Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

Resumo

Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

Resumo

A retina de pintinhos tem sido um importante sistema modelo em neurobiologia do desenvolvimento, com vantagens que incluem seu grande tamanho, rápido desenvolvimento e acessibilidade para visualização e manipulações experimentais. No entanto, sua principal limitação técnica tem sido a falta de abordagens robustas de perda de função para análises de função gênica. Este protocolo descreve uma metodologia de silenciamento gênico na retina de pintinhos em desenvolvimento que envolve a expressão transgênica de microRNAs artificiais (miRNAs) usando o sistema transposon Tol2. Nesta abordagem, um plasmídeo transposon Tol2 que contém um de expressão para o marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) e sequências artificiais de pré-miRNA contra um gene alvo é introduzido na retina embrionária de pintinhos com uma construção de expressão de transposase de Tol2 por eletroporação in ovo . Nas células retinianas transfectadas, a transposase catalisa a excisão do de expressão do vetor transposon e sua integração nos cromossomos do hospedeiro, levando à expressão estável de miRNAs e da proteína EmGFP. Em nosso estudo anterior, demonstramos que a expressão de Nel, uma glicoproteína que exerce múltiplas funções no desenvolvimento neural, pode ser significativamente suprimida na retina de pintinhos em desenvolvimento usando esta técnica. Nossos resultados indicam que esta metodologia induz uma supressão estável e robusta da expressão gênica e, portanto, fornece uma abordagem eficiente de perda de função para estudos do desenvolvimento da retina.

Introdução

A retina de vertebrados é um importante sistema modelo para o estudo do desenvolvimento neural. Apesar de sua localização periférica, a retina é anatômica e em desenvolvimento uma extensão do sistema nervoso central, e o nervo óptico, que consiste em axônios de células ganglionares da retina, representa um trato dentro do sistema nervoso central. A retina de pintinhos tem vantagens significativas como um sistema modelo para estudar o mecanismo molecular do desenvolvimento neural: é grande e se desenvolve rapidamente; tem semelhanças estruturais e funcionais com a retina humana; É altamente acessível para visualização e manipulações experimentais. Mecanismos moleculare....

Protocolo

1. Construção de vetores de expressão de miRNA

NOTA: Os procedimentos para a construção de vetores de expressão de miRNA (etapas 1.1-1.3, 1.5-1.6.) são otimizados para o kit de expressão de miRNA, Block-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP, conforme descrito anteriormente^15,16. O kit fornece o vetor de expressão projetado para permitir a expressão de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), um vetor de controle (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-plasmídeo de controle negativo), reagentes acessórios e instruções para produzir vetores de expressão de miRNA (ver Tabela de M....

Resultados

Construção de construtos de transposon Tol2 para expressão de miRNAs artificiais contra Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; também conhecido como Nell2) é uma glicoproteína extracelular. Apresenta semelhanças estruturais com a trombospondina-1 e é predominantemente expressa no sistema nervoso^20,21. Demonstramos anteriormente que o Nel regula a diferenciação e a sobrevivência das células ganglionares da reti.......

Discussão

Este protocolo fornece um guia detalhado para o silenciamento gênico na retina de pintinhos em desenvolvimento pela expressão transgênica de miRNAs artificiais usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2.

Os seguintes fatores são de fundamental importância para a realização bem-sucedida desta técnica. Primeiro, é fundamental usar sequências de miRNA que são confirmadas para exercer efeitos knockdown robustos. Antes de aplicá-los para eletroporação in ovo , teste s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha de 18 G, 2"	VWR	89219-320
Kit AP-TAG A e kit AP-TAG B	GenHunter Corp	Q201 e Q202	Vetores de plasmídeo para fazer proteínas de fusão AP (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi Designer	Invitrogen		Uma ferramenta online para escolher sequências-alvo e projetar sequências pré-miRNA (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mg	Cabos Sigma-Aldrich	A2153
C115CB	Cabos Sonidel	C115CB	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117	Cabos Sonidel	C117	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Tubos capilares com fibra de ponto ômega (agulhas de micropipeta)	FHC	30-30-1	1 mm OD 0,75 mm ID
CUY21 eletroporador de onda quadrada	Nepa Gene	CUY21
Dietanolamina (pH 9,8)	Sigma-Aldrich	D8885
Microscópio
Ovo incubadora	Kurl	B-Lab-600-110	https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Suporte de eletrodo	Sonidel	CUY580	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
Eletrodos	Nepa Gene	CUY611P3-1	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10B	Invitrogen	18290-015	Células E. coli eletrocompetentes
Verde rápido FCF	Sigma-Aldrich	F7258
Ovos de galinha fertilizados (Gallus gallus)	Obtidos de fornecedores comerciais (por exemplo, Charles River) ou agricultores
Fonte de luz
pescoço de ganso Reagente de transfecção FuGene 6 Promega		E2691
Seringa Hamilton (50 μ L)	Sigma-Aldrich	20715	Hamilton Cat No  80901
Solução salina balanceada Hanks	Sigma-Aldrich	H6648
Óleo mineral pesado	Sigma-Aldrich	330760
HEPES	GIBCO	15630080
L-Homoarginina	Sigma-Aldrich	H10007
MgCl2	Sigma-Aldrich	13112
Micromanipulador	Narishige (Japão)	MM3	http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Extrator de micropipeta	Instrumento do obturador	P97
p-nitrofenilfosfato	Sigma-Aldrich	20-106
PBS	Sigma-Aldrich	D8662
pCAGGS-T2TP vetor			plasmídeo de expressão da transposase Tol2. Um generoso presente gentil de Koichi Kawakami (Instituto Nacional de Genética, Japão). Também disponível na Addgene.
Pfu	ThermoFisher	F566S
Picospritzer (Opcional)	Sistema de microinjeção de pressão	Parker
Kit maxi de plasmídeo	Qiagen	12163	Kit maxiprep de plasmídeo
vetor pT2K-CAGGS vetor			de transposon Tol2. Gentilmente cedido por Yoshiko Takahashi (Universidade de Kyoto, Japão)
Tubo de PVC	VWR (Reino Unido)	228-3830
Spectinomicina	Sigma-Aldrich	S9007-5
T4 DNA ligase	Promega	M1801
O kit de expressão de RNA BLOCK-iT Pol II miR com EmGFP	Invitrogen	K493600	Contém o vetor de expressão de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), um vetor de controle (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-plasmídeo de controle negativo), reagentes acessórios e instruções (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
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