Análise quantitativa baseada em microscopia a laser confocal da distribuição de aspergillus fumigatus conidia em pulmão de rato totalmente limpo opticamente

Summary

Descrevemos o método de análise quantitativa da distribuição de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamanho) nas vias aéreas dos camundongos. O método também pode ser utilizado para a análise de micropartículas e distribuição de nanopartículas nas vias aéreas em vários modelos de condições patológicas.

Abstract

Aspergillus fumigatus conidia são patógenos aéreos que podem penetrar nas vias aéreas humanas. Pessoas imunocompetntes sem alergias apresentam resistência e tolerância imunológica, enquanto em pacientes imunocomprometidos, a conidia pode colonizar as vias aéreas e causar distúrbios respiratórios graves. Várias células em diferentes compartimentos das vias aéreas estão envolvidas na resposta imune que previne a invasão fúngica; no entanto, os aspectos espátulais-temporais da eliminação do patógeno ainda não são completamente compreendidos. Imagens tridimensionais (3D) de órgãos de montagem total eliminados opticamente, particularmente os pulmões de camundongos experimentais, permitem a detecção de patógenos fluorescentes rotulados nas vias aéreas em diferentes pontos de tempo após a infecção. No presente estudo, descrevemos uma configuração experimental para realizar uma análise quantitativa da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas. Usando microscopia de varredura a laser confocal fluorescente (CLSM), rastreamos a localização de conidia fluorescente rotulada nos ramos brônquicos e no compartimento alveolar 6 horas após a aplicação do orofaringe aos ratos. A abordagem aqui descrita foi previamente utilizada para detecção da localização precisa do patógeno e identificação das células que interagem com patógenos em diferentes fases da resposta imune. A configuração experimental pode ser usada para estimar a cinética da eliminação do patógeno em diferentes condições patológicas.

Introduction

Diariamente, as pessoas inalam patógenos transmitidos pelo ar, incluindo esporos de fungos oportunistas Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) que podem penetrar no trato respiratório¹. O trato respiratório dos mamíferos é um sistema de vias aéreas de diferentes gerações que se caracterizam pelas diferentes estruturas das paredes das vias aéreas^2,3,4. As paredes traqueobronquiais consistem em vários tipos de células entre as quais estão células ciliadas que fornecem o desembaraço mucociliar⁵. Nos alvéolos....

Protocol

Todos os métodos relativos aos animais de laboratório descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Instituto Shemyakin e Ovchinnikov de Química Bioorgânica, Academia Russa de Ciências (protocolo número 226/2017).

1. A. aplicação de conidia fumigatus

1. Para obter fluorescentemente rotulado A. fumigatus conidia, fixe 5 × 10⁸ conidia adicionando 1 mL de 3% de paraformaldeído à pelota conidia. Incubar em um tubo de ensaio de 50 mL por 2 h em um shaker à temperatura ambiente.
2. Lave conidia com 20 mL de soro fisco tampão de fosfato (PBS): centrífuga ....

Results

Seguindo o protocolo acima, obteve-se a imagem 3D mostrando as vias aéreas e A. fumigatus conidia no lobo pulmonar de um rato (Figura 1A). Streptavidin (que foi usado para visualização de vias aéreas) rotulou brônquios e brônquios¹⁵. Além disso, os vasos de grande porte, que são facilmente distinguíveis das vias aéreas por sua morfologia, e pleura são visualizados no canal das vias aéreas(Figura 1A-C). A criação .......

Discussion

A imagem 3D de órgãos inteiros permite a obtenção dos dados sem dissecção da amostra, o que é de grande importância para investigar os aspectos espaciais da distribuição anatômica do patógeno no organismo. Existem várias técnicas e modificações de limpeza óptica tecidual que ajudam a superar a dispersão da luz laser e permitem imagens de órgãos inteiros^15,16,18,19. Uma das abordagens personaliz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conídios	ATCC	46645	A cepa AfS150, um derivado do ATCC 46645
Álcool benzílico	Panreac	141081.1611	98,0-100 %
Benzoato de benzila	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 camundongos	Pushchino Animal Centro de reprodução (Rússia)		Macho. 12 - 30 semanas de idade.
Cateter	Venisystems	G715-A01	18G
Câmara de cobertura de imagem celular com fundo de lamínula	Eppendorf	30742028 Câmara de	4 ou 8 poços com fundo de lamínula
Centrífuga	Eppendorf	5804R	Qualquer centrífuga fornecida 1000 g pode ser usada
Microscópio confocal de varredura a laser	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	276855	≥ 99,9%
Pacote de processamento de imagem	FIJI		Software livre
Pinça	B. Braun Aesculap	BD557R	Pinça dentada
	B. Braun Aesculap	BD321R	de ponta fina
	Bochem	1727	Garrafa
de vidro	liso DURAN	242101304	Com tampa embutida
Editor gráfico Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		A avaliação gratuita está disponível https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurano	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objetivo	ZEISS	420640-9800-000	Plano-Apocromático, 10 &vezes; (NA = 0,3)
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipeta	ProLine	722020	5 a 50 μ L
Leite em pó	Roth	T145.2
Misturador de amostras	Dynal	MXIC1
Tesoura	B. Braun	BC257R	Agitador sem corte
	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Linha de seda	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugado	ThermoFisher	S11223
Tubo de ensaio	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hidroximetil aminometano)	Helicon	H-1702-0.5	Senhor 121.14; Número CAS: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
Software de microscópio ZEN	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html