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Mapeamento de R-Loops e RNA: Híbridos de DNA com Métodos de Imunoprecipitação Baseados em S9.6

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DOI:

10.3791/62455

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24 de agosto de 2021

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology and Genome Center, University of California

Neste artigo

Resumo

Os R-loops constituem uma classe prevalente de estruturas de DNA não-B orientadas por transcrição que ocorrem em todos os genomas, dependendo da sequência de DNA e da favorabilidade topológica. Nos últimos anos, os R-loops têm sido implicados em uma variedade de papéis adaptativos e desadaptativos e têm sido associados à instabilidade genômica no contexto de distúrbios humanos. Como consequência, o mapeamento preciso dessas estruturas em genomas é de grande interesse para muitos investigadores. DRIP-seq (DNA: RNA Imunoprecipitação seguida de sequenciamento de alto rendimento) é descrito aqui. É uma técnica robusta e reprodutível que permite o mapeamento preciso e semiquantitativo de R-loops. Uma iteração recente do método também é descrita na qual a fragmentação é realizada usando sonicação (sDRIP-seq), que permite o mapeamento específico da fita e de alta resolução de loops R. O sDRIP-seq, portanto, aborda algumas das limitações comuns do método DRIP-seq em termos de resolução e encalhe, tornando-o um método de escolha para mapeamento de loop R.

Resumo

Os R-loops constituem uma classe prevalente de estruturas de DNA não-B orientadas por transcrição que ocorrem em todos os genomas, dependendo da sequência de DNA e da favorabilidade topológica. Nos últimos anos, os R-loops têm sido implicados em uma variedade de papéis adaptativos e desadaptativos e têm sido associados à instabilidade genômica no contexto de distúrbios humanos. Como consequência, o mapeamento preciso dessas estruturas em genomas é de grande interesse para muitos investigadores. DRIP-seq (DNA: RNA Imunoprecipitação seguida de sequenciamento de alto rendimento) é descrito aqui. É uma técnica robusta e reprodutível que permite o mapeamento preciso e semiquantitativo de R-loops. Uma iteração recente do método também é descrita na qual a fragmentação é realizada usando sonicação (sDRIP-seq), que permite o mapeamento específico da fita e de alta resolução de loops R. O sDRIP-seq, portanto, aborda algumas das limitações comuns do método DRIP-seq em termos de resolução e encalhe, tornando-o um método de escolha para mapeamento de loop R.

Introdução

R-loops são estruturas de ácido nucleico de três fitas que se formam principalmente durante a transcrição após a hibridização do transcrito de RNA nascente para a fita de DNA molde. Isso resulta na formação de um híbrido RNA:DNA e causa o deslocamento da fita de DNA não molde em um estado de loop de fita simples. A reconstituição bioquímica 1,2,3,4 e a modelagem matemática5, em combinação com outras medidas biofísicas 6,7, estabeleceram que as alças R são mais prováveis de ocorrer em regiões que exibem características favoráveis específicas. Por exemplo, regiões que exibem assimetria de fita na distribuição de guaninas (G) e citosinas (C) de modo que o RNA é rico em G, uma propriedade chamada inclinação positiva de GC, são favorecidas para formar R-loops quando transcritas devido à maior estabilidade termodinâmica do híbrido DNA: RNA em comparação com o DNAduplex 8. Regiões que evoluíram com inclinação positiva de GC, como as porções iniciais de muitos genes eucarióticos 4,9,10,11, são propensas a formar R-loops in vitro e in vivo 3,4,12. O estresse superhelicoidal negativo do DNA também favorece muito a formação da estrutura13,14 porque os R-loops absorvem eficientemente essas tensões topológicas e retornam a fibra de DNA circundante a um estado relaxado favorável 5,15.

Historicamente, as estruturas R-loop foram consideradas como resultado de emaranhamentos raros e espontâneos de RNA com DNA durante a transcrição. No entanto, o desenvolvimento da imunoprecipitação DNA: RNA (DRIP) juntamente com o sequenciamento de DNA de alto rendimento (DRIP-seq) permitiu o primeiro mapeamento de todo o genoma de R-loops e revelou que essas estruturas são muito mais prevalentes do que o esperado em células humanas 4,16. Os R-loops ocorrem em dezenas de milhares de hotspots gênicos conservados e transcritos em genomas de mamíferos, com uma predileção por ilhas CpG distorcidas por GC sobrepondo o primeiro íntron de genes e as regiões terminais de vários genes17. No geral, os R-loops ocupam coletivamente 3% -5% do genoma em células humanas, consistente com medições em outros organismos, incluindo leveduras, plantas, moscas e camundongos 18,19,20,21,22.

A análise de hotspots formadores de R-loop em células humanas revelou que tais regiões se associam a assinaturas específicas de cromatina23. As alças R, em geral, são encontradas em regiões com menor ocupação de nucleossomos e maior densidade de RNA polimerase. Nos promotores, os R-loops associam-se ao aumento do recrutamento de duas modificações de histonas depositadas co-transcricionalmente, H3K4me1 e H3K36me317. Nos terminais do gene, os R-loops se associam a genes bem dispostos que sofrem terminação de transcrição eficiente17, consistente com observações anteriores24. Os R-loops também demonstraram participar do início da replicação do DNA nas origens de replicação de bacteriófagos, plasmídeos, mitocôndrias e genomas de leveduras 25,26,27,28,29,30,31. Além disso, 76% dos promotores de ilhas CpG humanos propensos a R-loops funcionam como origens de replicação constitutivas precoces 32,33,34,35, reforçando ainda mais as conexões entre R-loops e origens de replicação. Coletivamente, esses estudos sugerem que os R-loops representam um novo tipo de sinal biológico que pode desencadear saídas biológicas específicas de maneira dependente do contexto23.

No início, os R-loops mostraram se formar em sequências de troca de classe durante o processo de recombinação de troca de classe de imunoglobulina 3,36,37. Acredita-se que esses R-loops programados iniciem a recombinação de troca de classe por meio da introdução de quebras de DNA de fita dupla38. Desde então, a formação prejudicial de R-loop, geralmente entendida como resultante da formação excessiva de R-loop, tem sido associada à instabilidade genômica e processos como hiper recombinação, colisões de transcrição-replicação, replicação e estresse transcricional (para revisão 39,40,41,42,43). Como consequência, o mapeamento aprimorado das estruturas R-loop representa um desafio empolgante e essencial para decifrar melhor a distribuição e a função dessas estruturas na saúde e na doença.

A imunoprecipitação de DNA: RNA (DRIP) depende da alta afinidade do anticorpo monoclonal S9.6 para híbridos de DNA: RNA44. O DRIP-seq permite um perfil robusto de todo o genoma da formação de R-loop 4,45. Embora útil, essa técnica sofre de resolução limitada devido ao fato de que enzimas de restrição são usadas para obter uma fragmentação suave do DNA. Além disso, o DRIP-seq não fornece informações sobre a direcionalidade da formação do R-loop. Aqui, relatamos uma variante do DRIP-seq que permite o mapeamento de loops R em alta resolução de maneira específica da fita. Este método depende da sonicação para fragmentar o genoma antes da imunoprecipitação e, portanto, o método é chamado de sDRIP-seq (sonicação DNA: imunoprecipitação de RNA acoplada ao sequenciamento de alto rendimento) (Figura 1). O uso de sonicação permite uma resolução aumentada e limita os vieses de fragmentação enzimáticos de restrição observados nas abordagens DRIP-seq46. O sDRIP-seq produz mapas de R-loop que estão em forte concordância com os resultados do DRIP-seq e do método DRIPc-seq de alta resolução descrito anteriormente, no qual as bibliotecas de sequenciamento são construídas a partir das fitas de RNA de estruturas R-loop imunoprecipitadas45.

Diante de uma infinidade de métodos para escolher, os usuários podem se perguntar qual abordagem específica baseada em DRIP é preferível para suas necessidades. Oferecemos o seguinte conselho. O DRIP-seq, apesar de suas limitações, é tecnicamente mais fácil e é o mais robusto (maiores rendimentos) de todos os três métodos discutidos aqui; portanto, permanece amplamente útil. Numerosos conjuntos de dados DRIP-seq foram publicados, o que fornece um ponto de comparação útil para novos conjuntos de dados. Finalmente, o pipeline de análise de bioinformática é mais simples, pois os dados não ficam encalhados. Recomenda-se que os novos usuários comecem a aprimorar suas habilidades de mapeamento de loop R com DRIP seguido de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e DRIP-seq. O sDRIP-seq representa um grau ligeiramente maior de dificuldade técnica: os rendimentos são ligeiramente reduzidos devido à sonicação (discutido abaixo) e o processo da biblioteca de sequenciamento é um pouco mais complexo. No entanto, o ganho de encalhe e resolução mais alta é inestimável. Note-se que o sDRIP-seq capturará tanto híbridos de RNA:DNA de fita dupla quanto loops R de fita tripla. Devido às etapas de construção da biblioteca, o DRIP-seq não capturará híbridos de RNA:DNA de fita dupla. O DRIPc-seq é o mais exigente tecnicamente e requer maior quantidade de materiais de partida. Em troca, oferece a mais alta resolução e encalhe. Como as bibliotecas de sequenciamento são construídas a partir da porção de RNA de R-loops ou híbridos, o DRIPc-seq pode sofrer de possível contaminação por RNA, especialmente porque S9.6 possui afinidade residual por dsRNA 19,47,48. O sDRIP-seq permite o mapeamento de alta resolução específico da fita sem preocupações com a contaminação do RNA, uma vez que as bibliotecas de sequenciamento são derivadas das fitas de DNA. No geral, esses três métodos permanecem úteis e apresentam diferentes graus de complexidade e ressalvas ligeiramente diferentes. Todos os três, no entanto, produzem conjuntos de dados altamente congruentes48 e são altamente sensíveis ao pré-tratamento com RNase H, que representa um controle essencial para garantir a especificidade do sinal45,49. Note-se que, dada a seleção de tamanho imposta às bibliotecas de sequenciamento, pequenos híbridos (estimados <75 pb), como aqueles que se formam transitoriamente em torno de locais de priming de replicação de DNA de fita atrasada (primers de Okazaki) serão excluídos. Da mesma forma, como todos os métodos DRIP envolvem fragmentação de DNA, loops R instáveis que requerem superenrolamento de DNA negativo para sua estabilidade serão perdidos5. Assim, as abordagens DRIP podem subestimar as cargas de R-loop, especialmente para R-loops curtos e instáveis que podem ser melhor capturados usando abordagens in vivo 45,48. Note-se que os R-loops também podem ser perfilados de maneira independente de S9.6 em cobertura profunda, alta resolução e de maneira específica da fita em moléculas de DNA únicas após o tratamento com bissulfito de sódio12. Além disso, estratégias usando uma enzima RNase H1 cataliticamente inativa foram empregadas para mapear loops R nativos in vivo, destacando loops R curtos e instáveis que se formam principalmente em promotores pausados 50,51,52.

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Protocolo

O protocolo a seguir é otimizado para a linha celular Ntera-2 humana cultivada em cultura, mas foi adaptado com sucesso sem modificação para uma variedade de outras linhagens de células humanas (HEK293, K562, HeLa, U2OS), células primárias (fibroblastos, células B), bem como em outros organismos com pequenas modificações (camundongos, moscas).

1. Colheita e lise celular

  1. Cultive células Ntera-2 para 75% -85% de confluência. Certifique-se de que a contagem ideal de células seja de 5 a 6 milhões de células com >90% de contagens viáveis para iniciar qualquer procedimento de DRIP.
  2. Lave as células uma vez com 1x PBS, adicione 1,5 mL de tripsina-EDTA 1x e incube por 2 min a 37 ° C até que as células se dissociem do prato.
  3. Adicione 5 mL de meio quente e pipete bem para ressuspender as células em uma única suspensão celular. Transfira o conteúdo para um novo tubo de 15 mL e pelete suavemente as células a 300 x g por 3 min.
  4. Lave as células uma vez com 5 mL de 1x PBS e pelete suavemente as células a 300 x g por 3 min.
  5. Ressuspenda totalmente as células em 1,6 mL de tampão TE (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Adicione 5 μL de proteinase K (solução estoque de 20 mg / mL) e 50 μL de SDS (solução estoque a 20%) e inverta suavemente os tubos cinco vezes até que a solução se torne viscosa. Não tente pipetar a solução, apenas misture por inversão.
  6. Incubar os tubos durante a noite a 37 °C.

2. Extração de DNA

  1. Despeje o lisado de DNA em um tubo de gel de bloqueio de fase de alta densidade pré-fiado de 15 mL e adicione 1 volume (1,6 mL) de álcool fenol/clorofórmio isoamílico (25:24:1). Inverta suavemente cinco vezes e gire para baixo a 1.500 x g por 5 min.
  2. Adicione 1/10 volume de acetato de sódio 3 M (NaOAc) (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol 100% a um novo tubo de 15 mL. Despeje a fase aquosa superior do tubo de gel de bloqueio de fase e inverta suavemente até que o DNA esteja totalmente precipitado (até 10 min).
  3. Enrole os fios de DNA usando uma ponta de 1.000 μL de diâmetro largo e transfira para um tubo limpo de 2 mL, tomando cuidado para não transportar o sobrenadante residual.
  4. Lave o DNA adicionando 1,5 mL de etanol a 80% e inverta suavemente o tubo cinco vezes. Incubar por 10 min.
  5. Repita a etapa anterior duas vezes. Não centrifugue durante as etapas de lavagem. Remova cuidadosamente o máximo de etanol possível pipetando após a última lavagem, tentando não perturbar o DNA.
  6. Deixe o DNA secar completamente ao ar enquanto inverte o tubo. Esta etapa pode levar de 30 min a 1 h, dependendo da quantidade de DNA.
  7. Adicione 125 μL de tampão TE diretamente no pellet de DNA para fragmentar o DNA por meio da digestão da enzima de restrição ou 100 μL de tampão TE para cisalhar o DNA por sonicação. Mantenha em gelo por 1 h e ressuspenda suavemente o DNA pipetando algumas vezes com uma ponta de diâmetro largo de 200 μL. Deixar no gelo durante 1 h antes de iniciar a etapa de fragmentação.

3. Fragmentação do DNA

NOTA: Para DRIP-seq baseado em enzima de restrição, siga a etapa 3.1. Para DRIP-seq baseado em sonicação, pule para a etapa 3.2.

  1. Fragmentação da enzima de restrição (RE)
    1. Digerir o DNA genômico ressuspenso (muito viscoso) usando um coquetel de REs de acordo com as instruções do fornecedor.
      1. Adicione 0,1 mM de espermidina à reação final. Use um coquetel de 4-5 enzimas com 30 U de cada enzima em um volume total de 150 μL.
        NOTA: O coquetel inicial para DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 foi desenvolvido para gerar um comprimento médio de fragmento de 5 quilobases. Evite qualquer interferência na metilação do CpG e poupe regiões ricas em GC do genoma. Outros coquetéis também são possíveis16). Esses coquetéis são adequados para os genomas humano e de camundongo, mas podem ser ajustados conforme necessário.
      2. Incubar a mistura de reação durante a noite a 37 °C.
        NOTA: A mistura de DNA pós-digestão não deve mais ser viscosa. Qualquer viscosidade remanescente nesta etapa é indicativa de uma digestão incompleta.
      3. Se observado, adicionar mais 10 U de cada enzima e incubar por mais 2-4 h a 37 °C.
        NOTA: Os usuários não podem digerir o pellet inteiro caso tenham colhido mais células do que o recomendado aqui.
    2. Pipete suavemente o DNA digerido durante a noite (150 μL) em um tubo de luz de gel de bloqueio de fase pré-fiado de 2 mL. Adicione 100 μL de água e um volume (250 μL) de álcool fenol/clorofórmio isoamílico (25:24:1). Inverta suavemente cinco vezes e gire para baixo a 16.000 x g por 10 min.
    3. Adicione 1,5 μL de glicogênio, 1/10 volume de NaOAc 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol 100% a um novo tubo de 1,5 mL. Pipete o DNA do tubo de gel de bloqueio de fase e misture invertendo cinco vezes. Incubar durante 1 h a -20 °C.
    4. Gire a 16.000 x g por 35 min a 4 °C. Lave o DNA com 200 μL de etanol a 80% e gire a 16.000 x g por 10 min a 4 ° C.
    5. Seque o pellet ao ar livre e adicione 50 μL de tampão TE ao pellet. Deixe o tubo no gelo por 30 min e ressuspenda suavemente o DNA.
    6. Medir a concentração (OD260) do ADN fragmentado utilizando um espectrofotómetro.
    7. Opcional, mas recomendado: Carregue 1 μg de DNA digerido em um gel de agarose a 0,8% ao lado de um marcador de tamanho para verificar se a digestão está completa. Deixe o gel funcionar durante uma hora a 100 V.
      NOTA: Se incompleto, enzima adicional pode ser adicionada. A digestão incompleta pode levar à perda de resolução após a imunoprecipitação.
    8. Após esta etapa, trate 10 μg de DNA digerido com 4 μL de ribonuclease H (RNase H) por 1-2 h a 37 ° C para garantir que o sinal recuperado após a imunoprecipitação seja derivado de híbridos de DNA: RNA. Em seguida, prossiga para a imunoprecipitação S9.6 (etapa 4).
      NOTA: Os DNAs digeridos podem ser mantidos congelados a -80 °C por até um mês sem perda significativa de rendimento.
  2. Sonication
    1. Sonicar todo ou parte do DNA extraído em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL em volume total de 100 μL. Execute 15-20 ciclos de 30 s ON / 30 s OFF em um sonicador (gire após 5, 10 e 15 ciclos para garantir uma sonicação homogênea).
    2. Medir a concentração (OD260) de ADN sonicado num espectrofotómetro.
      NOTA: Nesta etapa, a viscosidade do DNA deve ter desaparecido.
    3. Execute um gel de agarose para confirmar a distribuição de tamanho do DNA sonicado (300-500 pb).
      NOTA: A sonicação excessiva do DNA pode levar a uma redução significativa no rendimento resultante da quebra e dissociação das estruturas R-loop.
    4. Após esta etapa, trate 10 μg de DNA sonicado com 4 μL de RNase H por 1-2 h a 37 ° C para garantir que o sinal recuperado na imunoprecipitação seja derivado de híbridos de DNA: RNA. Em seguida, prossiga para a imunoprecipitação S9.6 (etapa 4).

4. Imunoprecipitação S9.6

NOTA: As etapas de imunoprecipitação são semelhantes, independentemente de o DNA ter sido fragmentado por meio de REs ou sonicação.

  1. Preparar três tubos e alíquota de 4,4 μg de ADN fragmentado num volume final de 500 μL de tampão TE por tubo. Guarde 50 μL (1/10 do volume) de cada tubo para usar posteriormente como DNA de entrada.
  2. Adicione 50 μL de tampão de ligação 10x (100 mM NaPO4 pH 7, 1,4 M NaCl, 0,5% Triton X-100) e 10 μL de anticorpo S9,6 (1 mg / mL) aos 450 μL do DNA diluído.
  3. Incubar durante a noite a 4 °C num mini-tubo rotador a 7-10 rpm.
  4. Para cada tubo, lave 50 μL de pasta de grânulos de agarose Protein A/G com 700 μL de tampão de ligação 1x invertendo os tubos em um mini-rotador a 7-10 rpm em temperatura ambiente por 10 min. Gire as contas a 1.100 x g por 1 min e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa uma vez.
  5. Adicione o DNA da etapa 4.3 aos 50 μL de grânulos e incube por 2 h a 4 ° C enquanto inverte a 7-10 rpm em um mini-rotador.
  6. Gire as contas por 1 min a 1.100 x g e descarte o sobrenadante.
  7. Lave os grânulos com 750 μL de tampão de ligação 1x invertendo a 7-10 rpm em um mini-rotador por 15 min. Gire para baixo por 1 min a 1.100 x g e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa uma vez.
  8. Adicione 250 μL do tampão de eluição (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 0,5% SDS) e 7 μL de proteinase K (estoque de 20 mg / mL) aos grânulos e incube com rotação a 55 ° C (12 rpm) por 45 min.
  9. Gire as contas por 1 min a 1.100 x g. Transfira o sobrenadante para um tubo de luz de gel de bloqueio de fase pré-fiado de 2 mL e adicione um volume (250 μL) de álcool fenol/clorofórmio isoamílico (25:24:1). Inverta os tubos cinco vezes e gire para baixo por 10 min a 16.000 x g em temperatura ambiente.
  10. Adicione 1,5 μL de glicogênio, 1/10 de volume de NaOAc 3M (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol 100% a um novo tubo de 1,5 mL. Pipete o DNA do tubo de gel de bloqueio de fase e misture invertendo cinco vezes. Incubar durante 1 h a -20 °C.
  11. Gire a 16.000 x g por 35 min a 4 °C. Lave o DNA com 200 μL de etanol a 80% e gire a 16.000 x g por 10 min a 4 ° C.
  12. Seque os pellets ao ar e adicione 15 μL de Tris-Cl 10 mM (pH 8) em cada tubo. Deixe os tubos no gelo por 20 min e ressuspenda suavemente. Combine o conteúdo dos três tubos em um tubo (45 μL).
  13. Verifique a eficiência do DRIP por qPCR usando 5 μL do DNA ressuspenso de 45 μL (ver Resultados Representativos). Diluir os 5 μL em 10 μL de água e utilizar 2 μL por reação.

5. Etapa de pré-biblioteca apenas para DNA sonicado

NOTA: A sonicação leva a fita ssDNA deslocada de R-loops a quebrar. Assim, as estruturas de loop R de três fitas são convertidas em híbridos de DNA: RNA de duas fitas após a sonicação. Como resultado, esses híbridos de DNA: RNA devem ser convertidos de volta em DNA de fita dupla antes da construção da biblioteca. Aqui, uma segunda etapa de síntese de fita é empregada. Uma abordagem alternativa que tem sido usada com sucesso é, em vez disso, realizar uma ligação de DNA de fita simples seguida por uma síntese de segunda fita53.

  1. Aos 40 μL de DNA DRIP da etapa 4.12, adicione 20 μL de tampão de fita 5x segunda (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl2, 425 mM KCl), mistura dNTP de 10 mM (dATP, dCTP, dGTP e dTTT ou dUTP se o usuário estiver planejando obter sequenciamento DRIP específico da fita), 1 μL 16 mM NAD, e 32 μL de água. Misture bem e incube por 5 min no gelo.
  2. Adicione 1 μL de DNA polimerase I (10 unidades), 0,3 μL de RNase H (1,6 unidades) e 0,5 μL de E. coli DNA ligase. Misturar e incubar a 16 °C durante 30 min.
  3. Limpe imediatamente a reação usando esferas paramagnéticas com uma proporção de 1,6x. Eluir o ADN em 40 μL de Tris-Cl 10 mM (pH 8).

6. Etapa de sonicação pré-biblioteca apenas para RE DNA

NOTA: O DRIP leva à recuperação de fragmentos de RE que geralmente têm quilobases de comprimento e, portanto, não são adequados para a construção imediata de bibliotecas.

  1. Para reduzir o tamanho do material para construção da biblioteca, sonicar o DNA imunoprecipitado em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL. Execute 12 ciclos de 15 s ON / 60 s OFF em um sonicador (gire após seis ciclos para garantir uma sonicação homogênea). Prossiga para a etapa 7.
    NOTA: O material imunoprecipitado ainda carrega as alças R de três fitas que respondem à sonicação de maneira diferente do DNA de fita dupla flanqueadora.
  2. Etapa opcional: Para uniformizar os perfis de DRI, trate o material imunoprecipitado com 1 μL de RNase H em 1x tampão RNase H por 1 h a 37 ° C antes da sonicação.

7. Construção de bibliotecas

  1. Execute o reparo final adicionando aos 40 μL da etapa 4.12 (fragmentação RE) ou etapa 5.3 (cisalhamento por sonicação) 5 μL de tampão do módulo de reparo final 10x, 2.5 μL de ATP 10 mM e 2.5 μL da enzima do módulo de reparo final (50 μL no total). Misture bem e incube por 30 min em temperatura ambiente. Inclua 1 μg de DNA de entrada RE-digerido e sonicado (DRIP) ou sonicado (sDRIP) para criar bibliotecas de sequenciamento de controle correspondentes ao DNA de entrada.
  2. Limpe a reação usando grânulos paramagnéticos (proporção de 1,6x) e elua em 34 μL de Tris-Cl 10 mM (pH 8).
  3. Realize o A-tailing adicionando 5 μL de tampão 2, 10 μL de 1 mM dATP e 1 μL de exo- de Klenow (50 μL no total). Misture bem e incube a mistura por 30 min a 37 °C.
  4. Limpe a reação usando grânulos paramagnéticos (proporção de 1,6x) e elua em 12 μL de Tris-Cl 10 mM (pH 8).
  5. Ligate adaptadores adicionando 15 μL de 2x tampão de ligação rápida, 1 μL de adaptadores de 15 μM e 2 μL de ligase rápida (30 μL no total). Misture bem e incube por 20 min em temperatura ambiente.
  6. Limpe a reação usando grânulos paramagnéticos (proporção de 1x) e elua em 20 μL de Tris-Cl 10 mM (pH 8).
  7. Se o cisalhamento por sonicação foi realizado e o dUTP foi usado na etapa 5.1, adicione 1,5 μL (1,5 U) de Uracila N-glicosilase e incube por 30 min a 37 ° C para obter um DRIP específico da fita.
  8. A PCR amplifica 10 μL da biblioteca da etapa 6.6 ou 6.7. Adicione 1 μL de primer PCR 1.0 P5 (consulte a Tabela de Materiais), 1 μL de primer PCR 2.0 P7 (consulte a Tabela de Materiais), 15 μL de master mix e 3 μL de água. Misture bem.
  9. Em um termociclador, execute o programa conforme mostrado na Tabela 1.
  10. Prossiga para uma limpeza em duas etapas da biblioteca usando esferas paramagnéticas. Primeiro, use uma proporção de 0,65x para remover fragmentos acima de 500 pb. Mantenha o sobrenadante. Prossiga para uma proporção de 1x no sobrenadante para remover fragmentos abaixo de 200 pb. Eluir em 12 μL de Tris-HCl 10 mM (pH 8).

8. Controle de qualidade

  1. Para verificar os enriquecimentos de R-loop com qPCR em dois loci negativos e três positivos usando o método Pfaffl, use 1 μL da biblioteca de limpeza da etapa 6.10. Diluir 1 μL da biblioteca em 10 μL de água e utilizar 2 μL por locus.
  2. Verifique a distribuição de tamanho da biblioteca limpa da etapa 6.10 usando um kit de DNA de alta sensibilidade.

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Resultados

O DRIP e o sDRIP podem ser analisados por meio de qPCR (Figura 2A) e/ou sequenciamento (Figura 2B). Após a etapa de imunoprecipitação, a qualidade do experimento deve ser primeiro confirmada por qPCR em loci de controle positivo e negativo, bem como com controles tratados com RNase H. Os primers correspondentes a loci usados com frequência em várias linhagens de células humanas são fornecidos na Tabela 2. Os resultados da qPCR devem ser exibidos...

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Discussão

Aqui estão descritos dois protocolos para mapear estruturas de R-loop em potencialmente qualquer organismo usando o anticorpo S9.6. O DRIP-seq representa a primeira técnica de mapeamento R-loop de todo o genoma desenvolvida. É uma técnica fácil, robusta e reprodutível que permite mapear a distribuição de R-loops ao longo de qualquer genoma. A segunda técnica, denominada sDRIP-seq, também é robusta e reprodutível, mas atinge maior resolução e especificidade de fita devido à inclusão de um...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

O trabalho no laboratório Chedin é apoiado por uma bolsa do National Institutes of Health (R01 GM120607).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 15 mL Gel de bloqueio de fase Maxtract de alta densidadeQiagen129065
Tubo de 2 mL de gel de bloqueio de fase luzVWR10847-800
Contas A/G de agaroseThermoFisher Scientific20421
Contas Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glicosilaseThermoFisher ScientificN8080096
Adaptadores de índiceIlluminaCorresponde ao TrueSeq Índices únicos
Fragmento de Klenow (3' a 5' exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext Módulo de reparo finalNew England BioLabsE6050
PCR primers para amplificação debibliotecaprimer 1.0 P5 (5' AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3')
Primers de PCR para amplificação dePCR primer 2.0 P7 (5' CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3')
Fenol/clorofórmio Álcool isoamílico 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash PCR de alta fidelidade master mixThermoFisher ScientificF548S
Kit de ligação rápidaNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AnticorpoKerafastENH001Estes três as fontes são
equivalentes S9.6 AnticorpoMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AnticorpoAbcamab234957
biblioteca

Referências

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