Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida

Resumo

Apresenta-se aqui um protocolo abrangente para a realização de experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores processivos de miosina-5, que poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos. O protocolo detalha todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparato experimental até a preparação da amostra, aquisição e análise dos dados.

Resumo

A espectroscopia ultrarrápida de pinça de força (UFFCS) é uma técnica de molécula única baseada em pinças a laser que permite a investigação da quimiomecânica de miosinas convencionais e não convencionais sob carga com resolução de tempo sem precedentes. Em particular, a possibilidade de sondar motores de miosina sob força constante logo após a formação da ligação actina-miosina, juntamente com a alta taxa de feedback de força (200 kHz), mostrou que a UFFCS é uma ferramenta valiosa para estudar a dependência de carga de dinâmicas rápidas, como o acidente vascular cerebral de trabalho da miosina. Além disso, a UFFCS permite o estudo de como as interações miosina-actina processivas e não processivas são influenciadas pela intensidade e direção da força aplicada.

Seguindo este protocolo, será possível realizar experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores de miosina-5 processiva e em uma variedade de miosinas não convencionais. Por alguns ajustes, o protocolo também poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos, como cinesinas e dineínas. O protocolo inclui todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparelho experimental até a preparação da amostra, procedimentos de calibração, aquisição e análise de dados.

Introdução

Nas últimas décadas, as pinças ópticas têm sido uma ferramenta valiosa para elucidar a mecanoquímica das interações proteicas no nível de molécula única, devido à impressionante possibilidade de manipulação e mensuração simultâneas de alterações conformacionais e cinética enzimática ^1,2. Em particular, a capacidade de aplicar e medir forças na faixa daquelas exercidas por motores moleculares na célula, juntamente com a capacidade de medir mudanças conformacionais subnanométricas, tornou as pinças ópticas uma ferramenta única de molécula única para desvendar as propriedades quimiomecânicas das proteínas motoras....

Protocolo

1. Configuração óptica

NOTA: A configuração experimental é composta por pinças ópticas duplas com estabilidade de apontamento nanométrico e < flutuações de intensidade de laser de 1%. Nessas condições, a estabilidade do haltere no nível nanométrico é garantida sob rigidez típica do purgador (0,1 pN / nm) e tensão (1 pN - algumas dezenas de pN). A Figura 2 mostra um esquema detalhado da configuração óptica.

1. Projeto e construção de pinças ópticas 9,10,11.
   1. Coloque todos os componentes da configuração em ....

Resultados

Os dados representativos consistem em registros de posição ao longo do tempo, conforme mostrado na Figura 4. No registro de posição dois tipos de deslocamento são visíveis. Em primeiro lugar, quando o motor de miosina não está interagindo com o filamento de actina, as esferas presas estão se movendo a uma velocidade constante contra a força de arrasto viscosa da solução, mostrando um deslocamento linear oscilando dentro da faixa de oscilação definida pelo operador em uma onda triangular

Discussão

Embora as técnicas de molécula única, como o ensaio de três contas, sejam tecnicamente desafiadoras e de baixo rendimento, o UFFCS melhora a detecção de interações moleculares graças à alta relação sinal-ruído dos dados. A UFFCS permite o estudo da dependência de carga de proteínas motoras, com as principais vantagens de aplicar a força muito rapidamente após a ligação do motor ao filamento para sondar eventos precoces e muito rápidos na produção de força e estados de ligação fracos sob força controlada; mantendo a força.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grânulos de látex de amina alifática	ThermoFisher	A37362	1.0-μ m de diâmetro, 2% (p/v)
Acetona	Sigma	32201
Tampão de polimerização de actina	Citoesqueleto	BSA02	10X
AODs (defletores acústico-ópticos)	AA Opto Electronic	DTS-XY 250	Defletores de feixe de laser
ATP	Sigma	A7699
Biotinilated-BSA	ThermoFisher	29130
BSA	Sigma	B4287
Calmodulina de cérebro suíno (CaM)	Merck Millipore	208783
Catalase de fígado bovino	Sigma	C40
Condensador		Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat	NA 1.4, imersão em óleo
Creatina fosfato dissódico sal tetrahidratado	Sigma	27920
Creatina Fosfoquinase do músculo de coelho	Sigma	C3755
DDs	AA Opto Electronic	AA. DDS. XX	Sintetizador digital de dois canais
DL-Dithiothreitol (DTT)/td>	Sigma	43819
EGTA	Sigma	E4378
Proteína G-actina	Citoesqueleto	AKL99
Glicose	Sigma	G7528
Glicose Oxidase de Aspergillus niger	Sigma	G7141
HaloTag éster succinimidílico O2 ligante	Promega	P1691
Graxa de silicone de alto vácuo pesada	Merck Millipore	107921
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4 / K2HPO4	Sigma	P5379 / P8281
Labview	National Instruments	versão 8.1	Aquisição de dados
Labview Módulo FPGA	National Instruments	versão 8.1	Fast Force-Clamp
Matlab	MathWorks	2016	Análise de dados
MgCl2	Fluka	63020
Objetiva de microscópio	Nikon	Plan-Apo 60X	NA 1.2, WD 0.2 mm, imm.
MOPS	Sigma	M1254
Nitrocelulose	Sigma	N8267	0.45 tamanho de poro
Solução de acetato de pentila	Sigma	46022
Etanol Puro	Sigma	2860
QPDs	UDT	DLS-20	D Position Detecto
Rhodamine BSA	Molecular Probes	A23016
Rhodamine Phalloidin	Sigma	P1951
Contas de sílica	Bangslabs	SS04N	1.21 mm, 10% sólidos
Azida de sódio	Proteína Sigma	S2002
Streptavidin	Sigma	189730