Artigo de método

Análise das respostas e identificação de epítopos de células T T específicas do HBV com base em uma matriz de peptídeos

DOI:

10.3791/62387

⸱

20 de outubro de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

Neste artigo

Resumo

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Com base em uma matriz de peptídeos derivadas do vírus da hepatite B (HBV), as respostas de células T CD4 específicas do HBV poderiam ser avaliadas em paralelo com a identificação de epítopos de células T CD4 específicas do HBV.

Resumo

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As células CD4 T desempenham papéis importantes na patogênese da hepatite crônica B. Como uma população celular versátil, as células CD4 T foram classificadas como subconjuntos funcionais distintos com base nas citocinas que secretaram: por exemplo, IFN-γ para células auxiliares CD4 T 1, IL-4 e IL-13 para cd4 T helper 2 células, IL-21 para células auxiliares foliculares CD4 T e IL-17 para células auxiliares CD4 T 17. A análise das células CD4 T específicas do vírus da hepatite B (HBV) baseadas na secreção de citocinas após a estimulação de peptídeos derivados do HBV poderia fornecer informações não apenas sobre a magnitude da resposta cd4 t-cell específica do HBV, mas também sobre os subconjuntos funcionais das células CD4 T específicas do HBV. Novas abordagens, como transcrição e análise de metabolômica, poderiam fornecer informações funcionais mais detalhadas sobre células CD4 T específicas do HBV. Essas abordagens geralmente requerem isolamento de células CD4 T específicas do HBV viáveis com base em multimers complexos de histocompatibilidade de peptídeos-maior-ii, enquanto atualmente as informações sobre epítopos de células T CD4 específicas do HBV são limitadas. Baseado em uma matriz de peptídeos derivadas do HBV, um método foi desenvolvido para avaliar as respostas de células T CD4 específicas do HBV e identificar epítopos de células T específicas do HBV simultaneamente usando amostras de células mononucleares de sangue periféricos de pacientes crônicos de infecção por HBV.

Introdução

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Atualmente, existem 3 abordagens principais para analisar células T específicas de antígeno. A primeira abordagem é baseada na interação entre o receptor de células T e o peptídeo (epítope). As células T específicas de antígenos podem ser diretamente manchadas com multimers complexos de histocompatibilidade (MHC) de peptídeos. A vantagem deste método é que ele poderia obter células T viáveis específicas de antígeno, adequadas para análise de transcrição/metabolômica a jusante. Uma limitação deste método é que ele não poderia fornecer informações sobre toda a resposta de células T a um antígeno específico, pois requer peptídeos de epítope validados enquanto o número de epítopos identificados para um antígeno específico é limitado por enquanto. Em comparação com os epítopos de células T CD8 específicas do vírus da hepatite B (HBV), foram identificados menos epítopos de células T específicas do HBV, foram identificados simptos de células T específicas do HBVatualmente.

A segunda abordagem baseia-se na regulação de uma série de marcadores induzidos por ativação após a estimulação do peptídeo de antígeno3. Os marcadores comumente usados incluem CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Este método tem sido usado agora para analisar respostas de células T específicas de antígeno em indivíduos vacinados5,6, pacientes com infecção por vírus da imunodeficiência humana7, e síndrome respiratória aguda grave Coronavirus 2 pacientes infecção8,9. Ao contrário do ensaio baseado em multimers peptídeo-MHC, este método não é restrito por epítopos validados e poderia obter células viáveis para análise a jusante. Uma limitação deste método é que ele não poderia fornecer informações sobre o perfil citocina de células T específicas de antígeno. Além disso, a expressão desses marcadores induzidos por ativação por algumas células não específicas de antígeno ativado pode contribuir para os sinais de fundo na análise, o que pode ser um problema especialmente quando as células T específicas de antígeno alvo são raras. Atualmente, há uma aplicação limitada deste método em células CD4 T específicas do HBV4. Se esse método poderia ser utilizado para analisar células CD4 T específicas do HBV de forma confiável, precisa de uma investigação mais aprofundada.

A terceira abordagem é baseada na secreção de citocinas após a estimulação do peptídeo de antígeno. Como a análise baseada em marcadores induzidos por ativação, este método não é restrito por epítopos validados. Este método poderia revelar diretamente o perfil de citocinas de células T específicas de antígeno. A sensibilidade deste método é menor do que o método baseado em marcador induzido por ativação, pois se baseia na secreção de citocinas de células T específicas de antígeno e o número de citocinas testadas é geralmente limitado. Atualmente, este método é amplamente utilizado na análise de células T específicas do HBV. Como citocinas que secretam células T específicas do HBV dificilmente poderiam ser detectadas pela estimulação direta de peptídeo ex vivo10,11, o perfil citocina das células T específicas do HBV é geralmente analisado após 10 dias de expansão estimulada por peptídeo in vitro12,13,14,15,16. O arranjo de piscinas de peptídeos em forma matricial tem sido utilizado para facilitar a identificação de epítopos específicos de antígeno17,18. Com a combinação de matriz de peptídeos e análise de secreção de citocinas, um método foi desenvolvido para avaliar as respostas específicas das células T CD4 específicas do HBV e identificar epítopos de células T específicas do HBV simultaneamente16. Neste protocolo, os detalhes deste método são descritos. O antígeno núcleo HBV é escolhido como um exemplo de demonstração neste protocolo.

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Protocolo

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O consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente incluído no estudo. O protocolo de estudo está de acordo com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinque de 1975, refletida na aprovação de a priori pelo comitê de ética médica do Hospital Southwest.

1. Projeto da matriz de peptídeos derivadas do HBV

  1. Baixe sequências de aminoácidos do antígeno principal HBV dos bancos de dados NCBI (GenBank: AFY98989.1).
  2. Compre peptídeos derivados de antígeno do núcleo HBV (um painel de 35 peptídeos de 15-mer sobrepostos por 10 resíduos, pureza > 90%, 4 mg/peptídeo) de um provedor de serviços de síntese de peptídeos.
  3. Configure uma matriz de peptídeos quadrada de 6×6 com cada posição na matriz contendo apenas 1 peptídeo. Há 12 piscinas de peptídeos: 6 piscinas de peptídeos de linha e 6 piscinas de peptídeos de coluna, 5-6 peptídeos em cada piscina16. As piscinas de peptídeos de linha e as piscinas de peptídeos da coluna na matriz representam 2 formações separadas de antígeno do núcleo HBV.
  4. Para 3/4 dos peptídeos adquiridos, misture peptídeos na mesma linha/coluna da matriz em 12 piscinas de peptídeos separadas, dissolvendo-os juntos em sulfóxido de dimetila (DMSO) (2 μg/μL para cada peptídeo). Armazene a -80 °C para análise das respostas de células T CD4 específicas do HBV.
  5. Dissolva o resto dos peptídeos separadamente (10 μg/μL) e armazene a -80 °C para identificação de epítope.

2. Isolamento de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs)

  1. Amostra de 5 mL de sangue venoso de pacientes crônicos de infecção por HBV.
    NOTA: O volume sanguíneo deve ser aproximadamente estimado de acordo com o número de piscinas de peptídeos mais 1 controle de fundo e 1 controle positivo. A análise de 1 piscina de peptídeos precisa de 3 x 105 PBMCs. Em média, 1 x 106 PBMCs poderiam ser obtidos a partir de 1 mL de sangue.
  2. Isole os PBMCs do sangue usando centrifugação gradiente de densidade ficoll (800 × g, 20 min) e criopreserve PBMCs isolados em nitrogênio líquido para uso posterior.
  3. Use uma pipeta Pasteur para coletar granulócitos entre a camada clara de Ficoll e a camada de glóbulos vermelhos. Extrair DNA genômico de granulócitos usando um kit de purificação de DNA genômico de acordo com o protocolo do fabricante.
  4. Envie a amostra de DNA para provedores de serviços de genotipo para determinar o genótipo HLA-DRB1.

3. Expansão in vitro de PBMCs usando uma matriz de peptídeo HBV

  1. Descongele pbmcs.
    1. RPMI quente 1640 suplementado com 1:10.000 benzonase (25 U/mL) a 37 °C em um banho de água.
      NOTA: A benzonase ajuda a limitar o agrupamento celular durante o descongelamento. Cada amostra exigirá 20 mL de RPMI 1640 com benzonase. Calcule a quantidade necessária para descongelar todas as amostras e prepare uma alíquota separada de mídia (37 °C) com 1:10.000 Benzonase (25 U/mL). Descongele não mais do que 5 amostras de cada vez.
    2. Remova amostras de nitrogênio líquido e descongele rapidamente frascos congelados em banho-maria (37 °C).
    3. Transfira a suspensão da célula descongelada para um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione 1 mL de Benzonase RPMI 1640 (37 °C) dropwise ao tubo. Adicione lentamente 6 mL de Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ao tubo centrífuga, enxágue criovial com mais 2 mL de Benzonase RPMI 1640 (37 °C) para recuperar todas as células. Continue com o resto das amostras o mais rápido possível.
      NOTA: A diluição lenta das amostras criopreservadas é a chave para manter a viabilidade das células descongeladas.
    4. Centrífuga (400 × g, 10 min), remova o sobrenante e solte a pelota tocando no tubo.
    5. Levemente resuspenque a pelota em 1 mL de Benzonase RPMI 1640 quente. Misture suavemente e filtre células através de um coador de células de 70 μm, se necessário (ou seja, se houver alguma aglomeração visível).
    6. Aliquot uma suspensão de 10 μL e diluir na solução salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco, adicionar azul Trypan (0,04%), carregar em um hemocitómetro, esperar por 1 min e contar o número de células viáveis (células claras).
    7. Adicione 9 mL de Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ao tubo, centrífuga (400 × g, 10 min), retire o sobrenante e solte a pelota tocando o tubo.
  2. PbMCs de resuspend em RPMI 1640 suplementados com HEPES de 25 mM, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 100 penicilina U/mL, 100 μg/mL estreptomicina e 10% soro AB humano (meio de cultura completa). Ajuste a densidade celular para 1,5 x 106 células/mL. Placa PBMCs em placas de 96 poços (fundo plano) a uma densidade de 3 x 105 células/bem.
  3. Adicione piscinas de peptídeos derivadas do HBV (2 μg/mL para cada peptídeo único) a cada poço. Para poços de controle de fundo e controle positivo, adicione a mesma quantidade de solvente (DMSO, 1 μL/mL). Adicione 10 U/mL IL-2 e 10 ng/mL IL-7. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
  4. No dia 3, suplemento cultura média com 50 U/mL de IL-2 e 10 ng/mL de IL-7.
    NOTA: Durante o dia 1º ao dia 3, não será observada nenhuma proliferação óbvia de células T. O número total de células geralmente diminuirá em 1/3 a 1/2, devido à morte de células não-T, como células B, células NK, células NKT e monócitos.
  5. No dia 7, substitua metade do meio de cultura por peptídeos frescos (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) e IL-7 (20 ng/mL).
    NOTA: Para evitar perturbar as células na parte inferior, pipeta cerca de 90 μL de cultura média cuidadosamente a partir do topo do meio. Durante o dia 3 ao dia 7, será observada uma proliferação robusta de células T, e as células T proliferadas geralmente se agregam para formar aglomerados.
  6. No dia 10, suavemente pipeta cultura celular em cada poço 7-9 vezes para desagregar aglomerados celulares, contar o número de células viáveis e transferir 2×105 células em cada poço para uma placa de 96 poços (fundo redondo) para análise de resposta cd4 t-cell específica do HBV.
  7. Continue esculpindo o resto das células para identificação de epítope no dia 12, ajuste o volume de cultura média para 100 μL (descartando meio excessivo) e cultura de suplemento com 100 μL de meio de cultura completa fresco contendo peptídeos (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) e IL-7 (20 ng/mL).
    NOTA: Durante o dia 7 ao dia 10, as células T continuam se proliferando vigorosamente. Substitua o meio de cultura como na etapa 3.5 se o meio ficar amarelo. Em geral, o número de celular excederá 6×105 no dia 10. Cada poço geralmente mostra número de celular semelhante, conta número de célula em 3 poços e usa o valor médio como uma estimativa do número de celular para todos os poços.

4. Análise das respostas cd4 t-cell específicas do HBV por citometria de fluxo intracelular

  1. Estimulando PBMCs com piscinas de peptídeos
    1. Para as células transferidas para a placa 96 bem (fundo redondo), lave 3 vezes em uma placa (550 × g, 3 min). Use 200 μL de meio para cada lavagem (RPMI 1640 para as primeiras 2 lavagens, meio de cultura completa para a última lavagem). Descarte os supernantes.
      NOTA: A remoção de citocinas residuais na cultura por lavagem repetida poderia efetivamente diminuir o fundo na análise da citometria de fluxo intracelular.
    2. Para cada poço de células estimuladas com uma piscina específica de peptídeos, adicione 200 μL de cultura completa complementada com as mesmas piscinas de peptídeos (2 μg/mL para cada peptídeo único). Para o bem de controle de fundo, adicione meio de cultura completa complementado com 1 μL/mL de DMSO. Para o bem de controle positivo, adicione meio de cultura completa suplementado com 1 μL/mL de DMSO, 150 ng/mL de phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) e 1 μmol/L de ionomicina.
      NOTA: A alta dose de DMSO bloqueará a secreção de citocinas das células T (mais significativa para TNF-α). Não é recomendada a dose de DMSO superior a 5 μL/mL. Geralmente, a dose de DMSO em nosso experimento não excede 1 μL/mL.
    3. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 6 h.
    4. Após 1 h de incubação, adicione Monensin (1,37 μg/mL) à cultura.
  2. Citometria de fluxo
    1. Depois de 6h de incubação. Remova as células supernacantes após centrifugação (550 × g, 3 min), lave células uma vez com 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min), marcadores de superfície de manchas (CD3, CD4 e CD8) e marcador de viabilidade (usando Corante de Vibilidade Fixável) em uma geladeira de 4 °C por 30 minutos.
    2. Lave uma vez com 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min). Fixar e permeabilize células, e manchar citocinas intracelulares (TNF-α e IFN-γ) em uma geladeira de 4 °C por 45 min.
    3. Após a lavagem final em coloração intracelular, resuspendam células em 150 μL de tampão de citometria de fluxo (DPBS + 0,5% BSA).
    4. Adquira dados de citometria de fluxo em um citómetro de fluxo.
  3. Análise dos resultados da citometria de fluxo
    1. Definição de bem positivo: considere um bem positivo se tiver uma frequência de citocinas secretando células T pelo menos duas vezes do bem controle de fundo(Figura 1).
    2. De acordo com a fórmula a seguir, calcule a taxa de resposta para cada citocina analisada (Figura 2):
      figure-protocol-1
      NOTA: A piscina de peptídeos de linha e as piscinas de peptídeos da coluna na matriz representam 2 formações distintas de antígeno do núcleo HBV, de modo que a taxa de resposta final deve ser dividida por 2.

5. Identificação de Epítopos de células T T restritos HLA-DR específicos do HBV

  1. Descongele e mantenha linhas alergênicas de células linfobladas (BLCLs) em frasco T-75 (5-20×10 6 células, 20 mL de meio de cultura completa).
    NOTA: Para garantir o bom estado dos BLCLs, esta etapa deve ser iniciada 2 semanas antes do descongelamento dos PBMCs dos pacientes. De acordo com o resultado genotipagem, os pacientes devem compartilhar o mesmo alelo HLA-DRB1 que os BLCLs.
  2. Triagem de peptídeos candidatos para identificação (Figura 3)
    1. De acordo com os resultados da taxa de resposta de células T no dia 10, tela 2 piscinas de peptídeos com a maior taxa de resposta (piscina de peptídeo de 1 linha e piscina de peptídeo de 1 coluna).
    2. Coloque o peptídeo nessas 2 piscinas como peptídeo candidato se a outra piscina de peptídeos contendo este peptídeo também mostrar um resultado positivo na análise de resposta de células T. Use os PBMCs expandidos com a outra piscina de peptídeos para identificação de epítope posteriormente.
  3. Pulsando BLCLs com peptídeos
    1. No dia 12, conte o número de BLCLs viáveis, transfira células para tubos de centrífugas de 15 mL, centrífuga (350 × g, 10 min) e remova o supernante. Resuspenque a pelota celular em meio de cultura completa, e alíquota bLCLs para uma placa de 96 poços (fundo redondo) a 4×104 células/bem em 80 μL meio de cultura completa.
    2. Adicione um único peptídeo (10 μg/mL), incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 2 h. Definir 2 controle de fundo: pulsação de peptídeo com bloqueio HLA-DR (pré-tratamento com anti-HLA-DR (10 μg/mL) por 1 h); Pulsação DMSO (1 μL/mL). O volume final de cultura completa em cada poço é de 100 μL.
    3. Adicionar mitomicina C (100 μg/mL), incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 1h.
    4. Lave 3 vezes com 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) em uma placa para remover peptídeo não pulsado e mitomicina C. Para a primeira lavagem, suplemente a cultura de incubação com 100 μL de RPMI 1640.
    5. Células resuspend em 120 μL de meio de cultura completa.
  4. Estimulando PBMCs com BLCLs pulsados com peptídeos.
    1. No dia 12, transfira os PBMCs para uma placa de 96 poços (fundo redondo).
    2. Remova o supernatante após a centrifugação (550 × g, 3 min) em uma placa, uma lavagem duas vezes com 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) em uma placa.
      NOTA: A remoção de citocinas residuais e peptídeos na cultura por lavagem repetida é o passo fundamental para diminuir o fundo na análise da citometria de fluxo intracelular. Especialmente para peptídeos residuais, ele se ligará aos BLCLs e aumentará significativamente o fundo.
    3. Resuspend PBMCs em cada poço com 210 μL de meio de cultura completa.
    4. Para o poço de PBMCs escolhidos para identificação de epítope, misture a alíquota (70 μL cada) com BLCLs pulsadas com peptídeos (3 poços, incluindo 2 controles de fundo).
      NOTA: No dia 12, o número de pbmcs expandidos de peptídeos geralmente atingirá acima de 5-7×105 por poço, de modo que a proporção de PBMCs/BLCLs é de cerca de 6/1 a 4/1.
    5. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 6 h.
    6. Após 1 h de incubação, adicione Monensin (1,37 μg/mL) à cultura. O volume final de cultura completa em cada poço é de 200 μL.
  5. Citometria de fluxo
    1. Repita as mesmas operações da etapa 4.2.
  6. Análise dos resultados da citometria de fluxo
    1. Verifique um peptídeo como um epítope de células T cd4 restritas HLA-DR se os PBMCs incubados com este peptídeo pulsado BLCLs mostram uma frequência de citocinas secretando células CD4 T pelo menos duas vezes dos PBMCs incubados com controles de fundo (peptídeo pulsando com pré-bloqueio HLA-DR; DMSO pulsando) (Figura 4).

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Resultados

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A frequência de citocinas secretando células CD4 T são calculadas como a soma de produtores individuais e produtores duplos. Como demonstrado na Figura 1,a frequência de células T4 T secretantes de TN α F e a frequência de células T DE Γ de IFN em controle de fundo (DMSO) são de 0,154% e 0,013%, respectivamente. A frequência de células CD4 T secretantes T α TNF e a frequência de células CD4 T secretas ifn-γ específicas para o pool de peptídeos Core11 são 0,206 e 0,017, respectivamente, de mo...

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Discussão

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As etapas mais críticas deste protocolo estão listadas da seguinte forma: 1) PBMCs suficientes de alta viabilidade para iniciar a expansão dos PBMCs; 2) ambiente adequado para expansão de PBMCs; e 3) remoção completa de piscinas de peptídeos residuais na cultura pbmcs antes da identificação do epítope.

Toda a análise neste protocolo depende da proliferação robusta das células CD4 T. Em geral, o número de PBMCs após a expansão de 10 dias será de 2 a 3 vezes o número inicial. O número do celular...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) e Chave Chinesa
Projeto Especializado em Doenças Infecciosas (2018ZX10723203).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina bovina V (BSA)BeyotimeST023
APC-conjugado Anti-humano TNF-αeBioscience17-7349-82Mantenha-se protegido da luz
Benzonase NucleaseSigma-AldrichE1014Limite as
linhas celulares linfoblastóides B aglomeradas de células (BLCLs)FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTERHLA-DRB1 * 0803
linhas celulares linfoblastóides homozigóticas B (BLCLs)FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTERHLA-DRB1 * 1202 homozigoto
Frasco de Cultura de Células (T75)Corning430641
Placa de Cultura de Células (96 poços, fundo plano)Corning3599Placa de Cultura de Células de fundo plano
(96 poços, fundo redondo)Corning3799Coador de Células de fundo redondo
CorningCLS431751Tamanho dos poros 70  μ m, branco, tubo de
centrífuga estéril (15 mL)KIRGENKG2611estéril
(50 mL)estérilCorning430829
refrigeradaEppendorf5804R
refrigeradaThermoST16R
, Termolenda
refrigeradaKit Cytofix/Cytoperm (Conjunto de Tampão de Fator de Transcrição)BD Biosciences562574Prepare a solução antes
de usar Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Mantenha em temperatura ambiente para evitar a cristalização
Dulbecco' s Preparação salinaddH2O (1000 ml) contendo NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) e Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Ajuste o PH para 7.4. Esterilize através de autoclave.
Pontas de filtro Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-03
(0.5-10)Pontas deestéreisKirgenKG5131
(100-1000)estéreisKirgenKG5333
(1-200)KirgenKG5233Estéril
conjugado com FITC Anti-humanoCD4 BioLegend300506Manter protegido da luz
Corante de Viabilidade Fixável eFluor780eBioscience65-0865-14Mantenha-se protegido da luz
Inibidor de Transporte de Proteína GolgiStop (Contendo Monensina)BD Biosciences554724Inibidor de Transporte de Proteína
HemocitômetroMarca718620
Peptídeos Derivados do Antígeno do Núcleo HBVChinaPeptídeos
HEPESGibco15630080100 ml
de soro humano ABGemini Bio-Products100-51100 ml
de ionomicinaSigma-AldrichI0634
KClSangon BiotechA100395-0500
KH2PO4Sangon BiotechA100781-0500
LSRFortessa Citômetro de fluxoBD
L-glutaminaGibco25030081
Tubo de Microcentrífuga de 100 ml (1,5 mL)CorningMCT-150-CEsterilização autoclavada antes de usar
Microplate ShakersScientific IndustriesMicroPlate Genie
Mitomicina CRoche10107409001
Na2HPO4.7H2OSangon BiotechA100348-0500
NaClSangon BiotechTubos de PCR A100241-0500
(0,2 mL)KirgenKG2331
PE / Cy7 conjugado Anti-humano CD8BioLegend300914Manter protegido da luz
PE conjugado Anti-humano IFN-&gama;eBioscience12-7319-42Manter protegido da luz
Penicilina EstreptomicinaGibco15140122100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugado Anti-humano CD3eBioscience45-0037-42Manter protegido da luz
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma-AldrichP1585
Humano Recombinante IL-2PeproTech200-02
Humano recombinante IL-7PeproTech200-07
RPMI Médio 1640GibcoC11875500BT500 ml
de piruvato de sódio, 100mMGibco15360070
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061
Ultra-LEAF Purificado Anti-humano HLA-DRBioLegend307648
Wizard Genomic DNA Kit de PurificaçãoPromegaA1125
IHW09126 IHW09121 Tubo de centrífuga Centrífuga , Centrífuga , Centrífuga tamponada com fosfato filtro Pontas de filtro

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
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