Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas

Shammy Raj; Lei Lu; Larry  D. Unsworth

doi:10.3791/62448

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Artigo de método

Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas

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DOI:

10.3791/62448

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6 de novembro de 2021

Shammy Raj¹ , Lei Lu² , Larry D. Unsworth¹

¹Department of Chemical and Materials Engineering, Donadeo Innovation Centre for Engineering, University of Alberta, ²School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

Neste artigo

Resumo

São descritas técnicas para a geração de uma biblioteca de peptídeos curtos que podem ativar células de mastro através do receptor MRGPRX2. As técnicas associadas são fáceis, baratas e podem ser estendidas a outros receptores celulares.

Resumo

Identificar ligantes específicos para receptores celulares terapeuticamente significativos é crucial para muitas aplicações, incluindo o projeto e o desenvolvimento de novas terapêuticas. O receptor de proteína G-X2 (MRGPRX2) é um receptor importante que regula a ativação de células de mastro e, portanto, direciona a resposta imune geral. Numerosos ligantes para MRGPRX2 foram identificados e incluem peptídeos endógenos como PAMPs, defensinas, LL-37 e outros fragmentos de proteína (ou seja, albumina degradada). A identificação adicional de ligantes específicos MRGPRX2 requer a triagem de um grande número de peptídeos (ou seja, biblioteca de peptídeos); no entanto, as células de mastro são difíceis e caras de manter in vitro e, portanto, não são econômicas de usar para triagem de grandes números de moléculas. O presente artigo demonstra um método para projetar, desenvolver e selecionar uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos usando mrGPRX2 expressando células HEK. Esta linha celular é relativamente fácil e barata de manter e pode ser usada para análise in vitro de alto rendimento. Um corante fluorescente Fura-2 sensível ao cálcio para marcar o fluxo de cálcio intracelular após a ativação foi usado para monitorar a ativação. A razão de intensidade de fluorescência de Fura-2 a 510 nm contra comprimentos de onda de excitação de 340 e 380 nm foi usada para calcular a concentração de cálcio. A biblioteca de peptídeos utilizada para verificar este sistema foi baseada no endogeno proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12), que é conhecido por ligar MRGPRX2 com alta especificidade e afinidade. Peptídeos subsequentes foram gerados através de truncação de aminoácidos e técnicas de escaneamento de alanina aplicadas ao PAMP-12. O método descrito aqui é simples e barato, mas robusto para a triagem de uma grande biblioteca de compostos para identificar domínios de ligação e outros parâmetros importantes que desempenham um papel importante na ativação do receptor.

Introdução

As células de mastro são parte integrante do sistema imunológico e desempenham um papel crucial nas respostas imunes inatas e adaptativas. As células de mastro são ativadas principalmente pela ligação de um antígeno à imunoglobulina E (IgE) - Complexo receptor fcεRI, ou pelo receptor de proteína G recentemente descoberto- X2 (MRGPRX2)¹. A ativação mrGPRX2 tem sido associada a diversas doenças imunológicas e inflamatórias e, portanto, é importante compreender o mecanismo de ligação do receptor aos seus ligantes². Para isso, uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos foi desenvolvida e rastreada contra receptores MR....