Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

Rolando A. Cuevas; Claire C. Chu; William J. Moorhead III; Ryan Wong; Ibrahim Sultan; Cynthia St. Hilaire

doi:10.3791/62439

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Artigo de método

Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

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DOI:

10.3791/62439

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16 de abril de 2021

Rolando A. Cuevas¹ , Claire C. Chu¹ , William J. Moorhead III¹ , Ryan Wong¹ , Ibrahim Sultan² , Cynthia St. Hilaire¹^,³

¹Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, ²Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, ³Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a coleta de valvas aórticas humanas extraídas durante procedimentos cirúrgicos de substituição valvar aórtica ou de tecido cadavérico e o subsequente isolamento, expansão e caracterização de células endoteliais e intersticiais valvares primárias específicas do paciente. Estão incluídos detalhes importantes sobre os processos necessários para garantir a viabilidade celular e a especificidade do fenótipo.

Resumo

A valvopatia aórtica calcifica (CAVD) está presente em quase um terço da população idosa. O espessamento, o enrijecimento e a calcificação da válvula aórtica causam estenose aórtica e contribuem para a insuficiência cardíaca e o acidente vascular cerebral. A patogênese da doença é multifatorial, e estresses como inflamação, remodelamento da matriz extracelular, fluxo turbulento e estresse mecânico e deformação contribuem para a diferenciação osteogênica das células endoteliais e intersticiais valvares. No entanto, os fatores iniciais precisos que impulsionam a transição osteogênica de uma célula saudável para uma célula calcificante não estão totalmente definidos. Além disso, a única terapia atual para estenose aórtica induzida por CAVD é a substituição da válvula aórtica, pela qual a válvula nativa é removida (substituição cirúrgica da válvula aórtica, SAVR) ou uma válvula de substituição totalmente dobrável é inserida através de um cateter (substituição da válvula aórtica transcateter, TAVR). Esses procedimentos cirúrgicos têm um alto custo e com sérios riscos; portanto, a identificação de novos alvos terapêuticos para a descoberta de medicamentos é imperativa. Para esse fim, o presente estudo desenvolve um fluxo de trabalho em que tecidos removidos cirurgicamente de pacientes e tecidos de cadáveres de doadores são usados para criar linhas primárias específicas do paciente de células valvares para modelagem de doenças in vitro. Este protocolo introduz a utilização de uma solução de armazenamento a frio, comumente utilizada no transplante de órgãos, para reduzir os danos causados pelo tempo de captação muitas vezes longo entre a excisão do tecido e o processamento laboratorial, com o benefício de estabilizar grandemente as células do tecido excisado. Os resultados do presente estudo demonstram que as células valvares isoladas retêm sua capacidade proliferativa e fenótipos endoteliais e intersticiais em cultura mais de vários dias após a retirada valvar do doador. O uso desses materiais permite a coleta de células de controle e CARD, a partir das quais as linhagens celulares de controle e doença são estabelecidas.

Introdução

A valvopatia aórtica calcifica (CAVD) é uma patologia crônica caracterizada por inflamação, fibrose e macrocalcificação dos folhetos valvares aórticos. O remodelamento progressivo e a calcificação dos folhetos (denominada esclerose aórtica) podem levar à obstrução do fluxo sanguíneo (estenose aórtica), o que contribui para o acidente vascular cerebral e leva à insuficiência cardíaca. Atualmente, o único tratamento para CAVD é a substituição cirúrgica ou transcateter da valva aórtica (SAVR e TAVR, respectivamente). Não há opção não cirúrgica para interromper ou reverter a progressão da DAV, e sem a troca valvar, as taxas de mortalidade se aproximam de 50% dentro de 2-3....