Análise das respostas e identificação de epítopos de células T T específicas do HBV com base em uma matriz de peptídeos

Resumo

Com base em uma matriz de peptídeos derivadas do vírus da hepatite B (HBV), as respostas de células T CD4 específicas do HBV poderiam ser avaliadas em paralelo com a identificação de epítopos de células T CD4 específicas do HBV.

Resumo

As células CD4 T desempenham papéis importantes na patogênese da hepatite crônica B. Como uma população celular versátil, as células CD4 T foram classificadas como subconjuntos funcionais distintos com base nas citocinas que secretaram: por exemplo, IFN-γ para células auxiliares CD4 T 1, IL-4 e IL-13 para cd4 T helper 2 células, IL-21 para células auxiliares foliculares CD4 T e IL-17 para células auxiliares CD4 T 17. A análise das células CD4 T específicas do vírus da hepatite B (HBV) baseadas na secreção de citocinas após a estimulação de peptídeos derivados do HBV poderia fornecer informações não apenas sobre a magnitude da resposta cd4 t-cell específica do HBV, mas também sobre os subconjuntos funcionais das células CD4 T específicas do HBV. Novas abordagens, como transcrição e análise de metabolômica, poderiam fornecer informações funcionais mais detalhadas sobre células CD4 T específicas do HBV. Essas abordagens geralmente requerem isolamento de células CD4 T específicas do HBV viáveis com base em multimers complexos de histocompatibilidade de peptídeos-maior-ii, enquanto atualmente as informações sobre epítopos de células T CD4 específicas do HBV são limitadas. Baseado em uma matriz de peptídeos derivadas do HBV, um método foi desenvolvido para avaliar as respostas de células T CD4 específicas do HBV e identificar epítopos de células T específicas do HBV simultaneamente usando amostras de células mononucleares de sangue periféricos de pacientes crônicos de infecção por HBV.

Introdução

Atualmente, existem 3 abordagens principais para analisar células T específicas de antígeno. A primeira abordagem é baseada na interação entre o receptor de células T e o peptídeo (epítope). As células T específicas de antígenos podem ser diretamente manchadas com multimers complexos de histocompatibilidade (MHC) de peptídeos. A vantagem deste método é que ele poderia obter células T viáveis específicas de antígeno, adequadas para análise de transcrição/metabolômica a jusante. Uma limitação deste método é que ele não poderia fornecer informações sobre toda a resposta de células T a um antígeno específico, pois requer peptídeos de epítope validados enquanto o número de....

Protocolo

O consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente incluído no estudo. O protocolo de estudo está de acordo com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinque de 1975, refletida na aprovação de a priori pelo comitê de ética médica do Hospital Southwest.

1. Projeto da matriz de peptídeos derivadas do HBV

1. Baixe sequências de aminoácidos do antígeno principal HBV dos bancos de dados NCBI (GenBank: AFY98989.1).
2. Compre peptídeos derivados de antígeno do núcleo HBV (um painel de 35 peptídeos de 15-mer sobrepostos por 10 resíduos, pureza > 90%, 4 mg/peptídeo) de um provedor de serviços de síntese de peptídeos.

Resultados

A frequência de citocinas secretando células CD4 T são calculadas como a soma de produtores individuais e produtores duplos. Como demonstrado na Figura 1,a frequência de células T4 T secretantes de TN α F e a frequência de células T DE Γ de IFN em controle de fundo (DMSO) são de 0,154% e 0,013%, respectivamente. A frequência de células CD4 T secretantes T α TNF e a frequência de células CD4 T secretas ifn-γ específicas para o pool de peptídeos Core11 são 0,206 e 0,017, respectivamente, de mo.......

Discussão

As etapas mais críticas deste protocolo estão listadas da seguinte forma: 1) PBMCs suficientes de alta viabilidade para iniciar a expansão dos PBMCs; 2) ambiente adequado para expansão de PBMCs; e 3) remoção completa de piscinas de peptídeos residuais na cultura pbmcs antes da identificação do epítope.

Toda a análise neste protocolo depende da proliferação robusta das células CD4 T. Em geral, o número de PBMCs após a expansão de 10 dias será de 2 a 3 vezes o número inicial. O número do celular.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina bovina V (BSA)	Beyotime	ST023
APC-conjugado Anti-humano TNF-α	eBioscience	17-7349-82	Mantenha-se protegido da luz
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Limite as
linhas celulares linfoblastóides B aglomeradas de células (BLCLs)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER		HLA-DRB1 * 0803
linhas celulares linfoblastóides homozigóticas B (BLCLs)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER		HLA-DRB1 * 1202 homozigoto
Frasco de Cultura de Células (T75)	Corning	430641
Placa de Cultura de Células (96 poços, fundo plano)	Corning	3599	Placa de Cultura de Células de fundo plano
(96 poços, fundo redondo)	Corning	3799	Coador de Células de fundo redondo
	Corning	CLS431751	Tamanho dos poros 70  μ m, branco, tubo de
centrífuga estéril (15 mL)	KIRGEN	KG2611	estéril
(50 mL)	estéril	Corning	430829
refrigerada	Eppendorf	5804R
refrigerada	Thermo	ST16R
, Termolenda
refrigeradaKit Cytofix/Cytoperm (Conjunto de Tampão de Fator de Transcrição)	BD Biosciences	562574	Prepare a solução antes
de usar Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Mantenha em temperatura ambiente para evitar a cristalização
Dulbecco' s Preparação salina			ddH2O (1000 ml) contendo NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) e Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Ajuste o PH para 7.4. Esterilize através de autoclave.
Pontas de filtro Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-03
(0.5-10)Pontas de	estéreis	Kirgen	KG5131
(100-1000)	estéreis	Kirgen	KG5333
(1-200)	Kirgen	KG5233	Estéril
conjugado com FITC Anti-humano	CD4 BioLegend	300506	Manter protegido da luz
Corante de Viabilidade Fixável eFluor780	eBioscience	65-0865-14	Mantenha-se protegido da luz
Inibidor de Transporte de Proteína GolgiStop (Contendo Monensina)	BD Biosciences	554724	Inibidor de Transporte de Proteína
Hemocitômetro	Marca	718620
Peptídeos Derivados do Antígeno do Núcleo HBV	ChinaPeptídeos
HEPES	Gibco	15630080	100 ml
de soro humano AB	Gemini Bio-Products	100-51	100 ml
de ionomicina	Sigma-Aldrich	I0634
KCl	Sangon Biotech	A100395-0500
KH2PO4	Sangon Biotech	A100781-0500
LSRFortessa Citômetro de fluxo	BD
L-glutamina	Gibco	25030081
Tubo de Microcentrífuga de 100 ml (1,5 mL)	Corning	MCT-150-C	Esterilização autoclavada antes de usar
Microplate Shakers	Scientific Industries	MicroPlate Genie
Mitomicina C	Roche	10107409001
Na2HPO4.7H2O	Sangon Biotech	A100348-0500
NaCl	Sangon Biotech	Tubos de PCR A100241-0500
(0,2 mL)	Kirgen	KG2331
PE / Cy7 conjugado Anti-humano CD8	BioLegend	300914	Manter protegido da luz
PE conjugado Anti-humano IFN-&gama;	eBioscience	12-7319-42	Manter protegido da luz
Penicilina Estreptomicina	Gibco	15140122	100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugado Anti-humano CD3	eBioscience	45-0037-42	Manter protegido da luz
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585
Humano Recombinante IL-2	PeproTech	200-02
Humano recombinante IL-7	PeproTech	200-07
RPMI Médio 1640	Gibco	C11875500BT	500 ml
de piruvato de sódio, 100mM	Gibco	15360070
Trypan Blue Stain (0,4%)	Gibco	15250-061
Ultra-LEAF Purificado Anti-humano HLA-DR	BioLegend	307648
Wizard Genomic DNA Kit de Purificação	Promega	A1125

IHW09126 IHW09121 Tubo de centrífuga Centrífuga , Centrífuga , Centrífuga tamponada com fosfato filtro Pontas de filtro