Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas

As células de mastro são parte integrante do sistema imunológico e desempenham um papel crucial nas respostas imunes inatas e adaptativas. As células de mastro são ativadas principalmente pela ligação de um antígeno à imunoglobulina E (IgE) - Complexo receptor fcεRI, ou pelo receptor de proteína G recentemente descoberto- X2 (MRGPRX2)¹. A ativação mrGPRX2 tem sido associada a diversas doenças imunológicas e inflamatórias e, portanto, é importante compreender o mecanismo de ligação do receptor aos seus ligantes². Para isso, uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos foi desenvolvida e rastreada contra receptores MRGPRX2 que foram superexpressos em células HEK. No estudo, a biblioteca de peptídeos foi construída utilizando-se técnicas simples e versáteis de escaneamento de alanina e truncação de aminoácidos. A varredura alanina envolve a substituição de aminoácidos específicos por um resíduo de alanina. Alanina sendo pequena e neutra, tira o peptídeo das propriedades específicas conferidas pelo resíduo substituído e destaca consecutivamente a significância das respectivas propriedades fisioquímicas do aminoácido nas interações receptoras. Pelo contrário, na truncação de aminoácidos, são projetadas sequências de peptídeos de tal forma que faltam um ou mais resíduos de aminoácidos do terminal N, terminal C, ou ambos. Este conjunto de peptídeos foi utilizado para identificar as sequências de aminoácidos cruciais para a ligação MRGPRX2.

A experiência com linhas de células de mastro humanos (LAD-2) mostrou que essas células são difíceis de cultivar e manter in vitro: um tempo de duplicação de duas semanas, suplementos médios caros e atenção direta necessária durante a passagem³. Esses atributos tornam as células inadequadas para a triagem em larga escala de ligantes potenciais. Aqui, células HEK transfectadas com estalagem expressando receptor MRGPRX2 (HEK-X2) foram usadas para tela da biblioteca de peptídeos¹. As células HEK-293 são amplamente utilizadas e estudadas para a expressão heteróloga dos receptores superficiais devido à sua alta eficiência de transfecção, taxa de duplicação mais rápida e a necessidade de suplementos médios não caros para serem cultivados em laboratório⁴. O protocolo para transfetar a linha celular HEK-293 foi demonstrado e está bem estabelecido⁵. As células HEK-293 expressando o receptor MRGPRX2 (passagem 13-19) foram ativadas com os peptídeos gerados através de N-truncation, C-truncation, N+C-truncation e alanina scaning¹. As células HEK do tipo selvagem (HEK-WT) (passagem 16-21) foram utilizadas como controle. A liberação intracelular de cálcio após a ativação foi monitorada para estudar a ativação baseada em MRGPRX2.

A ativação celular pelo MRGPRX2 é seguida por uma mobilização citosolítica de cálcio. Esta liberação de cálcio intracelular regulada em células de mastro é regulada pela entrada de cálcio operada na loja (SOCE), coordenada pela molécula de interação estromal 1 (STIM1); e é central para a cascata de resposta imune^6,7. Vários métodos têm sido utilizados para detectar concentração intracelular de cálcio, incluindo grampos de remendo e corantes fluorescentes⁸. De todas as técnicas disponíveis, corantes fluorométricos de cálcio em conjugação com várias técnicas de detecção estão sendo amplamente utilizados⁹. Dois tipos de corantes fluorométricos que ganharam interesses são: corantes de comprimento de onda único como Fluo-4, e corantes complexos de comprimento de onda duplos como Indo -1 e Fura-2. A vantagem que os corantes de comprimento de onda duplo trazem sobre corantes de comprimento de onda único é que os corantes ratiométricos corretos para erros experimentais como carregamento de corante, branqueamento de fotos e foco^10,11.

Fura-2 acetoximethyl ester (Fura-2 AM) é uma célula permeada, corante verde-fluorescente cuja excitação muda para um comprimento de onda mais baixo sobre a ligação de cálcio. Experimentalmente, a Fura-2 está animada em 340 e 380 nm, enquanto a emissão é registrada em 510 nm. Após a ligação de cálcio, a intensidade fluorescente a 340 nm aumenta enquanto a de 380 nm diminui, como mostra a Figura 1. Os dados são representados como uma razão de intensidade de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a intensidade após excitação em 380 nm (F380) ou seja, F340/F380. A razão F340/F380 é proporcional ao cálcio intracelular, o valor pode ser calculado pela equação de Grynkiewicz¹². Uma vez que o sinal de fluorescência é obtido a partir da excitação do corante em dois comprimentos de onda (340 nm e 380 nm), a razão dos sinais de fluorescência corrige para fatores experimentais como carregamento de corante, vazamento de corante, fotobleaching e densidades celulares.

1. Projeto e desenvolvimento da biblioteca de peptídeos

1. Para identificar os ligantes do receptor MRGPRX2 da célula de mastro baseado em um ligante conhecido, ou seja, PAMP-12¹³, siga os passos abaixo.
   1. Gerar biblioteca de peptídeos truncados truncados truncando os resíduos de aminoácidos n-terminal do ligante, em sucessão, por síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS).
   2. Gerar biblioteca de peptídeos truncados C truncando os resíduos de aminoácidos terminais C do ligante conhecido, sucessivamente, por SPPS.
   3. Com base nos resultados de 1.1.1 e 1.1.2, gerar uma biblioteca de peptídeos truncado N+C utilizando SPPS truncando os resíduos desejados do terminal N e C, respectivamente.
   4. Use a síntese de peptídeos de fase sólida para sintetizar os peptídeos¹³.
   5. Modifique o terminal N para o grupo acetil (Ac) e o terminal C para o grupo amide.
   6. Caracterize o peptídeo para sua pureza usando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e para a massa usando um espectrofotômetro de massa.
2. Para estudar a significância de aminoácidos específicos dentro da molécula pamp-12 pai, siga os passos abaixo.
   1. Gere uma biblioteca de peptídeos de varredura alanina substituindo os respectivos resíduos de aminoácidos na molécula de peptídeo por alanina, um de cada vez usando SPPS. Modifique o terminal N para o grupo acetil (Ac) e o terminal C para o grupo amide.
   2. Caracterize o peptídeo para sua pureza usando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e para a massa usando um espectrofotômetro de massa.
      NOTA: Certifique-se de que os peptídeos sintetizados são de alta pureza. Caracterize os peptídeos usando espectroscopia de massa e HPLC.

2. Cultura celular in vitro

1. Cultura HEK-X2 e células HEK-WT seguindo os passos abaixo.
   1. Prepare o meio cultura suplementando dMEM de alta glicose com 10% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-Glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
   2. Passagem as células na cultura tecidual (TC) trataram frascos de cultura T-75 e crescem em uma incubadora a 37 °C contendo 5% de CO₂, até que sejam 75-80% confluentes.
   3. Uma vez 75% confluente, lave as células e adicione 2-3 mL de trippsina por 2 - 3 min. Incubar em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ para desprender as células.
   4. Uma vez que as células se desgrudam, colete as células em trippsina. Adicione 6-9 mL de meio fresco.
   5. Centrifugar as células a 1620 x g por 3-5 min.
   6. Após a centrifugação, descarte o sobrenatante para coletar a pelota. Resuspend as células em um novo meio de cultura. Diluir as células de acordo com a concentração desejada.
      NOTA: As células HEK são células de rápido crescimento e, portanto, otimizam os suplementos médios celulares. As células HEK são células aderentes; passá-los em frascos de cultura tratados com TC para apoiar a adesão.
2. Prepare uma placa de ensaio 96 para o experimento.
   1. Adicione 200 μL da suspensão celular em cada poço, com uma concentração de 200.000 células/mL, para semear 40.000 células/bem.
   2. Cresça as células por 24 h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO_2.
      NOTA: Otimize a densidade celular por poço com base no tamanho da placa e no tipo de tensão celular. Conduza o experimento em triplicados em uma placa de poço tc-tratada com TC preto com fundo transparente plano.

3. Ensaio de cálcio fura-2 AM

1. Prepare o corante seguindo os passos abaixo.
   1. Use corante Fura-2 AM para o experimento.
   2. Prepare o tampão tampão hepes-tyrode (HTB) contendo tampão HEPES de 25 mM, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/mL de glicose, 1 mg/mL de colagem de soro bovino (BSA) e recém-adicionado 1,8 mM CaCl₂ em água esterilizada autoclave.
   3. Adicione 50 μL de DMSO em 50 frascos fura-2 AM para preparar a solução de estoque de 1 mM de corante Fura-2 AM. Adicione 1 μL de 1 mM de corante Fura-2 AM por mL de meio fresco para preparar o meio de carregamento de corante com concentração de corante de 1 μM.
   4. Retire a placa de 96 poços da incubadora e descarte o meio. Substitua o meio por um meio de carregamento de tingimento fresco. Adicione 200 μL de meio de carregamento de corante em cada poço. Incubar as células por 30-40 min em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO_{2 .}
   5. Após 40 minutos de incubação, remova o meio. Lave as células com o tampão HTB. Adicione 100 μL de tampão HTB para leitura de fluorescência. Leve o prato para leitura de fluorescência.
      NOTA: Otimize a concentração de corante no meio de carregamento de corante. Vazamento de corante e fotobleaching são possíveis preocupações associadas ao corante. Adicione o CaCl₂ fresco no buffer HTB para evitar a precipitação.

4. Ativação celular e leitura fluorescente

NOTA: Leitor de placa de fluorescência com sistema automatizado de pipetização permite a transferência automática de compostos de uma fonte composta para a placa de ensaio sem tirar a placa do leitor de placas.

1. Enquanto as células estão sendo incubadas, defina o Leitor de Placas.
   1. A temperatura é de 37 °C.
   2. Em Configurações, selecione Flex.
   3. Defina o modo de leitura para fluorescência e leitura inferior.
   4. Em Comprimentos de Onda, defina o número de comprimentos de onda para 2. Defina a Excitação para 340 nm e 380 nm. Defina a emissão para 510 nm.
   5. Deixe a sensibilidade ao padrão.
   6. Em Tempo, defina o intervalo para 3,9 s. Defina o Tempo de Execução para 94 s para obter 25 leituras.
   7. Em seguida, selecione o tipo de placa de ensaio.
   8. Em seguida, selecione os Poços para Ler.
   9. Em Transferência composta,defina transferências para 1 e volume inicial para 100 μL. Ajuste a altura da pipeta para 100 μL, volume de 50 μL e Ponto de Tempo para 36 s, para adicionar o composto na 10ª leitura.
   10. Em seguida, selecione o tipo de placa de origem composta.
   11. Deixe triturate para não utilizado.
   12. Selecione as dicas no Layout de Dicas de Pipeta.
   13. Para colunas compostos e pontas,certifique-se de que os compostos a serem transferidos estejam na coluna 1 da placa composta. Defina a Coluna de Ponta para 1 e Coluna composta para 1.
   14. Deixe o Autocalibrate como ON.
   15. Clique em OK.
2. Quando a temperatura atingir 37 °C, carregue as placas no Leitor de Placas.
   1. Pressione a Câmara de Leitura para colocar a placa de ensaio no leitor de placasde fluorescência .
   2. Pressione a Fonte para colocar a placa composta. Prepare a Placa Composta adicionando 200 μL de peptídeos respectivos, ionomicina e etileno glycol-bis (β-aminoetil ether)-N,N',N′,N′-tetraacético (EGTA)-Triton X-100.
   3. Pressione o rack de ponta para colocar a caixa de ponta. Use uma ponta preta para evitar a autofluorescência da ponta.
   4. Uma vez que as placas estejam carregadas, revise as configurações do software e pressione Read.

5. Análise de dados

1. Determine a concentração de cálcio da razão de fluorescência pela equação de Grynkiewicz -
   
   onde, K_d é a constante de dissociação de Fura-2 AM, R é a razão de emissão após excitação em 340 nm e 380 nm (F340/F380) para os respectivos peptídeos, R_max é a relação máxima de fluorescência observada pela adição de 50 μL de 30 μM ionomicina, R_min é a fluorescência mínima observada pela adição de 50 μL de 100 mM EGTA/2,5%Tritão X-100, e F380_min e F380_max são a intensidade absoluta de fluorescência de Fura-2 AM em estado livre de cálcio e vinculado, respectivamente.
   NOTA: A máquina dispensa o líquido com alguma força. Não ajuste a altura de distribuição de peptídeo muito perto da parte inferior da placa; pode desprender as células. Use pontas de pipeta pretas para evitar autofluorescência. Leia a fluorescência máxima e a fluorescência mínima para cada placa para cada experimento.

A tabela 1 contém as sequências de peptídeos geradas através da truncação de aminoácidos terminais e da varredura alanina. Como mostrado na Tabela 1,a sequência de peptídeos RKKWNKWALSR carece de fenilalanina n-terminal (F) em relação ao seu pamp-12 pai e, portanto, é um peptídeo representativo na biblioteca N-truncada. Da mesma forma, em FRKKWNKWALS, a serina terminal PAMP-12 foi removida, representando uma biblioteca de peptídeos truncado c derivado do PAMP-12. Na biblioteca de peptídeos truncados N+C, aminoácidos do terminal N e C são removidos. A truncação de 4 aminoácidos do terminal N e 1 resíduo do terminal C de PAMP-12 resulta em WNKWALS. A biblioteca de peptídeos derivada da alanina tem um aminoácido substituído por alanina, como com ARKKWNKWALSR, onde a fenilalanina n-terminal é substituída por alanina. O corante FURA-2 AM foi utilizado para estudar o potencial de ativação dos peptídeos contra as células HEK transfectadas MRGPRX21. Os dados foram registrados em um leitor de placas de fluorescência. Se o ligante de peptídeo ativou a célula, a fluorescência bombeada a 340 nm (F340) aumenta, enquanto o mesmo diminui para comprimento de onda de 380 nm (F380)(Figura 1a). Para um peptídeo em branco (ou para esse assunto não ativando peptídeo ou controle HEK-WT) no entanto, o aumento e a diminuição relativos seriam respectivamente baixos, como mostrado na Figura 2a. A concentração de cálcio é, no entanto, representada pela razão F340/F380, conforme mostrado na Figura 1b,2b. A razão F340/F380 pode ser substituída na equação de Grynkiewicz para obter a concentração de cálcio usando calibrações in situ(Figura 3). Os peptídeos listados na Tabela 1 foram caracterizados pela espectroscopia de massa (Figura 4a) e HPLC (Figura 4b) e encontrados como de alta pureza.

Tabela 1: Sequências representativas de peptídeos geradas após N, C e N+C - truncação e escaneamento de alanina. O terminal N dos peptídeos foi modificado por acetil, enquanto o Terminal C continha um grupo de amide.

Figura 1: Dados representativos para um peptídeo ativador. (a) A fluorescência sinaliza para um peptídeo ativador. Os dados representados correspondem ao PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). Peptídeo foi adicionado após gerar uma linha de base para 10 ciclos de leitura (36 s), como mostrado pela seta. (b) A razão da emissão de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nm (F380) (F340/F380). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dados representativos para o espaço em branco. aOs sinais de fluorescência para o Blank. O HTB foi adicionado após a geração de uma linha de base para 10 ciclos de leitura (36 s), como mostrado pela seta. (b) A razão da emissão de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nm (F380) (F340/F380). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Dados representativos para as normas de calibração de corantes. (a) A ionomicina foi adicionada em 10leituras, como mostrado pela seta, para obter fluorescência máxima em ca+2 estado vinculado. EGTA-Triton X-100 foi adicionado após 20 leituras, como mostrado pela seta, para obter um sinal mínimo. (b) A razão da emissão de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nm (F380) (F340/F380). Esses valores são ainda colocados na equação de Grynkiewicz para obter a concentração intracelular de cálcio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Caracterização de um peptídeo representativo para confirmar a sequência e a pureza. (a) A massa teórica da sequência de peptídeos representativo WNKWAL foi de 857,90 Da, o que foi mostrado pela razão m/z na espectroscopia de massa. bA pureza do peptídeo de 99% confirmada pelo HPLC. Este peptídeo pertence à biblioteca de peptídeos truncados N+C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não há interesses concorrentes.