Consideração de coleta, processamento e armazenamento para pesquisa de biomarcadores urinários

Summary

Este protocolo visa fornecer considerações para coleta, processamento e armazenamento de amostras de urina para estudos de biomarcadores de infecção do trato urinário.

Abstract

Existem várias proteínas urinárias que se mostram promissoras como novos marcadores de infecções do trato urinário. A identificação de um novo biomarcador com maior precisão preditiva em comparação com os métodos diagnósticos atuais tem o potencial de melhorar muito a capacidade de gerenciar pacientes com infecções do trato urinário. No entanto, a coleta, o processamento e o armazenamento de amostras podem afetar potencialmente os resultados da pesquisa de biomarcadores. Compreender os efeitos de cada um desses estágios nos estudos de biomarcadores é necessário para informar pesquisas futuras e de alta qualidade nessa área, bem como para revisar criticamente outros estudos nessa área. Aqui, o estudo revisa a literatura sobre os efeitos de cada estágio do processamento da amostra de urina e relata os efeitos de várias condições nas proteínas urinárias. O protocolo se concentrará em técnicas de coleta, tempo e temperatura de armazenamento, técnicas de processamento, uso de reagentes e congelamento de longo prazo na estabilidade do biomarcador. Ele se concentrará em proteínas, mas discutirá brevemente outros materiais que podem ser utilizados na pesquisa de biomarcadores. Ao fazer isso, este protocolo fornecerá um guia para futuros pesquisadores para auxiliar no desenho de estudos de biomarcadores urinários.

Introduction

As infecções do trato urinário (ITU) são uma das infecções bacterianas mais comuns em crianças e adultos¹. Embora o diagnóstico de ITU em algumas populações possa ser descomplicado, pode ser mais complexo em outras, como aquelas com bexiga neuropática². A capacidade de diagnosticar com precisão as ITUs ajudará a melhorar os esforços de administração de antibióticos, diminuindo o uso de antibióticos desnecessários e potencialmente auxiliando no diagnóstico precoce de ITU, diminuindo assim o risco de morbidade. Dada a prevalência de ITUs, há um interesse significativo em melhorar o manejo dessa infecção comum.

Há um número crescente de novos biomarcadores na literatura que se mostram promissores em sua capacidade de diagnosticar ITU 3,4,5,6,7. No entanto, existem vários fatores associados ao processamento de amostras de urina que têm o potencial de alterar os resultados. Esses fatores variam de métodos de coleta, temperatura e duração do armazenamento de curto e longo prazo, técnicas de processamento, uso de reagentes e ciclos de congelamento e descongelamento⁸. Entender como as mudanças em cada um deles podem afetar as leituras de biomarcadores é necessário tanto para interpretar criticamente a pesquisa na literatura quanto para projetar estudos de alta qualidade focados em biomarcadores de urina.

Aqui, uma revisão narrativa da literatura é fornecida sobre os efeitos de cada fator, incluindo técnicas de coleta, temperatura e duração de armazenamento de curto e longo prazo, uso de reagentes e o efeito dos ciclos de congelamento e descongelamento, em proteínas que podem ter utilidade como biomarcadores de urina e fornecem recomendações para o processamento ideal com base nesta revisão da literatura. Este protocolo se concentrará em biomarcadores de proteínas medidos usando western blots ou ELISAs.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos da instituição. Certifique-se de que a aprovação seja obtida do conselho de revisão institucional (IRB) antes da coleta e utilização de espécimes biológicos para pesquisa.

1. Coleta

1. Obtenha a amostra de urina em um copo de amostra estéril. Decida o tipo de amostra de urina, bem como os critérios específicos de inclusão e exclusão, com base no desenho específico do estudo. Para estudos de ITU, use o método de captura limpa ou cateterismo para evitar contaminação perineal.
2. Para obter uma amostra de urina limpa, instrua os participantes a limpar a área periuretral com um lenço umedecido, esvaziar uma pequena quantidade no vaso sanitário e urinar no copo de amostra.
3. Instrua as mulheres a usar os dedos para espalhar os lábios e os homens a retrair o prepúcio (se aplicável) antes de urinar para evitar contaminação.
4. Registre o tempo de coleta.
5. Colete os dados clínicos relevantes de cada participante, conforme exigido pelo desenho do estudo individual e pela pergunta da pesquisa.
6. Considere realizar um exame de urina ou tira reagente de urina em cada amostra antes do processamento e armazenamento se esses dados não estiverem disponíveis de forma confiável no registro eletrônico de saúde.

2. Processamento e armazenamento de amostras

1. Processe as amostras imediatamente. Se tal não for possível, conservar a amostra a 4 °C durante um máximo de 24 h.
2. Se as amostras não puderem ser armazenadas a 4 °C ou precisarem ser armazenadas a 4 °C por mais de 24 h, adicionar ácido bórico 0,2 M ou NaN₃ 10 mM às amostras. Verifique se esses reagentes são compatíveis com as aplicações planejadas a jusante.
3. Registar a duração do tempo de permanência das amostras a 4 °C.
4. Centrifugue as amostras a 1000-1500 x g por 10-20 min. A centrifugação não precisa ser a 4 °C.
5. Recolher o sobrenadante e alíquota para tubos de microcentrífuga separados.
6. Rotule os tubos com vários identificadores claros (como data e identificação da amostra (ID)). Considere o uso de códigos de barras gerados por computador projetados especificamente para armazenamento de amostras biológicas a -80 °C. Se não estiver disponível, certifique-se de que a caneta usada para rotular as amostras seja resistente à água.
7. Rotule cada caixa do freezer de forma que cada local tenha um código específico. Para isso, numere cada coluna com uma letra diferente e cada linha com um número. Isso permitirá a criação de mapas ou outros guias para facilitar a localização da amostra.
8. Congelar imediatamente as amostras a -80 °C. Registre o tempo de congelamento.
9. Descongelar as amostras em banho-maria a 37 °C no dia da medição para minimizar o armazenamento desnecessário à temperatura ambiente ou a 4 °C.
10. Registar os tempos e o número de ciclos adicionais de congelamento e descongelação para cada alíquota.

3. Análise

1. Ao usar ELISAs disponíveis comercialmente, siga as instruções do fabricante.
2. Execute os exemplos em duplicata.
3. Identifique a concentração esperada da proteína de interesse para garantir que os níveis de proteína nas amostras estejam dentro da faixa do kit. Se o nível esperado de proteína exceder o padrão superior, diluir as amostras.
4. Depois que os dados forem obtidos do leitor de placas (ELISA) ou western blot, determine a concentração de cada biomarcador na amostra manualmente (não recomendado) ou usando qualquer software.
5. Analise os resultados. A análise dos dados depende do desenho individual do estudo.
6. Considere ajustar os valores dos biomarcadores para levar em conta a concentração de urina.
   NOTA: Tradicionalmente, os pesquisadores de biomarcadores usam a creatinina urinária como método de normalização, especialmente em participantes com função renal normal, para explicar a concentração na urina. No entanto, outros relatam que a normalização não faz diferença nos resultados⁴. Para superar esse obstáculo, alguns pesquisadores relatam resultados normalizados e não normalizados.
7. Recomendar a notificação de intervalos de tempo desde a coleta até o congelamento, bem como a duração do tempo a 4 °C antes do processamento em manuscritos publicados para permitir a interpretação dos resultados no contexto do processamento da amostra (Figura 1)

4. Efeito de várias condições de armazenamento na lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL).

1. Aumente a urina fresca com 2 ng/mL de NGAL recombinante.
2. Aliquota a urina e submetê-la a diferentes condições de processamento e armazenamento.
   1. Centrifugue a urina a 1000-1500 x g por 10-20 min. A centrifugação não precisa ser a 4 °C. Armazenar em diferentes condições (20 °C, 4 °C, -20 °C) por 24 h, 48 h ou 72 h.
   2. Armazenar alíquota da amostra a -80 °C para comparação.
3. Depois de manter as amostras nas diferentes condições mencionadas na etapa 4.2.1, medir os níveis de NGAL nas amostras usando um kit ELISA disponível comercialmente que inclui os controles de acordo com as instruções do fabricante.

Results

A centrifugação teve um pequeno impacto nos níveis de NGAL. As amostras centrifugadas armazenadas a -80 °C apresentaram níveis mais baixos de NGAL do que as amostras não centrifugadas (2,17 ng/mL ± 0,32 ng/mL, 2,77 ng/mL ± 0,21 ng/mL). Os ciclos de congelamento também tiveram impacto nos níveis de NGAL após o terceiro ciclo de congelamento e descongelamento. (Figura 2). Das condições estudadas (centrifugação, ciclos de congelamento e descongelamento e temperatura de armazenamento), a tempera...

Discussion

A importância de produzir resultados consistentes e reprodutíveis não se limita ao sucesso de estudos individuais, mas também permitirá uma melhor comparação dos resultados dentro da literatura⁹. A variação entre os estudos nas principais etapas processuais pode introduzir vieses irreversíveis que podem afetar os sinais dos biomarcadores e sua interpretação, o que pode ser responsável por discrepâncias entre vários estudos¹⁰. Isso demonstra...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido bórico	Sigma-Aldrich	B6768	A considerar para amostras que não podem ser rapidamente processadas e congeladas
Caixas de congelação	Fisher Scientific	03-395-464
Tubos de microcentrífuga	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R& D Systems	DLCN20	Usado para criar resultados representativos
Pipeta e ponteiras	Depende do tamanho da pipeta e do volume de fluido.
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	S2002	A ser considerado para amostras que não podem ser rapidamente processadas e congeladas
Copos de coleta de urina	Thermo Scientific	3122B03ORG	Copos estéreis não são necessários, a menos que sejam necessários para outros estudos