Mancha imunofluorescente para visualização de proteínas associadas à heterocromatina em glândulas salivares drosophila

Resumo

Este protocolo visa visualizar agregados de heterocromatina em células de politento de Drosophila.

Resumo

A visualização dos agregados de heterocromatina por imunostaining pode ser desafiadora. Muitos componentes mamíferos da cromatina são conservados em Drosophila melanogaster. Portanto, é um excelente modelo para estudar a formação e manutenção da heterocromatina. Células politenizadas, como as encontradas nas glândulas salivares da terceira instar D. melanogaster larvas, fornecem uma excelente ferramenta para observar a cromatina amplificada quase mil vezes e permitiram aos pesquisadores estudar mudanças na distribuição de heterocromatina no núcleo. Embora a observação dos componentes da heterocromatina possa ser realizada diretamente nas preparações cromossômicas de politento, a localização de algumas proteínas pode ser alterada pela gravidade do tratamento. Portanto, a visualização direta da heterocromatina nas células complementa esse tipo de estudo. Neste protocolo, descrevemos as técnicas de imunossuagem utilizadas para este tecido, o uso de anticorpos fluorescentes secundários e a microscopia confocal para observar esses agregados de heterocromatina com maior precisão e detalhe.

Introdução

Desde os primeiros estudos de Emil Heitz¹, a heterocromatina tem sido considerada um importante regulador de processos celulares, como expressão genética, separação meiomática e mitótica de cromossomos, e a manutenção da estabilidade do genoma^2,3,4.

A heterocromatina é dividida principalmente em dois tipos: heterocromatina constitutiva que define caracteristicamente sequências repetitivas, e elementos transposáveis que estão presentes em locais específicos do cromossomo, como os telômeros e os centrosmers. Este tipo de heterocromatina é definida principalmente epigeneticamente por marcas de histona específicas, como a di ou tri-metilação de lysina 9 de histona H3 (H3K9me3) e a ligação da proteína heterocromatina 1a (HP1a)^5,6. Por outro lado, a heterocromatina facultativa localiza através dos braços do cromossomo e consiste principalmente em genes silenciados de desenvolvimento^7,8. A imunossuagem de blocos de heterocromatina em células metafósicas, ou a observação de agregados de heterocromatina em células interfásicas, revelou muita luz no entendimento da formação e função das regiões heterocromáticas⁹.

O uso de Drosophila como sistema modelo permitiu o desenvolvimento de ferramentas essenciais para estudar heterocromatina sem o uso de microscopia eletrônica¹⁰. Desde a descrição da variegação do efeito de posição e a descoberta de proteínas associadas à heterocromatina, como hp1a, e modificações pós-translacionais de histona, muitos grupos desenvolveram várias técnicas imunohistoquímicas que permitem a visualização dessas regiões heterocromáticas^10,11.

Essas técnicas baseiam-se no uso de anticorpos específicos que reconhecem proteínas associadas à heterocromatina ou marcas de histona. Para cada tipo de célula e anticorpo, as condições de fixação e permeabilização devem ser determinadas empiricamente. Além disso, as condições podem variar se forem utilizados processos mecânicos adicionais, como técnicas de esmagamento. Neste protocolo, descrevemos o uso de glândulas salivares drosophila para estudar focos heterocromáticos. As glândulas salivares possuem células politensas que contêm mais de 1.000 cópias do genoma, fornecendo assim uma visão amplificada da maioria das características da cromatina, com exceção do DNA do satélite e algumas regiões heterocromáticas que estão sob replicação. No entanto, as regiões heterocromatinas são facilmente visualizadas em preparações cromossômicas de politenso, mas as técnicas de esmagamento podem às vezes interromper complexos característicos ligados à cromatina ou a arquitetura cromatina. Portanto, a imunolocalização de proteínas em tecido de glândula salivar inteira pode superar esses efeitos indesejados. Usamos este protocolo para detectar várias proteínas ligadas à cromatina, e demonstramos que este protocolo combinado com os estoques mutantes de Drosophila pode ser usado para estudar a interrupção da heterocromatina¹².

Protocolo

1. Terceira cultura de larvas instar

1. Prepare 1 litro de mídia padrão adicionando 100 g de levedura, 100 g de açúcar de cana inteiro não refinado, 16 g de ágar, 10 mL de ácido propiônico e 14 g de gelatina. Dissolva todos os ingredientes, exceto o fermento em 800 mL de água da torneira e, em seguida, dissolva a levedura. Autoclave imediatamente por 30 minutos.
   1. Depois, deixe a mídia esfriar até 60 °C e adicione ácido propiônico a uma concentração final de 0,01%. Deixe a garrafa ficar de pé até que a gelatina seja formada.
2. Para otimizar a cultura das larvas 3o instar, primeiro colete adultos idosos de 5 a 10 dias e coloque 50 (25 machos e 25 fêmeas) em uma garrafa de pescoço largo de mídia padrão.
3. Coloque a garrafa com as moscas em uma incubadora de temperatura controlada a 25 °C até que o número de ovos colocados seja de 50 (aproximadamente 12 horas para a cepa do tipo selvagem).
4. Após o fim do tempo de incubação, remova os adultos e transfira-os para uma nova garrafa para repetir o procedimento. Deixe os embriões crescerem a 18 °C por 72 horas
   NOTA: Para mais informações sobre as condições de manutenção do estoque de Drosophila, consulte Tennessen & Thymmel¹³.

2. Coleta de larvas

1. Para a coleta de larvas escolha as larvas errantes que não têm espirros sempre. Após a eversão dos espirros, a larva entra no estágio prepupal, mantendo excelentes cromossomos de politenso adequados para análise. Somente após 12 horas as células da glândula salivar começam a se preparar para a morte celular programada^14,15.
2. Pegue 15 3° larvas instar e coloque-as em um copo de relógio para lavá-las. Em seguida, transfira-os para uma solução salina gelada ou PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, ajuste pH para 7,4).
3. Disseca de 15 a 30 pares de glândulas salivares (ou o máximo possível em 30 minutos) em PBS frio com inibidores de protease sob o microscópio estereoscópico. Transfira as glândulas salivares para um tubo de 1,5 mL com PBS gelado.
4. Lave uma vez com 1 mL de PBS mais inibidores de protease. Espere o tecido chegar ao fundo do tubo.
5. Após a lavagem, remova o PBS com uma pipeta de 1000 μL. Tome cuidado para não tocar no tecido.
   1. Alternativamente, disseque as glândulas salivares em 5 mL de PBS para eliminar a necessidade desta etapa de lavagem e prossiga para o passo 3, transferindo as glândulas salivares para 0,5 mL do tampão de fixação Ruvkun descrito abaixo.

3. Fixação do tecido das glândulas salivares

1. Depois de remover o PBS da última etapa, adicione diretamente 0,5 mL de 1x Ruvkun fixando buffer, com 50% de metanol (adicione 0,5 mL de metanol) e 2% de formaldeído.
   NOTA: 2x Solução Ruvkun é 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES no pH 7.4.
2. Incubar por 2 horas a 4 °C com rotação suave.

4. Lavagem do tecido das glândulas salivares

1. Realize uma lavagem de rotação de 5 minutos com 1 mL de tampão Tris/Triton (100 mM Tris pH 7.4, 1% Triton X-100 e 1 mM EDTA).
   NOTA: Aguarde que o tecido chegue ao fundo do tubo.

5. Permeabilização

1. Incubar as glândulas salivares em 1 mL de Tris/Triton X-100 (o mesmo acima). Para algumas proteínas pode ser necessário adicionar 1% β-mercaptoetanol.
2. Incubar por 2 horas a 37° C com leve agitação (300 rpm).

6. Etapa de preservação (opcional)

NOTA: Se não prosseguir imediatamente para a incubação com o anticorpo, preserve o tecido da seguinte forma.

1. Lave com 1 mL de tampão BO₃ (0,01 M H₃BO₃ pH 9,2 + 0,01 M NaOH) e depois incubar em BO₃/10 mM DTT a 37° C com leve agitação (300 rpm) por 15 minutos.
2. Ao final do período de incubação, realize uma lavagem com 1 mL de tampão BO₃ sozinho.
   NOTA: Aguarde que o tecido chegue ao fundo do tubo.
3. Adicione 1 mL de PBS. Preserve o tecido nesta solução a 4 °C por até 72 horas e, em seguida, proceda com o próximo passo. Esta etapa é particularmente útil ao trabalhar com diferentes cepas mutantes que podem apresentar um ciclo de vida atrasado, de modo que a imunodeseção pode ser realizada ao mesmo tempo junto com os controles.

7. Bloqueio de tecidos

1. Incubar as glândulas salivares em 1 mL de Tampão B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) por 2 horas em temperatura ambiente com rotação.

8. Imunostaining

1. Remova todo o buffer B e adicione o buffer A (PBS + 0,1% BSA) mais anticorpo de interesse.
   NOTA: Usamos o HP1a C1A9c (anticorpo concentrado) do Hybridoma Bank até 1:3000. Ao usar o C1A9s (supernante) tentamos de 1:100 a uma diluição de 1:500 e qualquer diluição entre esta classificação funciona bem) durante a noite a 4 oC com rotação. Neste ponto é importante que o tremor não levante bolhas que possam danificar o anticorpo.

9. Lavagem imunossante

1. Realize lavagens de 3 x 15 minutos com tampão B em movimento à temperatura ambiente usando 1 mL cada vez.
2. Transfira as glândulas para o buffer B juntamente com o anticorpo secundário acoplado a um fluoróforo por 2 horas em rotação a 4 oC (anticorpo secundário Alexa fluor 568 Invitrogen foram usados 1:3000).
   1. Cubra o tubo com papel alumínio para proteger o anticorpo secundário da luz.
3. Realizar lavagens de 2 x 15 minutos à temperatura ambiente enquanto estiver em rotação com 1 mL de Buffer B.
4. Incubar com um marcador de DNA como Otox (tomar 2 μL de estoque de 5 mM e dissolver em 1 mL de Buffer B) ou Hoechst (tomar 1 μL de 10 mg/mL de estoque e dissolver em 1 mL de Buffer B) por 10 minutos em temperatura ambiente com rotação.
5. Realize uma lavagem com tampão B e uma vez com PBS, cada lavagem com duração de 10 minutos enquanto gira à temperatura ambiente.
   NOTA: Lembre-se de protegê-lo da luz.

10. Imagem

1. Monte as glândulas salivares em um escorregador, fazendo uma piscina com uma mancha de cobertura.
2. Coloque as glândulas salivares no meio da piscina e cubra com o citifluor AF1 para evitar a formação de bolhas que estendem o líquido viscoso por todo o lugar. Em seguida, sele todos os lados com esmalte claro.
3. Observe sob uma fluorescência ou microscópio confocal. Se a amostra não for observada no mesmo dia, armazene-se longe da luz a 4 °C.
4. Use o GraphPad Prism 6 para gerar todos os gráficos e análises estatísticas.
5. Analise os dados da distribuição HP1a em glândulas salivares usando o teste Kruskal-Wallis. A significância estatística foi definida em (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****

Resultados

Resultados representativos da imunostaining HP1A nas glândulas salivares de Drosophila são mostrados na Figura 1. Um resultado positivo é observar um ponto focal (Figura 1a) (agregado heterocromático ou condensado). Um resultado negativo não é sinal ou sinal disperso. Às vezes, um sinal duplo pode ser observado, ou seja, com um ponto duplo(Figura 1c),mas geralmente ocorre em quantidades menores.

...

Discussão

A função celular dos organismos eucarióticos pode definir a estrutura 3D dentro do núcleo, que é suportada por interações entre diferentes proteínas com cromatina e várias moléculas, incluindo RNA. Nos últimos três anos, os condensados biológicos que tiveram relevância, incluindo a heterocromatina, assumiram um papel fundamental na determinação da separação de fases promovendo a distinta organização espacial nuclear da cromatina ativa e repressiva ^16,17,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Axygen MCT-150-C	marca 11351904	não crítica
16% formaldeído	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Grau de Biologia Molecular	Marca Roche	10735078001	não crítica
Inibidores de protease completos Ultra livre de EDTA protease inibidores	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22x22, marca não crítica
DTT	Sigma	d9779	marca não crítica
EDTA	Sigma	E5134	marca não crítica
EGTA			marca não crítica
Lâmina de vidro	Selo	dourado 3011	marca não crítica
H3BO3	Baker	0084-01	marca não crítica
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Forma do Produto  Concentrado 0,1 mL
KCl	Baker	3040-01	marca não crítica
Metanol	Baker	9070-03	marca não crítica
NaCl	Sigma	71376	marca não crítica
NaOH			marca não crítica
PIPES			marca não crítica
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Agitador de Tubo Labquake
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	marca não crítica
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, marca não crítica
β-mercaptoetanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, marca não crítica