Apresentamos protocolos para três métodos diferentes para a homogeneização de quatro diferentes grupos musculares de tecido muscular esquelético de ratos para medir e comparar os níveis de nitrato e nitrito. Além disso, comparamos diferentes pesos amostrais para investigar se o tamanho da amostra tecidual afeta os resultados da homogeneização.
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Artigo de método
Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Íons de nitrato (NO3-) já foram pensados para ser produtos finais inertes do metabolismo do óxido nítrico (NO). No entanto, estudos anteriores demonstraram que os íons nitrato podem ser convertidos de volta ao NO em mamíferos através de um mecanismo de redução de duas etapas: o nitrato sendo reduzido a nitrito (NO2-) principalmente por bactérias comensais orais, em seguida, o nitrito sendo reduzido a NO por vários mecanismos, incluindo através de proteínas contendo heme ou molibdênio. Esta via redutora do nitrato contribui para melhorar as vias de sinalização mediadas pelo NO, particularmente no sistema cardiovascular e durante o exercício muscular. Os níveis de nitrato no organismo antes dessa utilização são determinados por duas fontes diferentes: oxidação endógena do NO e ingestão dietética de nitrato, principalmente de plantas. Para elucidar o complexo ciclo do NO em circunstâncias fisiológicas, examinamos ainda mais a dinâmica de seus metabólitos, nitrato e íons nitrito, que são relativamente estáveis em comparação com o NO. Em estudos anteriores, o músculo esquelético foi identificado como um importante órgão de armazenamento de íons nitrato em mamíferos, bem como uma fonte direta de NO durante o exercício. Portanto, estabelecer uma metodologia confiável para medir os níveis de nitrato e nitrito no músculo esquelético é importante e deve ser útil para estender sua aplicação a outras amostras de tecido. Este artigo explica em detalhes a preparação de amostras de músculo esquelético, utilizando três métodos de homogeneização diferentes, para medições de nitrato e nitrito e discute questões importantes relacionadas aos processos de homogeneização, incluindo o tamanho das amostras. As concentrações de nitrato e nitrito também foram comparadas em quatro grupos musculares diferentes.
Introdução
O óxido nítrico (NO), uma pequena molécula sinalizadora gasosa, desempenha um papel crítico nos processos fisiológicos e fisiopatológicos1. O NO pode ser produzido a partir da L-arginina por enzimas endógenas da família da óxido nítrico sintase (NOS) antes de ser submetido à rápida oxidação em nitrato (NO 3-) e, possivelmente, nitrito (NO 2-) no sangue e nos tecidos 2,3. Recentemente, esses ânions demonstraram ser reduzidos de volta ao NO em sistemas de mamíferos4. O nitrato é convertido em nitrito, principalmente por n....
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Protocolo
O protocolo animal foi aprovado pelo NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Os animais foram manuseados e tratados de acordo com o atual Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, disponível gratuitamente no site da AAALAC.
1. Coleção muscular esquelética de ratos
- Enquanto um rato está sob anestesia profunda (isoflurano a 5%, confirmado pela reação ausente ao aperto da cauda / perna), inicie a perfusão com solução salina contendo heparina colocando uma agulha 19 G em um ápice do ventrículo esquerdo e fazendo um corte no átrio direito. Permita que a solução salina com heparina penetre através dos órgãos in....
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Resultados
Para a obtenção de resultados representativos, foram utilizados tecidos musculares esqueléticos de 8 ratos Wistar (machos e fêmeas, peso 250 ± 50 g). Homogeneizados do músculo esquelético de ratos (50 mg de músculo glúteo máximo para cada método) foram preparados por três diferentes ferramentas de homogeneização (homogeneizador rotativo, homogeneizador de esferas e pulverizador). Os teores de nitrato e nitrito desses homogeneizados foram então determinados por meio de um analisador de óxido nítrico (NOA) (
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Discussão
Para monitorar as mudanças nos metabólitos do NO, nitrato e nitrito, em função de intervenções fisiológicas, é imperativo medir os níveis desses íons nos diferentes órgãos que são críticos em seu metabolismo. Como a hemoglobina no sangue reagirá com o NO e seus metabólitos, também é importante remover o sangue rapidamente das amostras de tecido, tanto quanto possível. Assim, os animais foram perfundidos com solução salina antes de coletar tecidos musculares esqueléticos (glúteos, TA, EDL, músculo gastrocnêmio), e o tecid.......
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Divulgações
Os autores declaram não ter conflitos de interesse. Alan N. Schechter está listado como co-inventor em várias patentes emitidas para os Institutos Nacionais de Saúde para o uso de sais de nitrito para o tratamento de doenças cardiovasculares. Ele recebe royalties com base no licenciamento do NIH dessas patentes para desenvolvimento clínico, mas nenhuma outra compensação. Esses arranjos não afetam sua adesão às políticas do periódico JoVE.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela concessão intramural do NIH/NIDDK ZIA DK 0251041-14 a Alan N Schechter, MD.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| dissociador gentleMACS | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| tubo MACS M suave | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Comprimento: 87 mm; Diâmetro: 30 mm |
| Heparina Sódica | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurano | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Metanol | Sigma | 646377 | |
| Homogeneizador de esferas Minilys | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-etilmaleimida | Sigma | 4260 | |
| Analisador de óxido nítrico | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonilfenilpolietilenoglicol | Sigma | 74385 | |
| Ferricianeto de potássio; Kit de lise K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contém tubos de 2 mL com grânulos de cerâmica (óxido de zircônio) de 2,8 mm para homogeneização |
| Kit | Pulverizer Cellcrusher | Cellcrusher |
Referências
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New....
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Reimpressões e permissões
