Gangliosides são glicósfoliópidos portadores de ácido sálico que são particularmente abundantes no cérebro. Sua natureza anfíppática requer técnicas orgânicas/aquosas de extração e purificação para garantir uma recuperação ideal e análises precisas. Este artigo fornece visões gerais da extração de ganglioside em escala analítica e preparatória, purificação e análise de cromatografia de camada fina.
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Artigo de método
Extração de ganglioside, purificação e perfil
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Gangliosides são glicosfingolipidos que contêm um ou mais resíduos de ácido sálico. Eles são encontrados em todas as células vertebrados e tecidos, mas são especialmente abundantes no cérebro. Expressos principalmente no folheto externo das membranas plasmáticas das células, eles modulam as atividades das proteínas da superfície celular via associação lateral, atuam como receptores nas interações células-células e são alvos de patógenos e toxinas. A desregulação genética da biossíntese ganglioside em humanos resulta em graves distúrbios do sistema nervoso congênito. Devido à sua natureza anfípppica, a extração, a purificação e a análise de gangliosides exigem técnicas que foram otimizadas por muitos investigadores nos 80 anos desde sua descoberta. Aqui, descrevemos métodos de nível de bancada para a extração, purificação e análises qualitativas e quantitativas preliminares de grandes gangliosides de tecidos e células que podem ser completadas em poucas horas. Também descrevemos métodos para isolamento em maior escala e purificação de grandes espécies de ganglioside do cérebro. Juntos, esses métodos proporcionam acesso analítico e de escala preparatória a essa classe de moléculas bioativas.
Introdução
Os gangliosides são definidos como glicosfingolipids com um ou mais resíduos de ácido sálico1. Eles são expressos principalmente na superfície celular com sua moiety lipídica de ceramida hidrofóbica incorporada no folheto externo da membrana plasmática e seus glicanos hidrofílicos estendendo-se para o espaço extracelular2. Embora amplamente distribuídas em células vertebradas e tecidos, elas são particularmente abundantes no cérebro vertebrado3, onde foram descobertos pela primeira vez e nomeados4.
As estruturas dos glicanos gangliosas variam e s....
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Protocolo
A coleta de tecidos foi realizada em condições autorizadas pelo Comitê de Uso e Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins.
1. Extração de ganglioside em pequena escala e purificação parcial
ATENÇÃO: Tenha ventilação adequada ao trabalhar com solventes voláteis e tóxicos. Evite o plástico por toda parte; solventes extrairão componentes químicos de muitos plásticos que interferem com análises subsequentes. Politetrafluoroetileno (PTFE) é uma exceção; Os fechamentos alinhados ao PTFE devem ser usados para tampar frascos de armazenamento de vidro.
- Extração
- Pesar um único cérebro de rato fresco ou desc....
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Resultados
Os métodos descritos na seção 1 (pequena escala) fornecem gangliosides em quantidade e pureza suficientes para a determinação qualitativa e quantitativa de grandes lesões cerebrais. A recuperação do cérebro do camundongo é ~ 1 μmol ganglioside por g peso molhado cerebral (1 nmol/μL) quando preparado como descrito. A resolução TLC de 1 μL (1 nmol) usando a seção 3 fornece material amplo para detecção de resorcinol e resolve todos os principais gangliodolos cerebrais como mostrado para o tipo selvagem e camundongos genetic.......
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Discussão
Os métodos de extração e isolamento de ganglioside de pequeno e grande porte relatados aqui não são únicos - existem muitas abordagens diferentes de extração e purificação de solventes que fornecem excelentes resultados12. Os métodos relatados aqui para purificação em pequena escala do cérebro, de Fredman e Svennerholm13, mostraram-se para otimizar a recuperação e provaram ser robustos e diretos ao longo de muitos anos em nosso laboratório. O isolamento e purificação adequa.......
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Divulgações
Os autores afirmam que não há interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Comum dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para a concessão da Glicociência U01CA241953. O MJP foi apoiado pelo Programa de Interface Química-Biologia da Johns Hopkins (T32GM080189).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cérebro bovino, descascado | PelFreez | 57105-1 | |
| Padrões de gangliosídeo | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Frasco de vidro com tampa revestida de PTFE | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Frasco de centrífuga de vidro | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Tubos de cultura de vidro, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | para recolha de frações de HPLC |
| Funil separatório de vidro (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Seringa de injeção - Hamilton 1750 Estanque a gás 500 µ l | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldeído, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Homogeneizador Potter-Elvhjem | Fisher Scientific | 08-414-14A | Escolha a opção de volume apropriada |
| Reprosil 100 NH2 10µ m 5x4mm colunas de guarda | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μ m, coluna de HPLC de 250 mm x 20 mm | Analytics-Shop | embalado sob medida | outros tamanhos disponíveis |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Evaporador rotativo | Buchi | R-300 | |
| Loop de amostra para Injetor Modelo 7725 (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Cartucho Curto, 400 mg | Seringa de Manchas | WAT036810 | |
| - Hamilton 701N 10 µ l | Hamilton | 80300 | |
| Tubos de ensaio de parede espessa de 13 mm de diâmetro com tampas revestidas com PFTE | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Frascos rosqueados de 2 ml com tampas revestidas com PFTE | Fisher Scientific | 14-955-323 | Para placas TLC de armazenamento de gangliosídeos |
| , HPTLC Gel de sílica 60 F254 Multiformato | Fisher Scientific | M1056350001 | A impregnação de fluorescência (F254) estabiliza o sorvente pulverizador de reagentes TLC de superfície |
| Fisher Scientific | 05-723-26A | ||
| Câmara de corrida TLC para placas de 10 x 10 cm | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1 litro inoxidável Steal Liquidificador resistente a explosões | Waring | E8520 |
Referências
- Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of....
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Reimpressões e permissões
