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Artigo de método

Um modelo cirúrgico modificado de isquemia de membros traseiros em ApoE-/- Ratos usando uma incisão em miniatura

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DOI:

10.3791/62402

13 de maio de 2021

Neste artigo

Resumo

Este artigo demonstra uma abordagem cirúrgica eficiente para estabelecer isquemia aguda em camundongos com uma pequena incisão. Essa abordagem pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.

Resumo

O objetivo deste estudo é introduzir e avaliar uma abordagem cirúrgica modificada para induzir isquemia aguda em camundongos que podem ser implementados na maioria dos laboratórios animais. Ao contrário da abordagem convencional para a dupla ligadura da artéria femoral (DLFA), foi feita uma incisão menor na região inguinal direita para expor a artéria femoral proximal (FA) para a realização de DLFA. Em seguida, utilizando uma sutura 7-0, a incisão foi arrastada para a região do joelho para expor a ressonância magnética distal (RM) em membros traseiros bilaterais foi usada para detectar oclusão da FA após a cirurgia. Aos 0, 1, 3, 5 e 7 dias após a cirurgia, a recuperação funcional dos membros posteriores foi avaliada visualmente e avaliada por meio da escala de Tarlov. A avaliação histológica foi realizada após eutanásia dos animais 7 dias após a DLFA. Os procedimentos foram realizados com sucesso na perna direita em dez ApoE-/- camundongos, e nenhum camundongo morreu durante observação subsequente. Os tamanhos de incisão em todos os 10 camundongos foram inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Os resultados da ressonância mostraram que o fluxo sanguíneo da FA no lado isquêmico estava claramente bloqueado. Os resultados da escala tarlov demonstraram que a função do membro traseiro diminuiu significativamente após o procedimento e se recuperou lentamente nos 7 dias seguintes. A avaliação histólógica mostrou uma resposta inflamatória significativa no lado isquêmico e reduziu a densidade microvascular no membro traseiro isquêmico. Em conclusão, este estudo introduz uma técnica modificada usando uma incisão em miniatura para realizar isquemia de membros traseiros (HLI) utilizando DLFA.

Introdução

Há necessidade não atendida de modelos animais pré-clínicos para pesquisas em doenças vasculares, como a doença arterial periférica (PAD). Apesar dos desenvolvimentos avançados no diagnóstico e tratamento, houve mais de 200 milhões de pacientes com PAD em2018 1, e seu número está constantemente aumentando. Embora várias novas abordagens terapêuticas2,3,4,5,6,7 tenham sido descritas, a tradução bem sucedida dessas modalidades terapêuticas para a apli....

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Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a diretriz da CE EC 2010/63/UE e foram aprovados pela legislação alemã local (35-9185.81/G[1]239/18). Dez ApoEmasculinos -/- camundongos com fundo C57BL/6J, pesando 29,6-38,0 g, foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas e alimentaram uma dieta ocidental (1,25% de colesterol e 21% de gordura) e ad libitum de água por 12 semanas a partir da idade de 8 semanas. O HLI foi realizado em camundongos de 20 semanas de idade, conforme descrito abaixo.

1. Indução de HLI em ApoE-/- camundongos

  1. Preparar os equipamentos e ferrament....

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Resultados

Características do ApoE-/- ratos
As cirurgias de DLFA foram realizadas com sucesso em 10 camundongos para estabelecer o modelo HLI, e nenhum dos camundongos morreu após o procedimento. Para acompanhar as mudanças no peso corporal, os camundongos foram pesados antes do procedimento DLFA (Pré-DLFA) e 7 dias após a cirurgia de DLFA (Pós-DLFA). Os pesos pré-DLFA variaram de 29,6 a 38,0 g (média de 34,74 ± 2,47 g), e os pesos pós-DLFA variaram de 26.5 a 34,1 g .......

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Discussão

Este estudo relata uma abordagem modificada, simplificada e cirurgicamente eficiente para estabelecer um modelo HLI em ApoE-/- camundongos usando ligadura dupla nas regiões proximais e distais da FA através de uma incisão de 3-4 mm sem quaisquer atualizações laboratoriais necessárias. A principal característica deste método é o tamanho menor da incisão em comparação com estudos relatados anteriormente descrevendo os modelos HLI do mouse8,9,<.......

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Divulgações

Os autores declaram que o conteúdo do artigo foi composto na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Viktoria Skude, Alexander Schlund e Felix Hörner pelo excelente apoio técnico.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x tampão fosfato salino Roth9143.1Usado para coloração de hematoxilina e eosina e coloração de imunohistoquímica
30% H2O2Roth9681.2Usado para coloração de imunohistoquímica
6-0 suturas absorvíveisPROLENE8776HUsado para costurar a pele
6-0 sutura absrogávelPROLENEEP8706Usado em cirurgia
7-0 suturas absorvíveisPROLENEEH8021EUsado para ligar a artéria
7-0 sutura absrogávelPROLENEEP8755Usado em cirurgia
Ácido acéticoRoth6755.1Usado para coloração de hematoxilina e eosina
Albumina Fraktion VRoth8076.2Usado para coloração imuno-histoquímica
AutoclaveSystec GmbHSystec VX-150Utilizado para a esterilização dos instrumentos cirúrgicos
Microscópio Axio vert A1Carl ZeissZEISS Axio Vert.A1Utilizado para visualizar e tirar fotografias da coloração de hematoxilina e eosina e coloração de imuno-histoquímica
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/ADigitalizar o bloqueio da artéria femoral
Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)Usado no tratamento da dor pós-operatória. Dose - 0,1 mg/kg de peso corporal a cada 8 horas por 48 h após a operação
Anticorpo CD31Abcamab28364Usado para coloração imuno-histoquímica
Solução de eosina Y 0,5% em águaRothX883.1Usado para coloração de hematoxilina e eosina
Solução de recuperação de epítopos pH 6Leica Biosystems6046945Usado para coloração imuno-histoquímica
Etanol ≥ 99,5 %Roth5054.1Usado para coloração de hematoxilina e eosina e coloração imuno-histoquímica
FentanilCayman Chemical437-38-7Usado para anestesia
Pinça de ponta finaMedixplus93-4505SUsado para separar a artéria do nervo e da veia
Esterilizador de esferas de vidroSimon KellerTipo 250Usado para esterilização dos instrumentos cirúrgicos
Graefe iris fórceps curvoVUBUVUBU-02-72207Usado para separação romba de pele e tecido subcutâneo
Creme removedor de pelos, Veet (com aloe vera)Reckitt Benckiser108972Remover pelos dos membros posteriores de camundongos
Placa de aquecimentoSTÖ RK-TRONIC7042092Manter a temperatura de satble de camundongos
HematoxilinaRothT865.2Usado para coloração de hematoxilina e eosina e coloração de imuno-histoquímica
Microscópio cirúrgico Leica LeicaM651Ampliar o campo de visão para facilitar a operação
Sistema de Cromogênio Líquido DAB + SubstratoDakoK3468Usado para coloração
de imuno-histoquímicaMacho ApoE-/- camundongosCharles River LaboratoriesN/AUsado para estabelecer o modelo de camundongos com doença arterial periférica
MedetomidineCayman Chemical128366-50-7Usado para anestesia
Micro Needle HolderPreto & Preto CirúrgicoB3B-18-8Segurando a agulha
Micro sutura amarrando fórcepsLife Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145Usado para auxiliar no nó durante a cirurgia
Microtome BiobaseBk-Mt268mUsado para seccionamento de tecido
MidazolamRatiopharm44856.01.00Usado para anestesia
Sistema de Monitoramento e Gating de Pequenos Animais compatível com RM Modelo 1025SA InstrumentsN/amonitoramento dos sinais vitais do animal durante a ressonância magnética
Octeniderm farblosSchü lke & Mayr GmbH180212usado para desinfecção da pele
Pomada para os olhos e narizBayer AG1578675Mantenha os olhos molhados sob a anestesia
ParaformaldeídoRoth0335.1Usado para fixação do tecido
PentobarbitalNembutal76-74-4Usado para anestesia
Solução salinaDeltaSelect1299.99.99Usado para anestesia
mola lidar com tesoura com pontas finas e afiadasPreto & Preto CirúrgicoB66167Usado para cortar a artéria
SuperCut TesouraPreto & Cirúrgico PretoB55992Usado para cortar a pele
Triton X-100Roth9002-93-1Usado para mancha imunohistoquímica
Dieta ocidental, 1,25% de colesterolssniff Spezialdiä ten GmbHE15723-34Dieta para camundongos
XilenoRoth4436.3Usado para coloração de hematoxilina e eosina e coloração imuno-histoquímica

Referências

  1. Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
  2. Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic ....

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Ligação da Artéria FemoralCamundongos ApoE KnockoutCirurgia de Incisão MiniaturaTécnica de Ligação DuplaImagem por Ressonância MagnéticaAvaliação pela Escala de TarlovDensidade MicrovascularLesão por Isquemia-ReperfusãoAvaliação Histológica