Este estudo descreve como dissecar o saco endolinfático do ouvido interno do camundongo em diferentes idades. O resultado de uma dissecção semelhante é mostrado em um modelo de camundongo Slc26a4-null de aumento do saco endolinfático. Um camundongo transgênico com um repórter fluorescente expresso no saco endolinfático é apresentado como um modelo para visualizar prontamente o saco endolinfático e uma ferramenta educacional.
Artigo de método
Dissecção do saco endolinfático de camundongos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo de modelos de camundongos mutantes de distúrbios auditivos e de equilíbrio humanos desvendou muitas mudanças estruturais e funcionais que podem contribuir para os fenótipos humanos. Embora um progresso importante tenha sido feito na compreensão do desenvolvimento e função do epitélio neurossensorial da cóclea e vestíbula, o conhecimento limitado está disponível sobre o desenvolvimento, composição celular, vias moleculares e características funcionais do saco endolinfático. Isso se deve, em grande parte, à dificuldade de visualização e microdissecação desse tecido, que é um epitélio composto por apenas uma camada celular. O estudo aqui apresentado descreve uma abordagem para acessar e microdissecar o saco endolinfático do ouvido interno de camundongos selvagens em diferentes idades. O resultado de uma dissecção semelhante é mostrado em um modelo de camundongo deficiente em pendrina de alargamento do aqueduto vestibular. Um camundongo transgênico com um saco endolinfático fluorescente é apresentado. Este camundongo repórter pode ser usado para visualizar prontamente o saco endolinfático com dissecção limitada e determinar seu tamanho. Também pode ser usado como uma ferramenta educacional para ensinar como dissecar o saco endolinfático. Esses procedimentos de dissecção devem facilitar a caracterização dessa parte pouco estudada da orelha interna.
Introdução
A orelha interna dos mamíferos é constituída pela cóclea, o sáculo, o utrículo, três canais semicirculares e o saco endolinfático (Figura 1A). Esses órgãos compreendem um epitélio contínuo e cheio de líquido chamado labirinto membranoso, com órgãos adjacentes conectando-se diretamente ou através de pequenas estruturas de canal, como o ducto reuniens, ducto sacular, ducto utricular ou ducto endolinfático. Comparado a outros órgãos do ouvido interno, o saco endolinfático possui características únicas. Primeiro, faltam células epiteliais sensoriais. Em vez disso, o saco endolinfático possui células especializadas para o transporte de íons. Em segundo lugar, embora o labirinto membranoso esteja encerrado no labirinto ósseo, o saco endolinfático é uma exceção, projetando-se parcialmente para fora do osso petroso e para a cavidade intracraniana. Essa morfologia parece ser altamente conservada durante a evolução do ouvido interno. Terceiro, o saco endolinfático é a primeira estrutura a se desenvolver a partir do otocisto em um estágio embrionário inicial antes da formação de outros órgãos. Além disso, várias patologias têm sido associadas a um saco endolinfático aumentado ou a um compartimento endolinfático anormal. A presença de variantes patogênicas no SLC26A4 (também conhecido como gene pendrina) leva a uma forma comparativamente comum de perda auditiva neurossensorial, causada pelo aumento do saco endolinfático associado à presença de um aqueduto vestibular alargado (EVA)1. Quando associada ao bócio, é referida como síndrome de Pendred 2,3. A doença de Ménière também é considerada por alguns como associada à anormalidade do compartimento endolinfático (hidropisia)4. As características únicas do saco endolinfático e as patologias associadas a uma alteração de sua morfologia são consistentes com um papel crítico para o desenvolvimento e manutenção do ouvido interno.
Apesar de sua importância, o conhecimento ainda é limitado quanto ao desenvolvimento, composição celular, vias moleculares e características funcionais do saco endolinfático. Isso se deve, pelo menos em parte, à dificuldade de visualizar e microdissecar esse tecido. O saco endolinfático é uma estrutura em forma de bolsa, composta por uma única camada de células epiteliais, que muitas vezes é translúcida e muito difícil de identificar fora do tecido conjuntivo que o envolve por estereomicroscopia de luz. Embora um pequeno número de pesquisadores tenha desenvolvido técnicas de dissecção de montagem total e publicado seus achados experimentais 5,6,7,8,9,10, não há publicação enfocando os detalhes técnicos desse procedimento.
Neste estudo, são descritas as abordagens de microdissecção desenvolvidas para acessar e isolar o saco endolinfático da orelha interna de camundongos selvagens em diferentes idades, em montagem total. Os resultados de uma dissecção semelhante são mostrados em um modelo de camundongo, sem expressão de SLC26A4, que tem aumento do ducto e saco endolinfático. Uma linhagem de camundongos com um transgene que codifica uma Cre recombinase expressa no saco endolinfático é relatada. Na presença de um repórter fluorescente de expressão de Cre, aqui tdTomato, a fluorescência pode ser usada para visualizar prontamente o saco endolinfático com dissecção limitada e para obter informações sobre seu tamanho. Esta linha de camundongos repórter também pode ser usada como uma ferramenta educacional para praticar e aperfeiçoar dissecções do saco endolinfático. A capacidade de dissecar o tecido do saco endolinfático deve facilitar a caracterização desse componente pouco estudado, mas essencial, da orelha interna.
Protocolo
Todos os experimentos e procedimentos em animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelos Comitês de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e Derrame/Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação (#1264) e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica e Odontológica de Tóquio (A2020-058A).
NOTA: Camundongos C57BL/6J (número de estoque nº 000664), Pds-/-também conhecidos como camundongos Slc26a4-/- (129S-Slc26a4 tm1Egr/AjgJ, nº 018424) 11, B6; Os camundongos CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm 12 e Ai9(LSL-RCL-tdT) (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze, nº 007909)13 estão disponíveis no Laboratório Jackson e mediante solicitação. Todos os procedimentos de genotipagem foram descritos anteriormente. B6; Camundongos CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm previamente retrocruzados com a cepa C57BL/6J por pelo menos cinco gerações, foram criados para experimentos. Animais de ambos os sexos podem ser estudados com esta abordagem sem uma diferença óbvia. O primeiro dia após o acasalamento noturno é contado como dia embrionário 0,5 (E0,5).
1. Colheita e fixação do ouvido interno intacto no crânio
- Eutanasiar animal experimental ou mãe grávida usando um procedimento aprovado institucionalmente, por exemplo, usando inalação de CO2 . Trabalhe sob uma coifa, se possível, para evitar ou minimizar a propagação de alérgenos de camundongos. Depois de verificar a falta de resposta a estímulos dolorosos, como beliscões na pata ou na cauda, decapite o animal. Para uma mãe grávida, a luxação cervical pode ser usada como uma alternativa à decapitação se seus ouvidos internos não forem usados para experimentos adicionais.
- Colha os embriões por laparotomia14 usando uma tesoura de artéria com ponta esférica para proteger os embriões durante o processo. Manipule os embriões usando pinças de anel. Coloque os cornos uterinos em PBS a 4 ° C no gelo e isole cada embrião conforme descrito anteriormente15 antes de decapitá-los.
- Dividir a cabeça de trás para a frente: primeiro incise o topo da cabeça fazendo primeiro uma incisão na pele, depois no topo do crânio, incisando cerca de um terço a cada corte para que não haja flexão do crânio. Em seguida, corte a parte inferior do crânio de uma vez.
NOTA: Para embriões, recomenda-se o uso de uma lâmina afiada, em vez de tesoura. É fundamental que, em todas as idades, o crânio não seja deformado ao dividi-lo. - Sem tocar ou dobrar o crânio, remova cuidadosamente o hemicérebro para revelar o labirinto ósseo (Figura 1B, Figura Suplementar 1A-B).
- Para camundongos pós-natal dia 5 ou mais, corte o canal auditivo externo e puxe a pele para frente em direção ao nariz. Apare o crânio ao redor do ouvido interno (Figura Suplementar 1C).
- Transferir os dois hemicrânios de cada animal com a orelha interna, o mais intacta possível, para um frasco ou tubo de vidro contendo 10 ml de paraformaldeído (PFA) a 4 °C a 4% diluído em 1x PBS e manter em gelo sob uma hotte.
NOTA: Não tente remover o ouvido interno do crânio nesta etapa, pois isso pode danificar o ducto endolinfático e o saco ao fazê-lo. - Incubar durante 1 h a 4 °C num agitador de balanço. Se estiver trabalhando com tecido de um animal com um repórter fluorescente, mantenha o tubo contendo a amostra em papel alumínio ou em uma caixa para minimizar a exposição à luz.
NOTA: Se estiver interessado em estudar microtúbulos e moléculas associadas, a fixação do tecido deve ser realizada à temperatura ambiente (RT) com fixador RT. - Descarte o PFA em um recipiente apropriado em uma capela de exaustão. Lave três vezes com 10 mL de 1x PBS por 15 min de cada vez em um agitador de balanço em RT para eliminar o fixador antes da dissecção.
2. Microdissecção do saco endolinfático
- Transfira cada preparação da orelha interna para uma placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 1x PBS.
- Coloque a preparação no prato de forma que a raiz do 8º nervo craniano fique orientada para cima. Mantenha o tecido nesta posição segurando a cóclea com uma pinça #4 (Figura 1C).
- Identifique pontos de referência importantes: o aqueduto vestibular, os canais semicirculares anterior e posterior, a cruz comum e o seio sigmóide (veia) (Figura 1D).
NOTA: O saco endolinfático no camundongo do tipo selvagem é translúcido e difícil de visualizar. Para uma microdissecção bem-sucedida do saco endolinfático, é importante entender sua anatomia e localização (Figura 1E). - Incisar a dura-máter e o aqueduto vestibular, bem como os tecidos conjuntivos subjacentes ao redor do saco endolinfático, usando uma agulha de 27 G em uma seringa de 1 mL (Figura 1D, F).
NOTA: Para um camundongo adulto, a descalcificação da preparação com EDTA a 10% (pH 7,4) antes da microdissecção é útil, mas não essencial, para facilitar a incisão do aqueduto vestibular. Para a dissecção do saco endolinfático aberto mais antigo que o 5º dia pós-natal, recomenda-se posicionar a linha de incisão no aqueduto vestibular ligeiramente anterior para fazer uma incisão no lúmen do saco endolinfático (Figura 2A). - Segure o tecido conjuntivo localizado lateralmente ao saco endolinfático com uma pinça e puxe o tecido para cima para retirá-lo do osso temporal (Figura 1G).
- Remova cuidadosamente todos os detritos restantes. A preparação geralmente inclui o epitélio do saco endolinfático, os tecidos conjuntivos circundantes, uma porção do aqueduto vestibular e o seio sigmóide (Figura 1H-I). Se necessário, separe o epitélio do saco endolinfático dos tecidos circundantes (Figura 1J).
- (Opcional) Para a dissecção do saco endolinfático aberto, segure a parte do caule da preparação de forma que a seção transversal do lúmen possa ser observada. Insira uma agulha de 27 G no lúmen e mova-a para cortar o saco endolinfático em duas folhas (Figura 2B-C). Segure a borda de cada tecido em forma de folha com uma pinça e separe-os um do outro (Figura 2D-F).
3. Imuno-histoquímica
- Após a microdissecção, use uma pinça # 5 para transferir os sacos endolinfáticos para uma placa de vidro pontual de 9 poços.
- Usando o microscópio para garantir que os sacos endolinfáticos permaneçam intocados, use uma pipeta de 200 μL para remover todos os 1x PBS, exceto uma gota contendo o tecido. Adicione 200 μL de solução permeabilizante e bloqueadora (1x PBS com 0,15% de Triton X-100 (PBS-TX) e 5% de albumina de soro bovino (BSA)) e incube por 1 h em RT em um agitador orbital.
- Depois de remover toda a solução de bloqueio, exceto uma gota contendo o tecido, adicione 200 μL de anticorpos primários e incube durante a noite a 4 °C. Anticorpos antipendrina6 diluídos a 1:1000 em solução de bloqueio podem ser usados para identificar as células ricas em mitocôndrias do saco endolinfático, embora uma expressão fraca também seja observada em um subconjunto de células ricas em ribossomos16 (Figura 5).
- Após três lavagens em 1x PBS por 15 min em RT, incubar com anticorpos secundários. Para a rotulagem aqui apresentada, incubar 200 μL de anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente, diluídos do estoque comercial a 1:500 em solução de bloqueio, com o tecido em uma plataforma de balanço por 1 h em RT no escuro. A faloidina conjugada com corante fluorescente, que reconhece a β-actina (ACTB), pode ser usada para destacar a presença do saco e ducto endolinfáticos, bem como do tecido conjuntivo ao redor deles (Figura 5A, C, FG).
- Monte os sacos endolinfáticos entre uma lâmina de vidro e uma lamínula usando um meio de montagem antidesbotamento com DAPI. Depois de deixar as lâminas secarem protegidas da luz por 1 h em RT, aplique esmalte transparente na junção entre a lamínula e a lâmina de vidro para selá-las e limitar a formação de bolhas de ar. Se estiver tentando visualizar a distribuição diferencial de proteínas na superfície apical versus basolateral das células epiteliais, recomenda-se abrir o saco durante a etapa de montagem, incisando uma borda e abrindo-a.
- Imagem usando um microscópio confocal. Primeiro, visualize as preparações do saco endolinfático com um objetivo de 10x para fornecer uma visão global da marcação do saco (Figura 5A-D). Em seguida, use uma objetiva de 63x para obter uma visão detalhada da distribuição da proteína de interesse nas células ricas em mitocôndrias e ribossomos do saco endolinfático (Figura 5F-G).
Resultados
Cada etapa desta microdissecção de um saco endolinfático do tipo selvagem de um camundongo pós-natal dia 5 (P5) é detalhada no vídeo associado e instantâneos das principais etapas desta dissecção e abertura do saco endolinfático são apresentados na Figura 1 e Figura 2.
Os resultados representativos das dissecções do saco endolinfático com fluorescência tdTomato no dia embrionário 16,5 (E16.5), P5 e P30, seguindo este protocolo, são apresentados na Figura 3 e na Figura Suplementar 1 e na Figura Suplementar 2. Usando um microscópio de dissecção com fluorescência, o saco endolinfático pode ser facilmente visualizado no crânio após a remoção do cérebro em camundongos portadores do transgene Tg (ATP6V1B1-Cre) na presença do repórter da expressão de Cre: Ai9 (LSL-RCL-tdT) (ver Figura 3A-B e Figura Suplementar 1 para imagens capturadas em luz incidente e fluorescência tdTomato do saco endolinfático em diferentes estágios da dissecção). Nesses camundongos, Cre é expresso como um mosaico em células ao longo do saco e ducto endolinfático (Figura 3, ver também Figura Suplementar 2 para visualização do saco endolinfático com versus sem repórter fluorescente). Embora a expressão deste repórter não seja específica para a expressão endógena de Atp6v1b1, que é restrita às células ricas em mitocôndrias do saco endolinfático16, um dos dois tipos celulares desse epitélio (Figura 5E), é um auxílio útil para identificar e dissecar o saco endolinfático.
As orelhas internas dissecadas de um modelo de camundongo para ampliação do aqueduto vestibular são apresentadas na Figura 4. Em comparação com os irmãos de ninhada de controle, os sacos endolinfáticos e ductos de camundongos deficientes para SLC26A4 (pendrina) estão aumentados.
Imagens representativas da imuno-histoquímica do saco endolinfático íntegro com e sem tecido conjuntivo são mostradas na Figura 5. Resultados de imuno-histoquímica do saco endolinfático aberto de um camundongo P5 selvagem também são apresentados (Figura 5F-G). O saco endolinfático é composto por uma única camada de epitélio dobrada em uma estrutura em forma de bolsa, contendo em seu lúmen endolinfa. Este epitélio consiste em dois tipos de células, células ricas em mitocôndrias e células ricas em ribossomos (Figura 5E). Um saco endolinfático de montagem total será achatado porque a endolinfa não está mais presente. O saco aparecerá como duas camadas entrelaçadas de epitélio, dificultando a determinação da localização subcelular das proteínas expressas neste epitélio. Ao abrir o saco endolinfático, o epitélio de camada única pode ser facilmente visualizado e a distribuição relativa das proteínas de interesse, em relação ao lúmen do saco endolinfático, pode ser determinada de forma mais definitiva. Um potencial enriquecimento apical (luminal, onde estaria a endolinfa) versus basal dessas proteínas pode ser determinado com mais precisão. Por exemplo, SLC26A4 é enriquecido no lado apical das células ricas em mitocôndrias (Figura 5F).
Figura 1. Dissecção total do saco endolinfático de um camundongo selvagem no dia 5 pós-natal (P5).
(A) Esquema do labirinto membranoso de um ouvido interno de camundongo desenvolvido (direita). A localização do saco endolinfático e as estruturas da cóclea e vestibular são indicadas. Essa figura foi modificada de Honda et al.16.
(B) Corte sagital médio mostrando o hemicrânio esquerdo. A localização do saco endolinfático é indicada (seta). (O, occipital; F, frontal)
(C) Cápsula ótica junto com a parte escamosa do osso temporal.
(D) Marcos importantes sobrepostos à caixa pontilhada no painel C. (ES, saco endolinfático; DE, ducto endolinfático; VA, aqueduto vestibular; ASC, canal semicircular anterior; CEP, canal semicircular posterior; CC, crus comuns; SS, seio sigmóide)
(E) Ilustração esquemática da seção transversal junto com a linha branca contínua no painel D através do saco endolinfático. O lado proximal do saco endolinfático é coberto por um canal ósseo chamado aqueduto vestibular, juntamente com o ducto endolinfático. No lado distal, o saco endolinfático, circundado por tecido conjuntivo (TC), estende-se e projeta-se para fora do labirinto ósseo e é imprensado entre a dura-máter (DM) e o seio sigmóide com a parte escamosa do osso temporal (TB).
(F) Uma agulha fina é usada para cortar ao redor do saco endolinfático (seguindo as linhas amarelas pontilhadas no painel D).
(G) A preparação é cuidadosamente removida do osso temporal, mantendo o tecido na posição mostrada pelo asterisco (*, também mostrado no painel E) e descascando-o.
(H) Um saco endolinfático inteiro isolado com tecidos circundantes.
(I) Versão esquemática deste saco endolinfático isolado com tecidos circundantes.
(J) Saco endolinfático isolado sem tecidos circundantes.
Barras de escala: 2 mm (B), 1 mm (J). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Dissecção do saco endolinfático aberto de um camundongo P5 selvagem.
(A) Na etapa 2.4, a linha de incisão no aqueduto vestibular é posicionada ligeiramente anterior (linha pontilhada vermelha) para fazer uma incisão no lúmen do saco endolinfático.
(B) Segure a parte da haste da preparação, insira uma agulha de calibre 27 no lúmen e mova-a para cortar o saco endolinfático em duas folhas.
(C) Ilustração esquemática do painel B.
(D) Segure a borda de cada folha com uma pinça e separe-as umas das outras.
(E) Ilustração esquemática do painel D.
(F) O saco endolinfático é separado em duas folhas, incluindo o epitélio e os tecidos circundantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Dissecção de R26LSL-RCL-tdT/+; Saco endolinfático de camundongo Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn em E16.5, P5 e P30. Todas as imagens apresentadas mostram a fluorescência do tdTomato obtida usando um estereomicroscópio com uma objetiva de 1 x equipada para detecção de fluorescência do tdTomato.
(A, B) Corte sagital médio do crânio de um E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg (ATP6V1B1-Cre) 1Rnel / Mn camundongo antes (A) e depois (B) da remoção do meio encéfalo. tdA fluorescência do tomate descreve a posição do ouvido interno. O saco endolinfático é facilmente visível mesmo sem dissecção (cabeça de seta).
(C, E, G) Orelhas internas isoladas de camundongos E16.5, P5 e P30, respectivamente.
(D, F e H) Imagens de maior ampliação dos sacos e ductos endolinfáticos microdissecados correspondentes. Em P30, o ducto endolinfático é encapsulado em osso, tornando-o particularmente difícil de isolar. Barras de escala: 2 mm (A, B, C, E, G), 500 μm (D, F, H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Anatomia macroscópica da cápsula ótica com saco endolinfático aumentado. Orelhas internas de irmãos de ninhada de camundongos Slc26a4+/- (esquerda) e Slc26a4-/- (direita) em P105. O aqueduto vestibular e o saco e ducto endolinfático (linhas pontilhadas pretas) são aumentados no camundongo Slc26a4-/- em comparação com os de um camundongo Slc26a4+/- . Barra de escala: 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. SLC26A4 expressão de células ricas em mitocôndrias no epitélio do saco endolinfático em E16.5 e P5.
(A, B) Saco endolinfático isolado de camundongo E16.5 marcado com anticorpo anti-SLC26A4 (verde) e faloidina que marca β-actina (ACTB, vermelho).
(C) Uma imagem de baixa ampliação do saco endolinfático aberto do camundongo P5 marcado com um anticorpo anti-SLC26A4 (verde). A faloidina (ACTB, vermelho) pode ser usada para destacar a presença do saco endolinfático, bem como do tecido conjuntivo ao seu redor.
(D) Saco endolinfático isolado marcado com um anticorpo anti-SLC26A4 (verde).
(E) Ilustração esquemática do epitélio do saco endolinfático destacando a presença de dois tipos de células: as células ricas em mitocôndrias, cuja superfície apical é coberta por microvilosidades, e as células ricas em ribossomos.
(F-G) Imagens de alta ampliação do epitélio do saco endolinfático em P5, após a abertura do saco endolinfático e marcada com um anticorpo anti-SLC26A4 (verde) e faloidina (ACTB, vermelho). Uma imagem representativa no nível da membrana apical é mostrada em G, e uma seção transversal reconstruída da pilha z no nível da linha branca pontilhada é mostrada em F. O núcleo das células é marcado com DAPI (azul).
Barras de escala: 100 μm (A, B); 200 μm (C, D) ; 20 μm (F, G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1. Imagens de fluorescência de luz incidente e tdTomato correspondente de um P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Orelha interna de camundongo Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn em três etapas da dissecção. O saco e o ducto endolinfáticos podem ser facilmente visualizados usando a fluorescência tdTomato.
(AB) Região do ouvido interno na parte posterior de um meio crânio intacto de um P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Camundongo Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn.
(CD) A retirada da pele e parte do crânio permite uma melhor visualização da região do saco endolinfático.
(E, F) Orelha interna isolada com o saco endolinfático ainda associado ao tecido conjuntivo.
(A, C, E) Imagens capturadas na luz incidente. (B, D, F) tdFluorescência do tomate do tecido correspondente. Barras de escala: 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2. Comparação da fluorescência de sacos endolinfáticos isolados de R26LSL-RCL-tdT/+; Camundongos Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn e R26LSL-RCL-tdT/+ irmãos de ninhada em E16.5 e P5. A fluorescência do tomate facilita muito o reconhecimento do saco e ducto endolinfático.
(AC) Sacos endolinfáticos microdissecados de E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) e R26LSL-RCL-tdT/+ camundongos irmãos de ninhada (B, C).
(D-F) Sacos endolinfáticos microdissecados de P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) e R26LSL-RCL-tdT/+ camundongos irmãos de ninhada (E, F).
(A, B, D, E) tdFluorescência do tomate. (C, F) Imagens de luz incidente correspondentes a B e E. Barras de escala: 500 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Muitos pesquisadores usaram cortes embebidos em parafina ou congelados para estudos morfológicos do saco endolinfático. A desvantagem das preparações seccionadas é que pode ser difícil observar completamente os complicados contatos célula a célula porque o tamanho e a forma de cada célula epitelial no saco endolinfático são extremamente variáveis, formando uma camada celular enrugada e pseudoestratificada. A imunocoloração de montagem total e a imagem z-stack, descritas neste protocolo, permitem uma melhor visualização da estrutura tridimensional do saco endolinfático.
Para uma microdissecção bem-sucedida, o ponto crítico é visualizar mentalmente todo o contorno do saco endolinfático, mesmo que seja invisível no camundongo selvagem. A observação do repórter fluorescente mostrado na Figura 3 e na Figura Suplementar 1-2 pode ser útil para reconhecer a localização e o tamanho do saco endolinfático em camundongos.
Embora este método de dissecção de montagem total tenha sido usado para imunocoloração no protocolo acima, esta técnica também pode ser usada para colher tecido do saco endolinfático para análise de expressão gênica, como RT-qPCR, expressão de microarray e até RNA-seq de célula única. Os resultados da análise de RNA-seq de célula única usando tecido preparado com este protocolo foram relatados anteriormente16. Para análise da expressão gênica de células epiteliais do saco endolinfático, é preferível coletar epitélio isolado para que não haja contaminação com outros tecidos adjacentes. Embora o saco endolinfático embrionário possa ser separado dos tecidos conjuntivos adjacentes, é muito mais difícil de fazer em idades posteriores. Para amostras de camundongos mais velhos, a incubação com colagenase / dispase por 5 min a 37 ° C é incentivada e facilita o isolamento do epitélio do saco endolinfático.
Uma das desvantagens da imunocoloração de montagem total descrita neste protocolo é que a estrutura tridimensional original pode ser afetada por trauma durante a dissecção ou montagem da preparação entre a lâmina de vidro e a lamínula. É necessário cuidado para evitar artefatos devido à manipulação.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, NIDCD (NIH Intramural Research Funds Z01-DC000060 e ZIC DC000081 ao Advanced Imaging Core). Somos gratos aos Drs. Raoul D. Nelson e R. Lance Miller (Universidade de Utah, Salt Lake City, UT) e Dra. Susan Wall (Escola de Medicina da Universidade Emory, Atlanta, GA) por compartilhar os camundongos Tg (ATP6V1B1-Cre) e à equipe do biotério do NIDCD por cuidar de nossos animais. Expressamos nossa gratidão à Dra. Philine Wangeman pela bela ilustração do ouvido interno. Agradecemos aos Drs. Thomas B. Friedman e Robert J. Morell pela revisão crítica deste manuscrito.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| EDTA 0.5 M | Crystalgen | 221-057 | |
| Seringa TUBERCULIN de 1 mL com 27G x 13mm | BD | 309623 | |
| placa de vidro spot de 9 poços | Pyrex | 13-748B | |
| Alexa Fluor 555-conjugado com faloidina | ThermoFisher Scientific | A34055 | |
| Artéria Tesoura - Ponta de Bola | Fine Science Tools | 14080-11 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Câmera para capturar imagens em luz incidente | Leica | DFC 495 | |
| Câmera para capturar imagens fluorescentes | Leica | DFC 7000 GT | |
| 15 mL | Corning | 430053 | |
| Tubos de centrífuga 50 mL | Corning 430829 | ||
| Colagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| Microscópio Confocal | Zeiss | LSM 880 | |
| Tampa de Vidro | Corning | 2940-223 | |
| Dumont #4 Fórceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 Fórceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Fórceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Tesoura Bonn Extra Fina | Ferramentas de Ciência Fina | 14084-08 | |
| Alternativa: Tesoura Micro Dissecadora Extra Fina; Reto; Pontas afiadas; Comprimento da lâmina de 20mm; 3 1/2" Comprimento total | Roboz | RS-5880 | |
| Anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 de cabra | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| MicroSlides Superfrost | VWR | 48311-702 | |
| Agitador orbital, por exemplo Mini Shaker | Daigger | 980275 | |
| Paraformaldeído (PFA) 16% Solução Aquosa | Microscopia Eletrônica Sciences | 15710 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (10X) pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant com DAPI | ThermoFisher Scientific | P36931 | |
| Anticorpos anti-Pendrina para coelhos | RRID interno | : AB_2713943, PB826 (Choi et al.< / em>, 2011) | |
| Pinça de anel | Ferramentas de ciências | finas11106-09 | |
| Agitador de balanço, por exemplo GyroMini | Labnet | S0500 | |
| Estereomicroscópio equipado com uma objetiva PlanApo 1.0x | |||
| , .009" | GEM Personna | 62-0176 | |
| Placa de cultura de tecidos 60 mm | Falcon | 353002 | |
| Esmalte transparente | |||
| Triton X-100 | ACROS Orgânicos | 32737-1000 |
Referências
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Reimpressões e permissões
