Artigo de método

Um modelo cirúrgico modificado de isquemia de membros traseiros em ApoE-/- Ratos usando uma incisão em miniatura

DOI:

10.3791/62402

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13 de maio de 2021

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1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo demonstra uma abordagem cirúrgica eficiente para estabelecer isquemia aguda em camundongos com uma pequena incisão. Essa abordagem pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo deste estudo é introduzir e avaliar uma abordagem cirúrgica modificada para induzir isquemia aguda em camundongos que podem ser implementados na maioria dos laboratórios animais. Ao contrário da abordagem convencional para a dupla ligadura da artéria femoral (DLFA), foi feita uma incisão menor na região inguinal direita para expor a artéria femoral proximal (FA) para a realização de DLFA. Em seguida, utilizando uma sutura 7-0, a incisão foi arrastada para a região do joelho para expor a ressonância magnética distal (RM) em membros traseiros bilaterais foi usada para detectar oclusão da FA após a cirurgia. Aos 0, 1, 3, 5 e 7 dias após a cirurgia, a recuperação funcional dos membros posteriores foi avaliada visualmente e avaliada por meio da escala de Tarlov. A avaliação histológica foi realizada após eutanásia dos animais 7 dias após a DLFA. Os procedimentos foram realizados com sucesso na perna direita em dez ApoE-/- camundongos, e nenhum camundongo morreu durante observação subsequente. Os tamanhos de incisão em todos os 10 camundongos foram inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Os resultados da ressonância mostraram que o fluxo sanguíneo da FA no lado isquêmico estava claramente bloqueado. Os resultados da escala tarlov demonstraram que a função do membro traseiro diminuiu significativamente após o procedimento e se recuperou lentamente nos 7 dias seguintes. A avaliação histólógica mostrou uma resposta inflamatória significativa no lado isquêmico e reduziu a densidade microvascular no membro traseiro isquêmico. Em conclusão, este estudo introduz uma técnica modificada usando uma incisão em miniatura para realizar isquemia de membros traseiros (HLI) utilizando DLFA.

Introdução

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Há necessidade não atendida de modelos animais pré-clínicos para pesquisas em doenças vasculares, como a doença arterial periférica (PAD). Apesar dos desenvolvimentos avançados no diagnóstico e tratamento, houve mais de 200 milhões de pacientes com PAD em2018 1, e seu número está constantemente aumentando. Embora várias novas abordagens terapêuticas2,3,4,5,6,7 tenham sido descritas, a tradução bem sucedida dessas modalidades terapêuticas para a aplicação clínica continua sendo uma tarefa assustadora. Portanto, modelos experimentais in vivo confiáveis e relevantes que simulam a condição da doença humana são necessários para investigar o mecanismo potencial e a eficiência dessas novas abordagens terapêuticas para tratar o PAD6,7.

Hiperlipidemia e aterosclerose (AS) são os principais fatores de risco para o desenvolvimento do PAD. Os camundongos apoE(em uma dieta rica em gordura) apresentam metabolismo de gordura anormal e hiperlipidemia e, posteriormente, desenvolvem placas ateroscleróticas que tornam a ApoE-/- camundongos como a melhor escolha para simular o PAD clinicamente relevante. Os modelos de animais HLI pré-clínicos são gerados por meio da dupla ligadura da artéria femoral (DLFA), que é a abordagem mais utilizada em laboratórios em todo o mundo8,9,10,11,12,13,14,15 para simular isquemia aguda-on-crônica. No entanto, essa abordagem geralmente requer uma incisão relativamente grande e invasiva. Além disso, inevitavelmente leva os animais (especialmente camundongos) a sofrer de aumento da dor e inflamação, o que também influencia os resultados experimentais subsequentes5,6,16,17. Este artigo descreve um modelo HLI agudo-on-crônico em APOE-/- camundongos usando uma incisão muito pequena.

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Protocolo

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NOTA: Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a diretriz da CE EC 2010/63/UE e foram aprovados pela legislação alemã local (35-9185.81/G[1]239/18). Dez ApoEmasculinos -/- camundongos com fundo C57BL/6J, pesando 29,6-38,0 g, foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas e alimentaram uma dieta ocidental (1,25% de colesterol e 21% de gordura) e ad libitum de água por 12 semanas a partir da idade de 8 semanas. O HLI foi realizado em camundongos de 20 semanas de idade, conforme descrito abaixo.

1. Indução de HLI em ApoE-/- camundongos

  1. Preparar os equipamentos e ferramentas necessários para a cirurgia (ver a Tabela de Materiais e Figura 1). Esterilize os instrumentos cirúrgicos através de autoclaving antes do uso e use um esterilizador de contas de vidro durante a operação.
  2. Anestesiar o camundongo com injeção subcutânea (S.C.) de uma mistura de midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,05 mg/ml/kg) e fentanil (0,5 mg/kg) antes de todos os procedimentos cirúrgicos.
    1. Após o início da anestesia, use a pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento e confirme a ausência do reflexo de retirada do pedal no membro dianteiro e traseiro.
  3. Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do núcleo do corpo em aproximadamente 37 °C. Usando cotonetes de algodão e creme de depilação, remova cuidadosamente o cabelo da pele do membro traseiro do lado direito.
    NOTA: O creme de depilação deve ser usado em quantidade suficiente para cobrir a cetim traseira, especialmente a região inguinal onde a incisão será feita. O creme de depilação deve ser usado por uma duração inferior a 3 minutos e deve ser posteriormente removido com cotonetes umedecidos de algodão de 2 a 3 vezes.
  4. Coloque o mouse na posição supina na almofada de aquecimento sob um microscópio dissecando. Use um antisséptico de pele (ver a Tabela de Materiais) para desinfetar a pele do camundongo. Posteriormente, use fórceps pontiagudas e tesoura cirúrgica para fazer uma incisão de aproximadamente 3-4 mm no meio da região inguinal. Consulte a Figura 2 para um esquema do procedimento.
  5. Remova cuidadosamente o tecido adiposo subcutâneo com a ajuda de fórceps pontiagudas finos para expor o feixe neurovascular femoral proximal. Use cuidadosamente os fórceps pontiagudos finos para perfurar a membrana da bainha femoral. Use um cotonete umedecido com soro fisiológico para mover a artéria femoral (FA) cuidadosamente longe do nervo femoral (FN) e veia femoral (FV).
  6. Passe duas suturas absorvíveis 7-0 através da FA proximal, e faça nós duplos usando tesouras de mola para transectar a FA entre os dois laços.
  7. Para expor a FA distal, passe uma sutura 7-0 absorvível através da borda inferior da incisão e arraste suavemente a incisão para a região do lado direito do joelho do membro traseiro.
  8. Mova o tecido subcutâneo de lado cuidadosamente para expor o feixe neurovascular. Use fórceps pontiagudos finos para perfurar a membrana da bainha femoral, e dissecar a FA da FV e FN.
  9. Passe duas suturas absorvíveis 7-0 através da FA distal, e faça nós duplos. Use uma tesoura de mola para transectar a FA entre os dois laços.
    NOTA: Não foi realizada ligadura no membro esquerdo, que serviu como controle em cada rato.
  10. Depois, use suturas absorvíveis 6-0 para costurar a incisão. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa e continue monitorando seus parâmetros vitais até a recuperação. Fornecer analgésicos pós-operatórios: Buprenorfina s.c. (0,1 mg/kg de peso corporal a cada 8 horas durante 48 h). 48 h após a operação, administrar metamizole em água potável (24 mg/5mL de água corresponde a uma dose de 200 mg/kg 4 vezes por dia).

2. Ressonância magnética

NOTA: Um dia após a DLFA, os camundongos devem ser submetidos a ressonâncias magnéticas para avaliar o bloqueio da FA.

  1. Coloque o mouse em uma câmara de indução transparente e anestesia o mouse com isoflurane de 1,5-2% no ar ambiente até a perda do reflexo de retração.
  2. Coloque o mouse em uma cama de animal aquecida equipada com um suporte de mordida e posicionada em direção ao ímã com um sistema controlado por laser. Mantenha a temperatura do corpo em 37±1 °C.
  3. Durante a aquisição de imagens, mantenha a anestesia com 1,5-2% de isoflurane no ar ambiente, e monitore a respiração usando uma sonda de pressão.
  4. Adquira imagens na orientação de fatia transversal usando uma sequência de angiografia tridimensional (3D) com tempo de eco de parâmetro (TE)/tempo de repetição (TR)/flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, quatro médias, uma matriz de aquisição de 178 x 144 reconstruída para 256 x 192 e 121 fatias, resultando em uma resolução isotrópica de 0,15 mm3. Para suprimir o sinal das veias, coloque uma fatia de saturação distally para os membros traseiros.

3. Avaliação clínica e acompanhamento

  1. Estime a recuperação funcional nos1º,3º,5ºe7º dias após a cirurgia utilizando a pontuação funcional Tarlov escala18,19 (Tabela 1).

4. Avaliação histológica

  1. Sete dias após a cirurgia, aplique injeção pentobarbital (115 mg/kg) para eutanásia dos camundongos.
  2. Solução salina tamponada de fosfato perfuse (PBS) contendo 1% de paraformaldeído (PFA) através do ventrículo cardíaco esquerdo (100 mL por rato). Fixar o gastrocnemius bilateral (Gm) dos camundongos em 4% pfa durante a noite a 4 °C.
  3. Incorporar a amostra em parafina de acordo com o protocolo descrito anteriormente20.
    1. Corte seções de 4-5 μm de espessura do bloco de tecido embutido em parafina em um microtome. Com a ajuda de uma escova de tinta redonda, coloque as seções de tecido cortado no banho de água mantidas a 42°C.
    2. Insira o slide do microscópio na água em um ângulo de 45° e posicione-o cuidadosamente sob o grupo de seções a serem coletadas.
    3. Levante cuidadosamente o escorregador da água e deixe que as seções se conectem ao escorregador e seque durante a noite na incubadora de bancada a 37 °C.
  4. Realizar a coloração de hematoxilina/eosina (HE) das seções de parafina.
    1. Coloque os slides contendo as seções em suportes de slides. Prepare 3 recipientes de xileno fresco e coloque os slides em cada recipiente por 5 minutos para desparafinar as seções.
    2. Reidratar as seções mergulhando as fatias sucessivamente em 96%, 80%, 70%, 50%, 30% etanol e água deionizada por 5 min cada.
    3. Mancha na solução de hematoxilina por 10 minutos.
    4. Transfira as fatias para um recipiente de água deionizada e enxágue colocando sob água da torneira por 5 minutos.
    5. Usando um microscópio, verifique a intensidade da coloração da hematoxilina. Se a coloração permitir a identificação dos núcleos celulares claramente, continue para o próximo passo. Se a intensidade de coloração não facilitar a identificação dos núcleos celulares ou se a intensidade da coloração for fraca, coloque o slide na solução de hematoxilina por 1 min, repita a lavagem com água (passo 4.4.4) e depois verifique novamente.
    6. Contra-retenção na solução eosin-Y por 5 min.
    7. Desidratar as seções mergulhando as fatias sucessivamente em recipientes contendo água desionizada e 30%, 50%, 70%, 80% e 96% de etanol sucessivamente por uma duração de 10 s cada. Em seguida, coloque as seções sequencialmente em três recipientes de xileno fresco por 10 s cada.
    8. Coloque os slides horizontalmente em mapas microscópicos de armazenamento de slides com as seções voltadas para cima. Adicione o meio de montagem suficiente no slide e monte os slides com tampas.
  5. Realizar a coloração imunohistoquímica (IHC) das seções de parafina.
    1. Repetição de desparaffinização e reidratação passos 4.4.1-4.4.2. Em seguida, mergulhe as seções em um recipiente com tampão citrato de sódio de 10 mM, pH 6, e leve a amostra para ferver em um micro-ondas.
      NOTA: Como o excesso ou o aquecimento excessivo das amostras pode causar manchas inconsistentes, mantenha a temperatura um pouco abaixo do ponto de ebulição por 10 minutos.
    2. Em seguida, esfrie as seções em um banco por 30 minutos. Depois disso, lave as seções na PBS três vezes por 5 minutos. Seque cuidadosamente a área ao redor da amostra, e desenhe um grande círculo em torno da amostra usando uma caneta hidrofóbica. .
      NOTA: Nunca toque na amostra. A marcação com uma caneta hidrofóbica cria um limite hidrofóbico, o que facilita o uso de um volume menor de solução de anticorpos.
    3. Sacie a atividade de peroxidase endógena colocando a seção em 0,3% H2O2 na PBS por 10 minutos. Seções de bloco com 400 μL de tampão de bloco (PBS contêm 3% de albumina de soro bovino e 0,3% de detergente não iônico) para 1 h à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
    4. Lave as seções em PBS por 5 minutos. Em seguida, adicione 100-400 μL de anticorpo anti-CD31 diluído (1:250) o suficiente para cobrir a seção. Na sequência, incubar seções durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada.
      NOTA: Certifique-se de que a seção está completamente coberta com a solução de anticorpos.
    5. Remova o anticorpo primário e lave as seções três vezes em PBS por uma duração de 5 minutos cada.
    6. Prepare a mistura de 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) adicionando 1 gota do concentrado DAB a 1 mL do diluente DAB e misture bem. Em seguida, adicione 100-400 μL de mistura DAB às seções e monitore de perto por olho por 2 minutos até que seja observada uma intensidade de coloração aceitável.
      NOTA: Certifique-se de que a seção está completamente coberta com a mistura DAB.
    7. Depois, enxágue sob água da torneira por 5 minutos. Realizar a coloração de hematoxilina conforme descrito nas etapas 4.4.3-4.4.5.
    8. Realizar coloração eosin-Y descrita na etapa 4.4.6. Realizar etapas de desidratação descritas na etapa 4.4.7.
    9. Montei as seções com tampas usando meio de montagem. Use o ImageJ para estimar o percentual de área positiva cd31 (%) em 5 campos selecionados aleatoriamente (40x) que podem ser considerados como densidade microvascular como descrito anteriormente21.

5. Análise estatística

  1. Use software de análise estatística para expressar os resultados como ± desvio padrão médio e para realizar teste tnão remunerado nas comparações. Considere P < 0,05 como estatisticamente significante.

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Resultados

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Características do ApoE-/- ratos
As cirurgias de DLFA foram realizadas com sucesso em 10 camundongos para estabelecer o modelo HLI, e nenhum dos camundongos morreu após o procedimento. Para acompanhar as mudanças no peso corporal, os camundongos foram pesados antes do procedimento DLFA (Pré-DLFA) e 7 dias após a cirurgia de DLFA (Pós-DLFA). Os pesos pré-DLFA variaram de 29,6 a 38,0 g (média de 34,74 ± 2,47 g), e os pesos pós-DLFA variaram de 26.5 a 34,1 g ...

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Discussão

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Este estudo relata uma abordagem modificada, simplificada e cirurgicamente eficiente para estabelecer um modelo HLI em ApoE-/- camundongos usando ligadura dupla nas regiões proximais e distais da FA através de uma incisão de 3-4 mm sem quaisquer atualizações laboratoriais necessárias. A principal característica deste método é o tamanho menor da incisão em comparação com estudos relatados anteriormente descrevendo os modelos HLI do mouse8,9,<...

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Divulgações

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Os autores declaram que o conteúdo do artigo foi composto na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a Viktoria Skude, Alexander Schlund e Felix Hörner pelo excelente apoio técnico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x tampão fosfato salino Roth9143.1Usado para coloração de hematoxilina e eosina e coloração de imunohistoquímica
30% H2O2Roth9681.2Usado para coloração de imunohistoquímica
6-0 suturas absorvíveisPROLENE8776HUsado para costurar a pele
6-0 sutura absrogávelPROLENEEP8706Usado em cirurgia
7-0 suturas absorvíveisPROLENEEH8021EUsado para ligar a artéria
7-0 sutura absrogávelPROLENEEP8755Usado em cirurgia
Ácido acéticoRoth6755.1Usado para coloração de hematoxilina e eosina
Albumina Fraktion VRoth8076.2Usado para coloração imuno-histoquímica
AutoclaveSystec GmbHSystec VX-150Utilizado para a esterilização dos instrumentos cirúrgicos
Microscópio Axio vert A1Carl ZeissZEISS Axio Vert.A1Utilizado para visualizar e tirar fotografias da coloração de hematoxilina e eosina e coloração de imuno-histoquímica
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/ADigitalizar o bloqueio da artéria femoral
Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)Usado no tratamento da dor pós-operatória. Dose - 0,1 mg/kg de peso corporal a cada 8 horas por 48 h após a operação
Anticorpo CD31Abcamab28364Usado para coloração imuno-histoquímica
Solução de eosina Y 0,5% em águaRothX883.1Usado para coloração de hematoxilina e eosina
Solução de recuperação de epítopos pH 6Leica Biosystems6046945Usado para coloração imuno-histoquímica
Etanol ≥ 99,5 %Roth5054.1Usado para coloração de hematoxilina e eosina e coloração imuno-histoquímica
FentanilCayman Chemical437-38-7Usado para anestesia
Pinça de ponta finaMedixplus93-4505SUsado para separar a artéria do nervo e da veia
Esterilizador de esferas de vidroSimon KellerTipo 250Usado para esterilização dos instrumentos cirúrgicos
Graefe iris fórceps curvoVUBUVUBU-02-72207Usado para separação romba de pele e tecido subcutâneo
Creme removedor de pelos, Veet (com aloe vera)Reckitt Benckiser108972Remover pelos dos membros posteriores de camundongos
Placa de aquecimentoSTÖ RK-TRONIC7042092Manter a temperatura de satble de camundongos
HematoxilinaRothT865.2Usado para coloração de hematoxilina e eosina e coloração de imuno-histoquímica
Microscópio cirúrgico Leica LeicaM651Ampliar o campo de visão para facilitar a operação
Sistema de Cromogênio Líquido DAB + SubstratoDakoK3468Usado para coloração
de imuno-histoquímicaMacho ApoE-/- camundongosCharles River LaboratoriesN/AUsado para estabelecer o modelo de camundongos com doença arterial periférica
MedetomidineCayman Chemical128366-50-7Usado para anestesia
Micro Needle HolderPreto & Preto CirúrgicoB3B-18-8Segurando a agulha
Micro sutura amarrando fórcepsLife Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145Usado para auxiliar no nó durante a cirurgia
Microtome BiobaseBk-Mt268mUsado para seccionamento de tecido
MidazolamRatiopharm44856.01.00Usado para anestesia
Sistema de Monitoramento e Gating de Pequenos Animais compatível com RM Modelo 1025SA InstrumentsN/amonitoramento dos sinais vitais do animal durante a ressonância magnética
Octeniderm farblosSchü lke & Mayr GmbH180212usado para desinfecção da pele
Pomada para os olhos e narizBayer AG1578675Mantenha os olhos molhados sob a anestesia
ParaformaldeídoRoth0335.1Usado para fixação do tecido
PentobarbitalNembutal76-74-4Usado para anestesia
Solução salinaDeltaSelect1299.99.99Usado para anestesia
mola lidar com tesoura com pontas finas e afiadasPreto & Preto CirúrgicoB66167Usado para cortar a artéria
SuperCut TesouraPreto & Cirúrgico PretoB55992Usado para cortar a pele
Triton X-100Roth9002-93-1Usado para mancha imunohistoquímica
Dieta ocidental, 1,25% de colesterolssniff Spezialdiä ten GmbHE15723-34Dieta para camundongos
XilenoRoth4436.3Usado para coloração de hematoxilina e eosina e coloração imuno-histoquímica

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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