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Artigo de método

Mapeamento de R-Loops e RNA: Híbridos de DNA com Métodos de Imunoprecipitação Baseados em S9.6

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DOI:

10.3791/62455

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24 de agosto de 2021

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Neste artigo

Resumo

Os R-loops constituem uma classe prevalente de estruturas de DNA não-B orientadas por transcrição que ocorrem em todos os genomas, dependendo da sequência de DNA e da favorabilidade topológica. Nos últimos anos, os R-loops têm sido implicados em uma variedade de papéis adaptativos e desadaptativos e têm sido associados à instabilidade genômica no contexto de distúrbios humanos. Como consequência, o mapeamento preciso dessas estruturas em genomas é de grande interesse para muitos investigadores. DRIP-seq (DNA: RNA Imunoprecipitação seguida de sequenciamento de alto rendimento) é descrito aqui. É uma técnica robusta e reprodutível que permite o mapeamento preciso e semiquantitativo de R-loops. Uma iteração recente do método também é descrita na qual a fragmentação é realizada usando sonicação (sDRIP-seq), que permite o mapeamento específico da fita e de alta resolução de loops R. O sDRIP-seq, portanto, aborda algumas das limitações comuns do método DRIP-seq em termos de resolução e encalhe, tornando-o um método de escolha para mapeamento de loop R.

Resumo

Os R-loops constituem uma classe prevalente de estruturas de DNA não-B orientadas por transcrição que ocorrem em todos os genomas, dependendo da sequência de DNA e da favorabilidade topológica. Nos últimos anos, os R-loops têm sido implicados em uma variedade de papéis adaptativos e desadaptativos e têm sido associados à instabilidade genômica no contexto de distúrbios humanos. Como consequência, o mapeamento preciso dessas estruturas em genomas é de grande interesse para muitos investigadores. DRIP-seq (DNA: RNA Imunoprecipitação seguida de sequenciamento de alto rendimento) é descrito aqui. É uma técnica robusta e reprodutível que permite o mapeamento preciso e semiquantitativo de R-loops. Uma iteração recente do método também é descrita na qual a fragmentação é realizada usando sonicação (sDRIP-seq), que permite o mapeamento específico da fita e de alta resolução de loops R. O sDRIP-seq, portanto, aborda algumas das limitações comuns do método DRIP-seq em termos de resolução e encalhe, tornando-o um método de escolha para mapeamento de loop R.

Introdução

R-loops são estruturas de ácido nucleico de três fitas que se formam principalmente durante a transcrição após a hibridização do transcrito de RNA nascente para a fita de DNA molde. Isso resulta na formação de um híbrido RNA:DNA e causa o deslocamento da fita de DNA não molde em um estado de loop de fita simples. A reconstituição bioquímica 1,2,3,4 e a modelagem matemática5, em combinação com outras medidas biofísicas 6,7, estabeleceram que as alças ....

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Protocolo

O protocolo a seguir é otimizado para a linha celular Ntera-2 humana cultivada em cultura, mas foi adaptado com sucesso sem modificação para uma variedade de outras linhagens de células humanas (HEK293, K562, HeLa, U2OS), células primárias (fibroblastos, células B), bem como em outros organismos com pequenas modificações (camundongos, moscas).

1. Colheita e lise celular

  1. Cultive células Ntera-2 para 75% -85% de confluência. Certifique-se de que a contagem ideal de células seja de 5 a 6 milhões de células com >90% de contagens viáveis para iniciar qualquer procedimento de DRIP.
  2. Lave as c....

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Resultados

O DRIP e o sDRIP podem ser analisados por meio de qPCR (Figura 2A) e/ou sequenciamento (Figura 2B). Após a etapa de imunoprecipitação, a qualidade do experimento deve ser primeiro confirmada por qPCR em loci de controle positivo e negativo, bem como com controles tratados com RNase H. Os primers correspondentes a loci usados com frequência em várias linhagens de células humanas são fornecidos na Tabela 2. Os resultados da qPCR devem ser exibidos.......

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Discussão

Aqui estão descritos dois protocolos para mapear estruturas de R-loop em potencialmente qualquer organismo usando o anticorpo S9.6. O DRIP-seq representa a primeira técnica de mapeamento R-loop de todo o genoma desenvolvida. É uma técnica fácil, robusta e reprodutível que permite mapear a distribuição de R-loops ao longo de qualquer genoma. A segunda técnica, denominada sDRIP-seq, também é robusta e reprodutível, mas atinge maior resolução e especificidade de fita devido à inclusão de um.......

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

O trabalho no laboratório Chedin é apoiado por uma bolsa do National Institutes of Health (R01 GM120607).

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 15 mL Gel de bloqueio de fase Maxtract de alta densidadeQiagen129065
Tubo de 2 mL de gel de bloqueio de fase luzVWR10847-800
Contas A/G de agaroseThermoFisher Scientific20421
Contas Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glicosilaseThermoFisher ScientificN8080096
Adaptadores de índiceIlluminaCorresponde ao TrueSeq Índices únicos
Fragmento de Klenow (3' a 5' exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext Módulo de reparo finalNew England BioLabsE6050
PCR primers para amplificação debibliotecaprimer 1.0 P5 (5' AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3')
Primers de PCR para amplificação dePCR primer 2.0 P7 (5' CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3')
Fenol/clorofórmio Álcool isoamílico 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash PCR de alta fidelidade master mixThermoFisher ScientificF548S
Kit de ligação rápidaNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AnticorpoKerafastENH001Estes três as fontes são
equivalentes S9.6 AnticorpoMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AnticorpoAbcamab234957
biblioteca

Referências

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R.

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Reimpressões e permissões

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