento, bem como para evitar danificar os embriões e perder células. Uma ponta grossa de agulha de microinjeção ferirá o embrião e promoverá a formação de edema ou morte de zebrafish. Graticule não é usado para calibração da agulha. Consulte Discussão para obter uma explicação detalhada.
7. Antes de injetar os embriões, teste a pressão do microinjetor começando pela menor pressão ejetar até que em ~1-3 pulsos um volume semelhante ao tamanho do olho do embrião zebrafish é alcançado.
   NOTA: Recomenda-se o uso de um estereóscópio de fluorescência sempre que possível no início do treinamento. Isso permitirá uma identificação mais fácil de células fluorescentes rotuladas.
8. Fure cuidadosamente no meio da gema do embrião, baixando o ângulo da agulha e empurre com cautela até que a ponta da agulha atinja o espaço perivitelline (PVS) (Figura 4B-D).
9. Pressione o pedal do microinjetor e injete as células no PVS. Use o olho do embrião como guia. Tente injetar um volume de células semelhante ao tamanho do olho do embrião e o mais longe possível do coração para evitar edema cardíaco.
10. Remova cuidadosamente a agulha e passe para o próximo embrião.
11. Ajuste a pressão do microinjetor, se necessário.
    NOTA: As células tendem a começar a entupir, por isso a pressão pode ser aumentada. Se necessário, é possível cortar o capilar (para aumentar o diâmetro) enquanto reduz a pressão.
12. Transfira os embriões injetados para uma placa de Petri limpa(Tabela 4)com 1x solução tricaine e deixe descansar por 5-10 minutos. Isso dará tempo para a ferida fechar.
    NOTA: Para transferir os embriões da placa de ágar para a placa de Petri adicione algumas gotas de solução tricaine 1x em cima dos embriões e colete-os cuidadosamente com uma pipeta Pasteur de plástico. Solte os embriões coletados em uma nova placa de Petri com 1x solução tricaine.
13. Remova a solução tricaine 1x e adicione um meio E3 fresco.
14. Incubar os xenoenxertos a 34 °C (temperatura comprometida entre a sobrevivência das linhas celulares humanas e o desenvolvimento de zebrafish⁸).

6. Ensaio metastático

1. Com aproximadamente 1 hora de pós-injeção (hpi), trie os embriões injetados em um estereóscópio fluorescente e classifique os xenoenxertos em 2 grupos, de acordo com a ausência (Figura 5A) ou presença(Figura 5B) de células em circulação.
   NOTA: Mesmo que apenas uma célula cancerígena seja detectada no coração ou circulação, inclua esses xenoenxertos no grupo de xenoenxertos com células em circulação. Alternativamente, as células podem ser injetadas diretamente em circulação para aumentar o número de xenoenxertos neste grupo.

7. 1 dia após a injeção

1. Em um estereótipo fluorescente, analise cuidadosamente cada embrião e selecione aqueles com tumores devidamente injetados(Figura 6).
   NOTA: Se necessário, anestesiar os embriões injetados com solução Tricaine 1X antes da triagem.
2. Descarte os seguintes embriões/xenoenxertos(Figura 6A-A''):
   • sem tumor/morfologia anormal/morto,
   • com edema cardíaco e/ou gema,
   • com células tumorais apenas na gema,
   • com pouquíssimas células cancerígenas.
3. Classificar xenoenxertos selecionados de acordo com o tamanho do tumor. Use o tamanho do olho para comparação(Figura 6B-B'', 6C).
   • Tumores menores que o tamanho do olho (+),
   • Tumores do mesmo tamanho do olho (++),
   • Tumores maiores que o tamanho do olho (+++).
4. Distribua os xenoenxertos de acordo com o layout experimental desejado e inicie o ensaio de drogas (controle vs droga, etc.). Substitua as drogas e o E3 médio diariamente(Tabela 4).
5. Incubar os xenoenxertos mantendo a temperatura de 34°C até o final do ensaio.

8. 4 dias após a injeção

1. No último dia do ensaio, anestesia os xenoenxertos com solução tricaine 1x e alinhe-os cuidadosamente na placa de ágar.
   NOTA: Descarte quaisquer xenoenxertos mortos ou inchados. Tratamentos medicamentosos e algumas células tumorais podem induzir toxicidade e eventualmente causar mortalidade por xenoenxerto. Estes xenoenxertos não são considerados para quantificação de engrafamento.
2. Para determinar a porcentagem de engrafamento: em um estereómico fluorescente, analise cada xenoenxerto vivo e avalie a ausência (Figura 6D) / presença (Figura 6E) de tumores no PVS.
   
3. Para determinar a porcentagem de metástase: em um estereóquio fluorescente, analise cada xenoenxerto e avalie a presença/ausência de micrometastase no tecido hematopoiético caudal (CHT) dos dois grupos previamente definidos (CIRC e NO CIRC, Figura 6F)
   
4. De acordo com a configuração experimental, selecione os xenoenxertos de interesse e eutanize-os com tricaine 25x (Tabela 3).
5. Fixá-los em 4% de formaldeído (FA) por pelo menos 4 horas em temperatura ambiente (RT) ou durante a noite a 4 °C.
   NOTA: Use formaldeído sem metanol (16% FA) diluído em 4% em PBS/0,1% Triton. Encha os tubos até o topo com fixação. Posicione os tubos horizontalmente para garantir uma fixação homogênea de todos os xenoenxertos, aumentando a permeabilidade e impedindo que o zebrafish se acomode na parte inferior.
6. Alternativamente fixá-los com PIPES (Por 1 mL: 100 μL de 1 M DE SAL DE sódio PIPES (4 °C); 1 μL de 1 M MgSO₄ (RT); 4 μL de 0,5 M EGTA (RT); 93,7 μL de 16% FA (RT); 801,3 μL de ddH₂O).
   NOTA: A PIPES preserva a fluorescência das linhas transgênicas RFP e mCherry superiores a 4% de FA.
7. Se a imunossuagem for realizada em um dia diferente, substitua a FA por 100% de metanol (MetOH). Os xenoenxertos fixados em 100% de metanol podem ser armazenados a -20 °C indefinidamente.
   NOTA: O MetOH pode prejudicar a eficiência de algumas manchas (ou seja, fhalloidina) e saciar alguma rotulagem fluorescente. Confirme a eficiência dos anticorpos em amostras fixas MetOH com antecedência.

9. Imunostaining de montagem inteira para imagens confocal

NOTA: Toda a técnica de imunofluorescência do montagem leva 3 dias dividida da seguinte forma: O primeiro dia é para permeabilização dos xenoenxertos e incubação de anticorpos primários. O segundo dia para lavagem e incubação de anticorpos secundários e o terceiro dia para lavagem, fixação de xenoenxertos e armazenamento na mídia de montagem.

1. Dia 1º
   1. Se os xenoenxertos foram armazenados em 100% MetOH, reidratá-los por uma série de concentrações de MetOH decrescentes (75%, 50%, 25% MetOH diluídas em PBS/0,1% Triton). Se fixado em FA, substitua-o por PBS/0,1% Triton.
   2. Lave 4x por 5 minutos em PBS/0,1% Triton.
   3. Lave 1x por 5 minutos em H₂O.
      NOTA: Os tubos devem ser posicionados horizontalmente sempre em fixação, permeabilização e etapas de lavagem, a menos que indicado o contrário.
   4. Substitua o H₂O por acetona gelada e incubar a -20 °C por 7 minutos.
      NOTA: Coloque um tubo de 50 mL com acetona a -20 °C para que esteja pronto para usar. Os tubos de microcentrifuge devem ser posicionados verticalmente em um rack para que a acetona não vaze.
   5. Lave 2x por 10 minutos em PBS/0,1%Triton.
   6. Incubar com PBDX_GS solução de bloqueio por 1 h no RT (tampão de bloqueio PBDX_GS: 50 mL de 1x PBS; 0,5 g de albumina de soro bovino - BSA; 0,5 mL de DMSO; 250 μL de 10% Tritão; 750 μL de soro de cabra - GS (15 μL/1 mL)).
   7. Remova PBDX_GS e adicione ~40 μL de diluição de anticorpos primários (geralmente 1:100).
      NOTA: O volume da diluição do anticorpo primário varia dependendo do número de xenoenxertos presentes no tubo de microcentrifuuge. Certifique-se de que todos os xenoenxertos estão submersos.
   8. Incubar por 1 hora no RT e depois a 4 °C durante a noite. Posicionar tubos verticalmente.
2. Dia 2.
   1. Remova o anticorpo primário e lave 2x por 10 minutos em PBS/0,1% Triton.
   2. Lave 4x por 30 min em PBS/0,05% Tween.
      NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas no escuro (use papel alumínio para proteger os tubos da luz).
   3. Remova o PBS/0,05% Tween e adicione ~50-100 μL de diluição de anticorpos secundários (geralmente 1:200 - 1:400) + DAPI (50 μg/mL) diluído em PBDX_GS.
   4. Incubar por 1 hora no RT e depois a 4 °C durante a noite. Posicione os tubos verticalmente e proteja-se contra a luz.
3. Dia 3 (use papel alumínio para proteger tubos de luz)
   1. Remova a diluição de anticorpos secundários e lave 4x por 15 minutos em PBS/0,05% Interpolação.
   2. Fixar em temperatura ambiente por 20 minutos em 4% de FA.
   3. Lave 1x por 5 minutos em PBS/0,05% Interpol.
   4. Remova PBS/0,05% Interpolação e adicione 1 gota de meio de montagem aquoso a cada tubo de microcentrifusagem. Posicione os tubos verticalmente.
   5. Monte ou armazene a 4 °C protegido da luz até a montagem. Posicione os tubos verticalmente.

10. Montagem de xenoenxertos

NOTA: Proteja os tubos de microcentrifuuagem da luz durante todo o processo. Xenoenxertos de zebrafish são montados entre 2 deslizamentos (24 x 60 mm # 1,5). Isso permite virar os xenerxertos montados durante a imagem confocal para que ambos os lados do tumor (superior e inferior) sejam acessíveis. Não use pipetas plásticas com meio de montagem - os xenoenxertos podem ficar presos na pipeta. Consulte a Figura 7 para obter a representação esquemática das etapas a seguir.

1. Rotule o deslizamento Y e sele as bordas do clipe X com geleia de petróleo ou graxa de silicone para evitar o vazamento da mídia de montagem.
2. Transfira os xenoenxertos com uma pipeta Pasteur de vidro para o deslizamento X.
3. Alinhe-os cuidadosamente com um grampo de cabelo e remova o excesso de mídia de montagem aquosa.
4. Adicione mídia de montagem aquosa ao coverlip Y.
5. Coloque cuidadosamente o deslizamento Y em cima do deslizamento X. Não pressione as tampas, pois isso pode potencialmente interromper os xenoenxertos.
6. Coloque as tampas montadas em cima de um slide de microscópio e fixe-as com fita adesiva transparente. Isso permite uma manipulação mais fácil para imagens e armazenamento confocal.

11. Imagem confocal

NOTA: Uma lente objetiva de imersão apoquiromática de 25x com correção de água é ideal para imagens de tumores PVS com resolução de célula única (ver Figura 8C-C" e Figura 9A, por exemplo).

1. Adquira amostras utilizando a função z-stack com um intervalo de 5μm entre cada fatia. Para imagens voltadas à reconstrução 3D, em embarcações, utilize um intervalo de 1-3μm entre as fatias(Figura 8A).

12. Análise e quantificação

1. Use o software FIJI/ImageJ ou similar para processamento e análise de imagens confocal.
2. Abra os dados brutos (.czi, .lsm, etc) no software FIJI.
3. Para selecionar todos ou apenas um único canal no modo composto, clique em: Imagem > Cores > Ferramenta de canais.
4. Para ajustar os níveis de brilho e contraste, clique em: Imagem > Ajustar > Equilíbrio de Cores.
5. Para quantificar o tamanho do tumor
   1. Selecione três fatias representativas do tumor, de cima, médio e inferior, por pilha de z por xenoenxerto(Figura 8 A).
      NOTA: A resolução confocal alcança ~60-70 μm de profundidade tumoral. Se o tumor for grande, pode não ser possível imaginar seu volume total.
   2. Abra uma planilha para anotar os dados.
   3. Conte todos os núcleos DAPI que correspondem às células tumorais nas 3 fatias selecionadas(Figura 8 A, B). Para fazê-lo:
      1. Abra o plugin do contador de células do FIJI/ImageJ clicando em Plugins > Analisar > cell contador.
      2. Na ferramenta de contador de celular, clique em Inicializar,selecione um tipo de contador e clique na imagem para iniciar o modo de contagem manualmente. Para cada clique, o contador adiciona quantas células são contadas (número de cliques).
      3. Depois de contar uma fatia completa, salve o número do celular no documento de excel correspondente.
      4. De volta a Fiji, clique em Redefinir da janela Contador de células para excluir as informações se o mesmo contador for usado. Caso contrário, as informações podem ser mantidas, e outros contadores podem ser usados com outras fatias (ou células).
      5. Mova-se para a segunda fatia representativa e repita as etapas anteriores. Reúna todos os dados.
         NOTA: A contra-retenção de DAPI é comumente usada para contar números de células devido à definição clara de células individuais, no entanto, outras manchas específicas de células podem ser usadas.
   4. Para obter o número total de células no tumor use a seguinte fórmula:
      
      NOTA: O número de correção de 1,5 foi estimado para células com diâmetro médio do núcleo de ~10-12 μm. Essa correção pode precisar de ajuste se as células forem maiores/menores. Consulte Dicussion para obter mais detalhes sobre este método.
6. Para quantificar outros marcadores (células imunes, figuras mitóticas, PPH3, Caspase3 ativado, Ki67, etc.), quantificar todas as fatias usando o mesmo plugin (ver Figura 8C-C'' para visualização de figuras mitóticas). Divida o número total de células contadas pelo tamanho correspondente do tumor e multiplique por 100 para obter a porcentagem.
   NOTA: Cuidado que algumas células estarão localizadas entre duas fatias, vão e voltam na pilha z para garantir que uma célula não esteja sendo contada duas vezes.

Resultados

Xenoenxerto de zebrafish como uma ferramenta para estudar terapias anticâncgenos.
A linha de células cancerígenas colorretais HCT116 foi rotulada com CM-DiI e injetada nos embriões de 2 dias pós-fertilização (dpf). Após a injeção, os xenoenxertos foram incubados a 34 °C, temperatura que permite o crescimento de células tumorais sem comprometer o desenvolvimento de zebrafish. No dia seguinte, os xenoenxertos foram examinados de acordo com a presença ou ausência de uma massa tumoral no PVS (zebrafish não injetado adequadamente foram descartados e eutanizados) (Figura 6A-A''). Os xenoenxertos foram agrupados de acordo com o tamanho do tumor (Figura 6B-B'') e distribuídos aleatoriamente (em uma placa de 6 poços: ~12 xenoenxertos por poço) em controles não tratados e quimioterapia FOLFIRI (ácido foliônico de 0,18 mM, 0,08 mM Irinotecan e 4,2 mM Fluorouracil (5-FU)).

Controle E3 e drogas foram substituídos diariamente, e zebrafish mortos descartados. 4 dpi, e três dias de pós-tratamento (dpt), o engraftment foi quantificado como na etapa 8.2 do protocolo. O engrafamento é considerado como a frequência de xenoenxertos que apresentam uma massa tumoral no PVS a 4 dpi. Por exemplo, se no final do experimento há 40 larvas vivas e 35 das 40 apresentam um tumor no PVS, a taxa de enenxerção é de 87,5%. Os xenoenxertos foram eutanizados e fixados para avaliar o tamanho do tumor e apoptose por imunofluorescência e microscopia confocal.

A imunofluorescência foi realizada para detectar células apoptóticas, utilizando anticorpos Caspase 3 anti-fisado (Asp175) (coelho, 1:100, #CST 9661) e DAPI (50 μg/mL) para contra-retenção de núcleos. Os conjuntos de dados da pilha de imagens (a cada 5um) foram adquiridos em um microscópio confocal LSM710 e análise de dados realizada com o software FIJI/ImageJ, conforme explicado na etapa 12. Quantificação do índice mitótico, apoptose (% do Caspase 3 Ativado) e tamanho do tumor, revelou que o FOLFIRI induz uma diminuição significativa da mitose (Mann Whitney Test, P<0.0001) e uma indução significativa da apoptose (teste de Mann Whitney, P<0,0001), acompanhada de uma redução de 54% do tamanho do tumor (P<0.001) (Figura 8C-E, Figura 9A-E)

Essas características são úteis em telas de medicamentos fenotípicos de alto rendimento, bem como para testar os efeitos intrínsecos e fisiológicos de várias tratamentos de câncer em um curto espaço de tempo.

Caracterização de xenoenxertos de xenógrafos humanos-zebrafish com anticorpos específicos do homem
Como em todos os modelos de xenoenxerto, há o risco de identificar mal as células. Por exemplo, macrófagos podem fagocitar células cancerígenas humanas, tornando-se rotulados com o corante lipofílico, e depois viajar ao longo do hospedeiro de zebrafish e, assim, essas células podem ser confundidas com micrometastase tumoral. Portanto, rotular xenóxertos com anticorpos humanos específicos, como HLA humana, ki-67 ou mitocôndrias humanas (hMITO) é crucial para a caracterização inicial e também para se familiarizar com a morfologia das células tumorais(Figura 9F-I).

Xenoenxerto de zebrafish para estudar interações célula-células.
Outra grande vantagem do modelo de xenoenxerto de zebrafish é que é possível estudar as interações de diferentes células tumorais e analisar como cada tipo de célula pode influenciar o comportamento do outro. Diferentes células cancerígenas humanas (clones diferentes do mesmo tumor ou de tumores diferentes) podem ser co-injetadas. Neste exemplo, duas linhas celulares CRC derivadas do mesmo paciente foram rotuladas com diferentes corantes lipofílicos e misturadas em uma razão de 1:1 para injeção(Figura 9J-K').

Ao misturar linhas celulares humanas (para gerar tumores policlonais) no mesmo enxerto, evite usar o corante DiO, pois isso resulta em coloração dupla não específica(Tabela 2). Em vez disso, use, por exemplo, CM-DiI (linha celular#1) com CMFDA verde (linha celular#2), ou CM-DiI (linha celular#1) com vermelho profundo (linha celular#2)(Tabela 2, Figura 9J-K'), para obter uma discriminação fácil das populações no final do experimento. Para quantificar a frequência de cada clone dentro do tumor, use 2 tipos diferentes de contador em FIJI para identificar cada clone e, em seguida, dividir pelo número total de células (soma de todos os clones) para obter a fração relativa de cada um (%).

Figura 1. Resumo do fluxograma do protocolo de xenoenxerto de zebrafish Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Materiais para injeção de embrião de zebrafish: A. Agulha borossilicada B. 2% placa de Agarose. C Alça de grampo d. Passos para fazer um laço de grampo: 1. Coloque 1 cabelo dentro de um tubo capilar de vidro deixando aproximadamente 1 centímetro de cabelo fora do tubo. 2-3. Enrole a ponta externa do cabelo com a ajuda de fórceps no tubo capilar de vidro formando um laço de ~0,5 mm de comprimento. 4. Sele a borda do tubo capilar com uma gota de esmalte. 5-6. Selar um pedaço de fita elétrica ao redor do capilar para protegê-lo de quebrar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Imagens estereómicas representativas de embriões de zebrafish a 48 horas após a fertilização (48 hpf): A-A'. Morfologia normal de um embrião de zebrafish a 48 hpf de desenvolvimento, pronto para microinjeção B-B'. A morfologia de um embrião de zebrafish que não alcançou o estágio de desenvolvimento adequado para microinjeções a 48 hpf e apresenta já algum grau de edema cardíaco (ponta da flecha preta) e gema distendida. A' e B' são ampliações de A e B, respectivamente. As barras de escala representam 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Representação esquemática da placa de microinjeção de zebrafish configurada: A. Alinhamento de embriões anestesiados em 3% Agar/2% placa de Agarose. B. Representação gráfica de um embrião de zebrafish pós-fertilização de 2 dias, com uma seta preta indicando o espaço perivitelline (PVS). C e D. As células cancerígenas podem ser injetadas com diferentes ângulos no PVS injetado no espaço perivitelino (PVS) de um embrião pós-fertilização de 48 horas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Ensaio metastático. 1 hora de injeção pós-injeção (1hpi) os embriões injetados são classificados de acordo com a ausência (NO_circ) ou presença (CIRC) de células tumorais em circulação. Aos 4 dias após a injeção, o número de xenoenxertos em ambos os grupos que apresentam micrometastase são quantificados. As células do(A) NO_circ grupo tiveram que submeter todas as etapas metastáticas para poder formar uma micrometastase, enquanto as células do grupo CIRC(B)só passam pelas últimas etapas da cascata metastática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Imagens de estereótipo fluorescente representativo de xenertos a 1 dia após a injeção e 4 dias após a injeção. Células cancerígenas humanas expressando proteína fluorescente TdTomato (vermelho) foram microinjetadas em 2 embriões de zebrafish dpf. A 1 dpi, trie os embriões injetados e descarte os mal injetados ou embriões com um edema (A-A'') classificar os embriões bem injetados de acordo com os tamanhos do tumor(B-B'). C. Quantificação representativa do número total de células presentes nas diferentes categorias de tamanho do tumor em 1 dpi em xenoenxertos SW620. Cada ponto representa um xenoenxerto quantificado como explicado na seção 12.At 4 dpi, tela as larvas e quantificar as diferentes classes: sem tumor (D); com tumor no PVS(E)e com micrometastase no CHT(F). As barras de escala representam 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Representação esquemática da montagem de xenoenxerto para imagens confocal. 1. Exemplo de rotulagem na tampa Y, linha azul claro no deslizamento X representa o perímetro em que a geleia de petróleo/graxa de silicone é aplicada para evitar vazamento da mídia de montagem. 2. Exemplos de alinhamento de xenoenxerto no deslizamento X para imagem confocal. 3. A mídia de montagem aquosa (seta azul) é usada para ligar o deslizamento de cobertura Y em cima do deslizamento X. 4. Exemplo de tampas devidamente montadas. 5. As manchas são então colocadas em cima de um escorregador de vidro e fixadas com fita transparente. 6. Xenoenxertos montados prontos para imagens confocal. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Representação visual da quantificação de imagem do microscópio confocal do tamanho do tumor. Imagens confocal de um xenerto HCT116 a 4 dias após a injeção A. Série de fatias de pilha de z no canal DAPI adquiridas com um intervalo de 5 μm. Linhas tracejadas vermelhas circulam as três fatias representativas usadas para a contagem de células. B. Ilustração da quantificação dos núcleos DAPI com o software Cell Counter Plugin in ImageJ/Fiji. C-E. Exemplo de resolução celular única dentro do tumor no qual é possível visualizar/quantificar figuras mitóticas em DAPI ou usar um anticorpo H3 fosfo-histona (verde). D e E são ampliações de C. As barras de escala representam 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9. Resultados representativos. A-E. A linha de células cancerígenas colorretal HCT116 foi rotulada com Vybrant CM-DiI e injetada no PVS de 2 dias após a fertilização (dpf). Após a injeção, os xenoenxertos foram incubados a 34 °C. Em 1 dpi, os xenoenxertos foram examinados e distribuídos aleatoriamente em controles não tratados e FOLFIRI, tratados por 3 dias consecutivos e fixados em 4 dpi. A. A Imunofluorescência foi realizada para detectar células apoptóticas, utilizando anticorpos Caspase 3 anti-fisado e DAPI para contra-retenção de núcleos. Quantificação do índice mitótico C, apoptose (% de Caspase3 Ativado) D, e tamanho do tumor E, revelou que folfiri induz uma diminuição significativa da mitose (Mann Whitney Test, P<0.0001) e uma indução significativa da apoptose (teste de Mann Whitney, P<0.0001), acompanhada de uma redução de 54% do tamanho do tumor (P<0,001). O número de xenoenxertos analisados é indicado na figura e cada ponto representa um xenoenxerto. F-H. Imagens representativas de xenoenxertos de câncer colorretal aos 4 dias após a injeção rotuladas com marcadores específicos humanos em verde (HLA humano, ki67 e hMITO) no PVS e CHT I. J-J'. Imagens confocal de xenoenxertos policlonais, injetadas com duas diferentes linhas de células cancerígenas colorretais humanas rotuladas com coloração lipofílica CellTracker Deep Red (Cy5 - branco), CellTracker Green CMFDA (488 - verde) e contra-retenção da DAPI. K-K'. Imagens confocal de duas diferentes linhas de células cancerígenas colorretais humanas rotuladas com coloração lipofílica CellTracker Deep Red (Cy5 - branco), Vybrant CM DiI (594 - vermelho) e contra-retenção da DAPI. As barras de escala representam 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Linha celular

tecido

espécie

morfologia

Modo de crescimento

Confluência ideal para injeção

Agente dissociante para injeção

Tempo de dissociação

Protocolo para rotulagem

Meio de injeção

Divida o número total de células por (para alcançar a concentração ideal para injeção)

SW480

Adenocarcinoma colorretal (primário)

humano

epitelial

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

frasco

PBS 1x

0,25

SW620

Adenocarcinoma colorretal (metástase)

humano

epitelial

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

frasco

PBS 1x

0,25

HCT116

Carcinoma colorretal (primário), mutante de Kras

humano

epitelial

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

frasco

PBS 1x

0,25

HKE3

Carcinoma colorretal, Kras WT

humano

epitelial

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

frasco

PBS 1x

0,25

HT-29

Adenocarcinoma colorretal (primário)

humano

epitelial

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

frasco

PBS 1x

0,2

CACO-2

Adenocarcinoma colorretal (primário)

humano

epitelial

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

Meio completo

0,25

MCF-7

Adenocarcinoma mamário (metástase)

humano

epitelial

aderente

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

60% FBS + 40% meio completo

0,5

Hs578T

Carcinoma mamário (primário)

humano

epitelial

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

2 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

60% FBS + 40% meio completo

0,5

MDA-MB-468

Adenocarcinoma mamário (metástase)

humano

epitelial

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

8 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

60% FBS + 40% meio completo

0,5

MDA-MB-231

Adenocarcinoma mamário (metástase)

humano

epitelial

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

Meio completo

0,5

RT112

Carcinoma de células transitórias da bexiga urinária (primário)

humano

epitelial

aderente

85% - 90%

TrypLE

6 minutos + raspador de células

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

Meio completo

0,5

BFTC905

Carcinoma de células transitórias da bexiga urinária (primário)

humano

epitelial

aderente

75% - 85%

TrypLE

10 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

80% médio completo + 20% PBS/EDTA 2 mM

0,5

J82

Carcinoma de células transitórias da bexiga urinária (primário)

humano

epitelial

aderente

85% - 90%

TrypLE

10 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

Meio completo

0,5

RT4

Carcinoma de células transitórias da bexiga urinária (primário)

humano

epitelial

aderente

85% - 90%

TrypLE

6 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

Meio completo

0,5

MIA PaCa-2

Carcinoma epitélio pancreático (primário)

humano

epitelial

aderente

80% - 90%

TrypLE

3 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

60% FBS + 40% meio completo

0,5

PANC-1

Carcinoma epitélio pancreático (primário)

humano

epitelial

aderente

80%

TrypLE

5 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

PBS/EDTA 2mM

0,5

VC8

Fibroblastos pulmonares, mutantes BRCA2, deficientes de RH

Hamster chinês

epitelial

aderente

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

Meio completo

0,25

VC8-B2

Fibroblastos pulmonares, BRCA2 humano, BRCA2 -/− Deficientes em RH

Hamster chinês

epitelial

aderente

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL

Meio completo

0,25

Tabela 1: Confluência in vitro ótima para injeção de várias linhas celulares

Corante celular

Número do catálogo

Espectro de fluorescência (Exc. - Em.)

Diluição de estoque

Trabalhando diluição para manchar em um frasco

Diluição de trabalho para manchar em uma microcentrifuuagem de 1,5 mL

Tempo de incubação

Observações

Vybrant CM-DiI

V22888

549 nm - 569 nm

Já diluído

4:1000 em PBS 1x

4:1000 em PBS 1x

15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC

Vybrant DiO

V22886

484 nm - 501 nm

Já diluído

5:1000 em PBS 1x

5:1000 em PBS 1x

15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC

Não é uma boa resolução em imagens confocal em 4 dias após a injeção

CellTracker Vermelho Profundo

C34565

630 nm - 660 nm

1 mM em DMSO

0,5 - 2,5 μM em PBS 1x

0,5 - 2,5 μM em PBS 1x

15 min @ 37 ºC

CellTracker Green CMFDA

C7025

492 nm - 517 nm

10 mM em DMSO

0,5 - 2,5 μM em PBS 1x

0,5 - 2,5 μM em PBS 1x

15 min @ 37 ºC

Produto vaza para a cavidade abdominal 48 horas após a injeção, mas ideal para estudos de co-injeção

Tabela 2: Corante e condições

tamanho	# de larvas	Volume médio E3 1x
100 mm x 15 mm (padrão)	Até 50	20-25 mL
60 mm x 15 mm	Até 20	10 mL
Placa de 6 poços	Até 15 por poço	3-4 mL por poço

Tabela 3: Opções de placa de Petri

E3 médio 50x - estoque	Para 10 litros de água estéril:
	146,9 g de NaCl
	6,3 g de KCL
	24,3 g de CaCl2·2H2O
	40,7 g de MgSO4·7H2O
E3 médio 1x – pronto para usar	400 mL de E3 médio 50x
	60 mL de 0,01% Solução Azul de Metileno
	Encha até 20 litros de água do sistema de peixes
Tricaine 25x – estoque e eutanásia	2 g de pó tricaine
	500 mL de água de osmose reversa
	10 mL de 1 M Tris (pH 9)
	Ajuste para pH 7
Tricaine 1x - Anestesia	20 mL de Tricaine 25x
	Encha até 500 mL de água do sistema
60 mg/mL Pronase - estoque 100x	1 g de pronase
	16,7 mL de água estéril
0,6 mg/mL Pronase – 1x pronto para usar	100 pronase μL 100x
	9,9 mL de E3 médio 1x

Tabela 4: Composições de soluções

Discussão

A crescente importância do zebrafish como modelo para o desenvolvimento do câncer e rastreamento de medicamentos resultou em inúmeras publicações^{3,4,7,13,14,16,18,19,20,21}. No entanto, a injeção de células cancerígenas em embriões de zebrafish é uma técnica que requer um alto nível de destreza que pode ser desafiador para os pesquisadores. Neste protocolo, nosso objetivo é fornecer informações práticas e algumas dicas que podem ajudar a superar os desafios iniciais da criação de xenoenxertos de embrião de zebrafish.

Injeção prévia de manuseio de células
Este protocolo otimizado para a geração de xenoenxertos de zebrafish com linhas celulares pode ser adaptado a vários tipos de células (câncer) com diferentes morfologias. Recomendamos que todas as linhas celulares usadas para xenoenxertos de zebrafish sejam livres de mycoplasma. Ao contrário de outras contaminações bacterianas, a presença de micoplasma na cultura celular não gera alterações que podem ser facilmente detectadas sob o microscópio²². A contaminação por mycoplasma pode afetar o potencial de engrafamento das linhas celulares, sua sensibilidade às drogas, bem como a viabilidade dos embriões de zebrafish.

Embora as células possam continuar a proliferar por um longo período, seu fenótipo e genótipo podem ser propensos a alterações. É importante se familiarizar com a morfologia e o comportamento das linhas celulares na cultura. Recomendamos manter o número de passagens celulares após o descongelamento entre 3-12 para obter resultados reprodutíveis. Assim, devem ser realizados testes regulares de mycoplasma.

As células devem estar em sua fase de registro (fase de crescimento exponencial antes de atingir a confluência ~70%) no dia da injeção. Isso permitirá um enxerto adequado e o desenvolvimento adequado das marcas distintas do tumor. Para evitar a variação do fenótipo das células dentro do xenoenxerto, é fundamental manter a confluência de injeção constante entre os experimentos. O número de células injetadas pode ser adaptado às características de cada linha celular, pois algumas podem exigir maiores densidades de injeção para prosperar nos embriões de zebrafish.

Considerações de rotulagem celular
Para melhor visualizar as células tumorais humanas para injeção e análise futura, as células tumorais podem ser rotuladas com corantes fluorescentes. Devido a diferenças no tamanho celular, o número total de células/cm² em culturas aderentes varia entre as linhas celulares. Isso afetará a eficácia do protocolo de coloração, bem como o número de células colhidas para injeção. Grandes células que produzem números baixos por frasco (ou seja, Hs578T) ou crescem em clusters (ou seja, BFTC905) exigirão a junção de vários frascos para um único experimento. Neste caso, a coloração das células não deve ser realizada diretamente no frasco, pois isso causará o uso de quantidades excessivas de corante (alto custo). Por outro lado, as células altamente sensíveis aos ciclos excessivos de centrifugação, bem como aquelas que produzem números elevados por frasco (ou seja, HCT116) podem ser manchadas diretamente no frasco e, em seguida, destacadas com EDTA/raspador de células (Para obter mais informações ver Tabela 1).

Sempre que possível, em vez de usar uma abordagem enzimática, use EDTA para desprender as células no dia da injeção, para que as células recuperem suas junções célula-células mais rapidamente e sejam submetidas a menos passos de centrifugação. No entanto, se as células são sensíveis ao EDTA, muito aderentes ou crescem em clusters - um método enzimático pode ser aplicado. A otimização da concentração ideal para injeção, bem como o meio de injeção, depende das características de cada linha celular, podendo precisar de alguns ajustes(Tabela 1).

Calibração de microinjeção
Ao contrário da entrega de oligonucleotídeos ou drogas no embrião de zebrafish, uma ralticula não é usada para calibrar a agulha ao trabalhar com linhas celulares para xenertos. Depois de algum tempo durante a injeção, as células começarão a entupir, e é necessário cortar a ponta da agulha para aumentar seu diâmetro ou mudar completamente a agulha. Este procedimento dificulta a calibração do ralticule.

Para resolver esse problema, o número de células dispensadas é regulado pela pressão ejetar e o tempo necessário para atingir um tamanho semelhante ao olho embrião dentro de 1-3 pulsos. Em seguida, para controlar ainda mais o tamanho do tumor, a 1 dpi, os xenoenxertos são classificados de acordo com o tamanho do tumor, como mostrado na Figura 6 B-B". Como representado no exemplo da Figura 6C, esse método de classificação é eficiente na redução da variação dos tamanhos dos tumores: se juntarmos todos (+,+++ o STEV é ~o dobro da classe ++(~906 células para ~422 células) e a variação do coeficiente é ~31,9% em comparação com 14,5% na classe ++. Como a referência para injeção é o volume, o número total de células varia muito entre os tipos de células - sendo dependentes do tamanho e forma das células. Por exemplo, células grandes com muito citoplasma como o câncer de mama Hs578T, produzem tumores muito menores (~600 células). Além disso, cada linha celular requer um número diferente de células. Por exemplo, as linhas de células cancerígenas urinárias HT29 CRC e RT112 mostraram que quanto maior o número de células injetadas, maior a mortalidade por zebrafish. Portanto, um período de otimização durante o desenvolvimento dos xenoenxertos é necessário para testar se a linha celular tem efeitos tóxicos no embrião ou requer densidades mais/menores de injeção.

Local de injeção
Uma das discrepâncias mais comuns na geração de xenoenxertos de embrião de zebrafish é o local da injeção. A gema é geralmente o local de escolha para a injeção devido à sua fácil acessibilidade. No entanto, observamos que as células injetadas na gema têm maior tendência a morrer. Embora tecnicamente mais difícil, recomendamos injetar no PVS e o mais longe possível do coração. Dentro do PVS, as células podem agregar, recrutar vasos e células imunes, e migrar, intravasar, extravasar e formar micrometastase, se apresentarem características metastáticas^8,11.

Eficiência de engraftment
Diferenças na eficiência do enenerxerto e no tamanho do tumor entre as linhas celulares em 4 dpi são esperadas devido aos seus distintos graus de morte/sobrevivência/proliferação celular basal, mas também devido à imunogenicidade inata que cada linha celular pode exibir⁹.

metástase
A metástase compreende uma cascata de eventos que pode ser dividida em duas etapas arbitrárias. No primeiro estágio, as células tumorais têm que se desprender do local primário, migrar e invadir tecidos adjacentes e, em seguida, intravasar para a corrente sanguínea. No segundo estágio, as células tumorais devem sobreviver em circulação, extravasar-se do sangue ou vasos linfáticos, e finalmente colonizar em locais secundários²³. Para distinguir entre esses eventos precoces e tardios e abordar o potencial/proficiência das diferentes células tumorais para realizar essas etapas, projetamos um ensaio simples.

Em geral, quando injetadas no PVS, as células tumorais podem entrar diretamente em circulação e, em seguida, ficar fisicamente presas no tecido hematopoiético caudal (CHT) (região da cauda). No entanto, de acordo com as características de cada célula tumoral - vimos que algumas células tumorais permanecem no CHT 4 dpi e são capazes de formar micrometastase enquanto outras células tumorais desaparecem (limpas após serem pegas no CHT).

Portanto, comparando a eficiência da micrometastase (a 4 dpi) quando as células foram colocadas diretamente em circulação - CIRC (as células só têm que passar pelos passos finais da metástase) vs. quando não - NO CIRC (as células precisam passar por etapas precoces e tardias para serem capazes de formar uma micrometastase) podemos avaliar seu potencial metastático precoce ou tardio. Observamos células tumorais que podem formar micrometastase eficientemente no CHT em ambos os grupos (CIRC e NO CIRC), sugerindo que essas células têm a capacidade de se submeter a todas as etapas da cascata metastática (SW480 e MDA-MB-468, por exemplo)^8,11. Em contraste, outras células tumorais têm um potencial metastático muito baixo em ambos os grupos, quase nunca fazendo micrometastase, mesmo quando injetadas em circulação (ou seja, visíveis no CHT a 24 hpi, mas a 4 dpi elas não estão mais lá, Hs578T por exemplo)⁸. No entanto, encontramos claramente outro grupo - um que só é capaz de formar micrometastase quando injetado em circulação (só podemos observar micrometastase no grupo CIRC). Isso sugere que essas células têm baixa eficiência na realização dos primeiros passos da cascata metastática, mas, por outro lado, são capazes de sobreviver em circulação, extravasar e colonizar um local distante.

Imunostaining e imagem
Antes da fixação, este protocolo de injeção pode ser usado para outras abordagens de imagem ao vivo, como microscopia de contraste de interferência diferencial ao vivo (DIC), microscopia de disco giratório, imagem confocal ao vivo de alta resolução e microscopia de folha de luz, etc.

Células mortas e detritos celulares aparecem brilhantes quando observados através do estereóscópio fluorescente e podem ser confundidos com células vivas, especialmente se o objetivo do estudo é avaliar o potencial metastático das linhas celulares. Gostaríamos de salientar a importância da realização de imagens confocal com marcadores de viabilidade específicos e DAPI para avaliar o estado de sobrevivência do tumor e da micrometastase. Além disso, é fundamental usar anticorpos humanos específicos para detectar células humanas, como mitocôndrias anti-humanas ou HLA anti-humana. Ao implementar o protocolo, treine os olhos experimentador comparando a coloração no estereóscópio com as imagens confocal. Depois de algum tempo, os experimentadores podem distinguir claramente detritos de células vivas no estereóscópio fluorescente.

Embora outros métodos para quantificar a carga tumoral, como toda a área de fluorescência, sejam amplamente utilizados, recomendamos a realização de imunostaining de montagem inteira e imagem confocal como um método mais preciso. Não só a eficiência da coloração lipofílica de corante é muito variável (ou seja, algumas células são muito bem manchadas, enquanto outras não são - provavelmente devido ao conteúdo lipídico de suas membranas), mas também muitas vezes corantes lipofílicos formam agregados, e células mortas tendem a ser mais brilhantes - criando vários artefatos que podem ser confundidos com células vivas.

As células podem ser transduzidas com proteínas fluorescentes para ajudar no seu rastreamento e para pular a rotulagem celular. No entanto, certifique-se de que as células transduzidas e não transduzidas produzam os mesmos resultados nos xenoenxertos de zebrafish.

Além disso, os macrófagos podem fagociar esses detritos celulares fluorescentes tornando-se fluorescentemente rotulados e migrando, gerando falsas células metastáticas positivas. Assim, recomendamos uma série de ferramentas analíticas, que, naturalmente, podem ser estendidas a muitas outras leituras para uma interpretação mais precisa do comportamento tumoral:

• Proliferação - quantificação de figuras mitóticas com anticorpo DAPI ou anti-pHH3^Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),
• Morte celular por apoptose- anticorpo anti-ativado Caspase3^Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) ou equivalente,
• Tamanho do tumor - contagem de DAPI- as células tumorais humanas mostram uma organização de cromatina muito distinta, por isso são facilmente distinguidas das células de zebrafish e é sempre possível verificar novamente com o corante (quando você está treinando seu olho),
• Para estudos metastáticos, para detectar inequivocamente células humanas, - HLA anti-humano (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), mitocôndrias anti-humanas (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).

Para uma aquisição confocal com intervalo de 5 μm entre as fatias na pilha Z das células cancerígenas de controle HCT116 (tamanho nuclear médio de 10-12 μm de diâmetro) com a contra-magem DAPI, observamos que ~50% das células são compartilhadas entre duas fatias consecutivas. Portanto, se cada fatia for contada, há um alto risco de contar as mesmas células duas vezes. Ir e voltar entre fatias para evitar problemas na quantificação resulta em uma técnica demorada e propensa a erros. Para facilitar a quantificação do número total de células e permitir mais reprodutibilidade entre os pesquisadores, criamos a fórmula de tamanho do tumor descrita anteriormente neste protocolo⁸.

Incluímos um número de correção (1,5) para explicar as células ~50% compartilhadas entre as fatias. Descobrimos que o erro médio de contagem manual de todo o tumor entre os pesquisadores foi de 20%. Dois pesquisadores que usaram a fórmula tiveram um erro de 2%. O uso desta fórmula tem uma taxa de precisão de 93% e 98% de taxa de reprodutibilidade. Também testamos métodos automatizados, mas eles demonstraram um erro superior a 50% causado por ajustes de limiar.

Devido às características das células apoptóticas, a quantificação das células Caspase 3 ativadas é mais difícil. Para reduzir o número de erros e a variação dos resultados, recomendamos que o controle e as amostras experimentais sejam contados pelo mesmo pesquisador. Além disso, ao aprender essa técnica, um novo pesquisador deve contar imagens que já foram quantificadas por pesquisadores mais experientes para comparar resultados e treinar.

O comprimento do ensaio pode ser estendido se necessário. No entanto, é importante considerar que as larvas de zebrafish requerem alimentação viva a partir de ~7 dias após a fertilização (5 dias após a injeção). Além disso, as diretrizes e regulamentos de bem-estar animal aplicados às larvas com mais de 6 dias após a fertilização podem variar.

Este protocolo fornece ferramentas úteis para permitir que um único pesquisador injete aproximadamente ~200-300 larvas de zebrafish por hora; e resultados para o ensaio completo, incluindo análise e interpretação estatística, obtidos em três semanas. Esperamos que este protocolo possa ajudar os pesquisadores a se tornarem especialistas na geração de xenoenxertos de zebrafish. Não é fácil; você precisa praticar, mas você vai chegar lá. Boa sorte!

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar para bacteriologia	VWR	97064-336	Placa de ágar
anti-Caspase3Asp175 (Coelho monoclonal)	Cell Signalling Technologies	9661	Anticorpo primário para imunocoloração de montagem total (Diluição 1:100)
HLA anti-humano (Coelho monoclonal)	Abcam EP1395Y	ab52922	Anticorpo primário para imunocoloração de montagem total (Diluição 1:100)
anti- 488 (Coelho monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35552	Anticorpo secundário para imunocoloração de montagem inteira (Diluição 1:200)
anti- 594 (Coelho monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35560	Anticorpo secundário para imunocoloração de montagem inteira (Diluição 1:200)
CellTracker Corante vermelho escuro	ThermoFisher Scientific	C34565	Corante lipofílico (Diluição 1:1000)
CellTracker Corante verde CMFDA	ThermoFisher Scientific	C2925	Corante lipofílico (diluição 1:1000)
Tubo de centrífuga cônico 50mL	VWR	525-0610
Tubo de centrífuga cônico 15mL	VWR	525-0604
DAPI			Contracoloração nuclear e cromossômica
Extrator de micropipeta baseado em laser P-2000	Micropipeta de instrumento		Extrator
de tubo de microcentrífuga 1.5mL	Abdos	P10202
Lâminas de microscópio, borda cortada	RS França	BPB016	Lâminas para montagem
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Meio de montagem
Pneumático Picopump	World Precision Instruments	PV820	Microinjetor
Óculos de cobertura retangulares, Menzel Glä ser	ThermoFisher Scientific	631-9430	Lamínulas para montagem
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004	Placa de ágar
Capilares de vidro de parede fina	World Precision Instruments	TW100-4	Capilares de borossilicato
TrypLE	Gibco	12605036	Solução de desprendimento enzimático
Vaselina			Vaselina para slide selagem
Corante Vybrant CM-DiI	ThermoFisher Scientific	V22888	Corante lipofílico (Diluição 1:1000)
Solução de Marcação de Células Vybrant DiO	ThermoFisher Scientific	V22886	(Diluição 1:1000)
ZEISS Axio Zoom.V16 para Biologia	ZEISS		Microscópio confocal de fluorescência Microscópio de zoom estéreo
Zeiss LSM 710	ZEISS

Sutter Corante Lipofílico