Method Article

Um design experimental de sujeito interno usando uma tarefa de localização de objetos em ratos

DOI:

10.3791/62458

⸱

May 6th, 2021

 ,  ,  , 
1Danish Research Institute of Translational Neuroscience (DANDRITE), Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Universitätsklinikum Würzburg, Institut für Klinische Neurobiologie, 3Translational Neuropsychiatry Unit, Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 4Faculty of Science, Radboud University, 5Center for Proteins in Memory - PROMEMO, Danish National Research Foundation, Department of Biomedicine, Aarhus University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo fornece etapas detalhadas para uma tarefa de localização de objetos com quatro repetições usando a mesma coorte de ratos. Codificação fraca e forte pode produzir memórias de curto e longo prazo. A flexibilidade do protocolo com a repetição pode ser benéfica para estudos envolvendo operações cirúrgicas economizando tempo e trabalho.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O reconhecimento do local de objeto é um método proeminente usado para investigar a memória espacial em roedores. Esta memória de reconhecimento de local de objeto forma a base da tarefa de localização do objeto. Este artigo fornece um protocolo extensivo para orientar o estabelecimento de uma tarefa de localização de objetos com a opção de até quatro repetições usando a mesma coorte de ratos. Protocolos de codificação fracos e fortes podem ser usados para estudar memórias espaciais de curto e longo prazo de força variada e para permitir a implementação de manipulações relevantes inibidoras de memória ou -aprimoradas. Além disso, a repetição do teste com o contrabalanciamento aqui apresentado permite a combinação de resultados de dois ou mais testes para comparação interna para reduzir a variabilidade entre ratos. Este método ajuda a aumentar o poder estatístico e é fortemente recomendado, particularmente na execução de experimentos que produzem alta variação no comportamento individual. Isso refina diretamente o estudo aumentando os dados obtidos de cada animal e reduzindo o número total de animais necessários. Finalmente, a implementação da tarefa de localização de objetos repetidos aumenta a eficiência dos estudos que envolvem procedimentos cirúrgicos economizando tempo e trabalho.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarefas de reconhecimento espontâneo (por exemplo, reconhecimento de objetos, reconhecimento de objetos) têm sido utilizadas em grande medida na investigação da memória em roedores. Esses testes são diferentes da variedade de testes utilizados para avaliar a memória que se baseiam no condicionamento do medo ou na motivação da recompensa, na qual as tarefas de reconhecimento espontâneo são baseadas apenas no comportamento exploratório espontâneo em relação a novos estímulos. Esse comportamento, referido como "preferência neolética"1,é inerente a roedores, bem como em outras espécies de mamíferos e alguns não-mamíferos, como aves e peixes2. O reconhecimento do local do objeto, que depende da memória espacial, pode ser observado usando a tarefa de localização do objeto (também conhecida como tarefa de reconhecimento de objetos espaciais)3. Estudos de lesão mostraram que o reconhecimento do local do objeto requer um hipocampo intacto4,5. Devido ao protocolo de treinamento relativamente simples e à ausência de qualquer reforço, essa tarefa é preferível em muitos estudos. A ausência de reforço positivo e negativo minimiza os parâmetros adicionais e regiões cerebrais que podem impulsionar o comportamento. Assim, o comportamento aqui é neutro e é baseado na curiosidade e na memória espacial, permitindo a investigação de mecanismos que estão envolvidos na codificação, consolidação e recuperação da memória espacial.

O protocolo para a tarefa de localização de objetos normalmente consiste em sessões de habitação seguidas de uma única sessão de testes de codificação e teste, separadas por um período de atraso, que varia de vários minutos para horas. Recomenda-se fortemente que os ratos sejam tratados de antemão para minimizar o nível de estresse dos animais e, portanto, comportamentos que possam afetar a memória de reconhecimento, como a aversão à novidade. Da mesma forma, um protocolo de habitação bem desenhado desempenha um papel essencial na prevenção do estresse que pode dificultar o comportamento natural do rato durante a tarefa. No entanto, a extensão do manuseio e da habitação varia em grande parte entre laboratórios e experimentadores, o que pode contribuir para a baixa replicabilidade6,7,8. No teste de codificação, o rato tem tempo para explorar uma arena com dois objetos idênticos localizados em dois cantos designados. No teste, que é adiado por um período, o rato tem tempo para explorar a arena com o mesmo par de objetos, mas desta vez um deles foi movido para um novo local. A preferência espontânea exibida pelos ratos e o consequente aumento do tempo gasto explorando o objeto no novo local são indicativos de reconhecimento espacial e da memória dos locais do objeto3. A modificação do ensaio de codificação (duração e número de repetições) influencia a força da memória.

Dependendo do objetivo do estudo, o comprimento do atraso entre a codificação e os ensaios de teste pode ser modificado para modelar memória de curto prazo independente da proteína ou memória de longo prazo dependente de proteínas. Assim, a tarefa de localização do objeto pode ser usada para uma ampla variedade de estudos, adaptando o protocolo conforme necessário. Além disso, também são possíveis a implementação de manipulações experimentais, como intervenções farmacológicas e optogenéticas entre esses ensaios, assim como a imagem in vivo. Existem vários estudos9,10 que relatam iterações repetidas da tarefa de localização do objeto dentro da mesma coorte de ratos. Isso contrasta com o uso tradicional em que um animal tem uma sessão sem repetições. No entanto, a eficácia desses paradigmas não foi investigada minuciosamente, nem há nenhum documento de método que os descreva. Até onde sabemos, esta é a primeira descrição relatada de um protocolo que descreve em detalhes uma tarefa de localização de objeto com até quatro repetições usando a mesma coorte de ratos, que também compara sistematicamente os resultados de cada repetição. As repetições podem ser usadas para contrabalançar as condições experimentais para permitir a comparação entre sujeitos com a variabilidade reduzida entre os testes. A repetição confiável da tarefa permite que os dados sejam agrupados, o que significa que uma quantidade suficientemente grande de dados pode ser gerada usando um número relativamente pequeno de ratos. Finalmente, as repetições usando o mesmo rato podem ser benéficas em experimentos envolvendo operações cirúrgicas e implantações, diminuindo o número de ratos necessários que, consequentemente, economizam tempo e custos de mão-de-obra.

Este estudo apresenta um protocolo extenso detalhando como executar uma tarefa de localização de objetos em ratos adultos usando testes de codificação fortes e fracos seguidos de testes de teste com atrasos de 1h e 24 horas. O forte protocolo de codificação produz memória de reconhecimento estatisticamente significativa quando testada com atrasos de 1h e 24h e, portanto, pode ser usada para estudar memórias de curto e longo prazo após a implementação de manipulações para inibir essas memórias11. Em contraste, o protocolo de codificação fraco só produz memória significativa de curto prazo quando testado com um atraso de 1h. A ausência de memória de longo prazo pode ser usada para estudar manipulações para melhorar a retenção da memória11,12. Este protocolo também inclui sessões detalhadas de manuseio e habitação, que visam aumentar a replicabilidade da tarefa de localização do objeto. Este artigo também demonstra a repetição da tarefa em quatro contextos distintos com a mesma coorte de ratos usando o fraco protocolo de codificação, que é confirmado para produzir resultados replicáveis e consistentes a cada vez.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelas Autoridades Nacionais Dinamarquesas (Número de Licença: 2018-15-0201-01405) de acordo com as legislações dinamarquesas e de bem-estar animal da UE.

1. Configuração experimental e preparação de contextos distintos

  1. Arena de localização de objetos com contexto
    NOTA: A configuração abaixo é demonstrada em uma caixa à prova de som fechada(Figura 1B)com a fonte de luz localizada ao longo das bordas do teto e a câmera localizada no centro do teto da caixa. A arena, de 60 cm x 60 cm com paredes de 100 cm de altura (Figura 1B),é colocada dentro da caixa e está totalmente isolada da sala circundante. Todas as pistas espaciais estão dentro da arena. Isso simplifica o processo de criação de contextos distintos. Um nível semelhante de isolamento da sala circundante pode ser alcançado envolvendo uma arena normal de campo aberto com uma cortina uniforme ao redor das paredes.
    1. Obtenha uma arena quadrada feita de plástico duro opaco e não poroso com largura mínima de 60 cm e um mínimo de 50 cm de altura. Escolha uma cor para o piso contrastando com a cor do rato para gravação bem sucedida dos movimentos dos ratos pelo software automatizado (se aplicável). Coloque a arena dentro de uma caixa(Figura 1B) ou em uma plataforma que está fechada por uma cortina.
    2. Para criar um contexto, obtenha uma segunda camada de paredes inseridas (por exemplo, revestimento de parede feito do mesmo material da arena, ou papel de parede plástico que pode ser facilmente limpo) em cores e/ou padrões diferentes(por exemplo, preto, branco, listras ou pontos). Insira a segunda camada de paredes na arena de tal forma que elas sejam distintas umas das outras.
    3. Obtenha pistas espaciais tridimensionais (3D) (1-2 por contexto) com dimensões variando entre 10 cm x 10 cm x 5 cm e 20 cm x 15 cm x 15 cm (largura x comprimento x altura) e têm (i) formas geométricas distintas e (ii) cores que contrastam a cor da parede. Pendurá-los nas paredes altas o suficiente para que os ratos não possam alcançar essas pistas.
    4. Obtenha diferentes pares de objetos (tanto quanto o número de contexto) que são não porosos, não mastigáveis e fáceis de limpar. Procure ter formas geométricas e texturas distintas para cada novo objeto. Escolha objetos entre 5 a 15 cm de largura e altura (evite objetos mais altos). Consulte a Figura 1D para exemplos de quatro objetos distintos (cones, bolas de futebol, prismas retangulares e prismas triangulares).
      NOTA: Cada objeto deve ser de interesse semelhante aos ratos, de modo que os tempos totais de exploração de todos os objetos sejam comparáveis.
    5. Encontre a melhor solução para anexar os objetos no chão da arena (por exemplo, usando tapetes pegajosos, fita dupla face, anexando uma placa de metal sob o objeto e um ímã de pareamento sob a arena etc.).
    6. Ao criar outro contexto, recriem as paredes de tal forma que contrastam a distribuição de cor e padrão das paredes do contexto anterior. Use novas pistas espaciais 3D diferentes e contrastando com todas as pistas anteriores. Consulte a Figura 1C para exemplos de quatro contextos distintos.
    7. Obtenha uma fonte de luz que garanta uma iluminação difusa e igual dentro da arena e que tenha uma opção mais fraca. Ajuste a intensidade da luz para aproximadamente 100-120 lux nos cantos da arena após a criação de cada contexto. Obtenha uma câmera e coloque-a no centro do teto da caixa.
      NOTA: A intensidade da luz pode ser ajustada a um nível mais baixo se o software de pontuação automatizado não estiver sendo usado.
  2. Balde de objeto
    1. Obtenha um balde (>50 cm de diâmetro). Não escolha uma forma quadrada para evitar qualquer semelhança com a arena experimental. Encha-o com material de cama.
    2. Obtenha 5-10 objetos de diferentes formas e tamanhos (diferentes dos objetos que serão usados no experimento) e coloque-os aleatoriamente todos no balde(Figura 1A).

figure-protocol-1
Figura 1: A configuração experimental, incluindo quatro contextos e objetos distintos. (A) O balde de objeto para a habitação do objeto. (B) O aparelho de experimento (à esquerda), envolvendo a arena de localização do objeto, a câmera e a fonte de luz. A caixa experimental e a arena antes da configuração do contexto (meio) e arena com configuração de contexto (à direita). (C) Quatro contextos (1-4) com cores e padrões de parede distintos, bem como pistas espaciais tridimensionais. (D) Quatro objetos que são usados nos contextos 1-4, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Software de câmera e rastreamento (opcional)
    1. Obtenha um software que possa ser usado para controlar remotamente o gravador da câmera e que possa rastrear narizes de rato. Faça os ajustes de software para cada contexto específico e tensão de rato antes de cada experimento.
  2. Contrabalanceamento de locais de objetos e grupos experimentais
    1. Prepare possíveis combinações de locais de objetos para testes de codificação e teste e nomeie-os como contadores. Crie as combinações de tal forma que elas cobrem todos os cantos como localizações de objeto, e movimento de objetos de cantos diagonais adjacentes e vice-versa (Figura 2A).
    2. Prepare um cronograma para o experimento específico, combinando cada rato em um grupo experimental com um contador. Use cada par dos dois contadores emparelhados(Figura 2A) dentro de um grupo, se houver ratos suficientes. Use o mesmo conjunto de contadores para ambos os grupos experimentais em uma única sessão de codificação/teste(Figura 2B). Retribuas para as sessões seguintes (ou seja, cada novo contexto).
      NOTA: Execute os ratos em uma ordem mista durante as sessões de codificação/teste (por exemplo,não execute todos os ratos em uma gaiola uma após a outra; em vez disso, gire gaiolas para garantir um ambiente calmo dentro de uma gaiola de mais de um rato).
    3. Ao usar dois ou mais contextos para contrabalançar os grupos experimentais (por exemplo, memória 1-h versus grupos de memória 24h), atribuir ratos a cada grupo e alterar os grupos nos seguintes contextos(Figura 2B).

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Figura 2: Métodos representativos de contrabalanciamento. (A) Possíveis orientações de objetos na arena em ensaios de codificação e teste são nomeados como contadores. O objeto 1 é sempre o objeto em movimento. A cada dois contadores são contrabalanceados de tal forma que a localização do objeto em movimento muda. Cada canto é ocupado duas vezes, e o objeto 1 é movido de diagonal para adjacente e vice-versa para um número igual de vezes. (B) Exemplo de codificação/cronograma de teste para duas sessões contrabalanceadas (por exemplo, contextos 1 e 2). Os ratos são atribuídos a condições experimentais no contexto 1 (sessão X, à esquerda). Um conjunto de pares de contadores (ou seja, 1-2, 3-4, 5-6 e 7-8) são selecionados e atribuídos a cada rato em um grupo experimental. O mesmo conjunto de contadores é atribuído a ratos em ambos os grupos experimentais. Na sessão seguinte no contexto 2 (sessão X+1; à direita), os ratos dos grupos experimentais são alterados para contrabalanciamento, e um novo conjunto de pares de contadores são atribuídos. O tempo no início dos testes de codificação e teste deve ser observado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: Todas as sessões de manuseio, habitação e codificação/teste neste protocolo foram otimizadas durante a fase de luz de um ciclo claro/escuro de 12 horas e, portanto, recomenda-se que os experimentos sejam realizados durante a fase de luz.

2. Manuseio e habitação

  1. Comece a manusear ratos a partir do desmamar (se os ratos forem criados na instalação doméstica) ou 2-3 semanas antes do início dos experimentos (no caso de os ratos serem ordenados de uma instalação externa, depois de permitir que eles se aclimatem por uma semana após a chegada).
  2. Passe pelo menos 10-15 min em cada gaiola de 4 ratos por 2 ou 3 dias por semana até que os ratos se sentem confortáveis em serem tocados e pegos pelo experimentador. Ajuste o tempo alocado por gaiola, dependendo do número de ratos em uma gaiola.
    NOTA: É importante que todos os experimentadores que esperam trabalhar com os ratos estejam presentes durante o manuseio.
  3. Nos casos em que o manuseio começa no desmamar, reduza o manuseio ao mínimo (opcional) uma vez que esse nível seja atingido. Se começar de 2 a 3 semanas antes dos experimentos, continue manuseando até o início das sessões de habituação.
  4. Levem os ratos em suas gaiolas para a sala de experimentos para habituar os ratos ao transporte, bem como à sala experimental. Deixe os ratos sentarem-se por pelo menos 30 minutos para lhes dar tempo para se acalmarem e habituarem. Após esse tempo, devolva os ratos/gaiolas para a sala de alojamento.
    NOTA: O passo 2.4 pode ser combinado com manuseio e repetido quantas vezes for necessário. A habitação adicional pode ser implementada nesta etapa se o protocolo incluir quaisquer outras manipulações (por exemplo, manuseio para o procedimento de injeções etc.).
  5. Realize a habituação de objetos para habituar ratos a interagir com objetos e reduzir os níveis gerais de estresse decorrentes da experiência de novos ambientes.
    1. Para a sessão 1, traga todas as gaiolas para a sala de experimentos, e deixe os ratos habituarem-se à sala e se contentarem com pelo menos 30 minutos. Coloque ratos (2-4 ratos) da mesma gaiola juntos no balde por 20 minutos. Limpe o balde removendo qualquer matéria fecal entre cada grupo de ratos. Repita o procedimento para todas as gaiolas. Coloque todos os ratos em suas gaiolas e volte para a sala de alojamento.
    2. Para a sessão 2, em um dia separado, traga todas as gaiolas para a sala de experimentos e deixe por pelo menos 30 minutos. Coloque cada rato individualmente no balde por 10 minutos. Coloque o rato de volta na gaiola e limpe o balde depois de cada rato. Devolva todas as gaiolas para a sala de alojamento.
    3. Para a sessão 3, repita a etapa 2.5.2 em um dia separado.
  6. Se o aparelho experimental for uma caixa fechada(Figura 1B),opte por realizar a habituação de caixa vazia para habituar os ratos ao novo aparelho experimental. Na sessão 4, leve todas as gaiolas para a sala de experimentos e deixe por pelo menos 30 minutos. Coloque os ratos da mesma gaiola juntos (2-4 ratos) na arena vazia sem contexto ou pistas espaciais(Figura 1B, meio) por 20 minutos. Coloque todos os ratos de volta na gaiola de casa, e limpe a arena com 70% de etanol depois de cada grupo de ratos.
    NOTA: As etapas 2.5 e 2.6 devem ser realizadas em uma única semana, precedendo a semana de habitação do contexto (etapa 2.7; ver Figura 3). Uma pausa por alguns dias durante esses passos é aceitável. No entanto, após a largada da etapa 2.7, cada etapa deve ser realizada em dias consecutivos conforme especificado, até o término do teste (etapa 2.9).
  7. Realizar a habituação de contexto para habituar ratos ao contexto e pistas 3D, reduzir os níveis gerais de estresse e apoiar a aprendizagem espacial do ambiente.
    1. Modifique a arena vazia para criar o primeiro contexto conforme descrito na seção 1.1, mas não coloque os objetos na arena. Prepare o equipamento de gravação.
    2. Para a sessão 1, leve todas as gaiolas para a sala de experimentos e deixe por pelo menos 30 minutos. Inicie o gravador se fizer isso manualmente. Coloque o primeiro rato no centro da arena, e permita que o rato explore a arena por 10 minutos. Em seguida, pare o gravador (se manual), e coloque o rato de volta na gaiola doméstica. Limpe a arena completamente com 70% de etanol após cada rato, e devolva todas as gaiolas para a sala de alojamento quando terminar.
    3. Para as sessões 2 e 3, repita a etapa 2.7.2 para cada rato ao longo de dois dias consecutivos, de talto que haja 3 sessões de habitação de contexto por rato no total.
      NOTA: Considere embaralhar a ordem em que os ratos vão para a arena, especialmente quando se trata de um grande grupo. Isso evita correr ratos específicos repetidamente na mesma hora do dia.

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Figura 3: O desenho do experimento comportamental, incluindo protocolos de tarefa de manuseio, habituação e localização de objetos. Ratos devem ser tratados regularmente a partir de algumas semanas antes da semana de habituação. Na semana 0, as habituações de objetos e caixas experimentais são realizadas ao longo de 4 sessões com intervalos de pelo menos 24h entre elas. Na semana 1, a habituação de contexto é realizada ao longo de 3 sessões consecutivas com intervalos de 24h no meio, seguida por testes de codificação e teste. Deve haver um intervalo mínimo de 48h e até 1 semana antes de prosseguir com a sessão seguinte (por exemplo, iniciar a habituação para o próximo contexto na semana 2 ou 3). Abreviação: Hab., habituação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Ensaio de codificação (Sessão 4)
    NOTA: No caso de manipulações farmacológicas, um tempo razoável para administrar um agente pode ser antes ou imediatamente após o teste de codificação e/ou antes do teste, dependendo da natureza do agente farmacológico.
    1. Leve todas as gaiolas para a sala de experimentos e deixe por pelo menos 30 minutos. Utilizando o cronograma preparado antecipadamente(Figura 2B),coloque o primeiro par idêntico de objetos nos locais designados (em 2 cantos e uma distância de >10 cm de cada parede respectiva; um pedaço de papelão em forma de L pode ser usado para manter a mesma distância cada vez) usando tapetes pegajosos ou fita dupla face.
    2. Inicie o gravador (se manual). Coloque o primeiro rato na arena de frente para uma parede ou um canto que não seja ocupado por qualquer objeto (distância igual a cada objeto).
      NOTA: Siga os passos abaixo para codificação fraca ou forte.
    3. Para codificação fraca (1 ensaio), permita que o rato explore a arena e os objetos por 20 minutos. Em seguida, pare o gravador (se manual) e coloque o rato de volta na gaiola doméstica. Remova os objetos e limpe os objetos e a arena com 70% de etanol.
    4. Repita o passo 2.8.3 para todos os ratos para que cada rato receba 1 teste de codificação de 20 min.
    5. Para codificação forte (3 ensaios), permita que o rato explore a arena e os objetos por 5 minutos. Em seguida, pare o gravador (se manual) e coloque o rato de volta na gaiola doméstica. Não remova os objetos. Limpe a arena e os objetos com 70% de etanol.
    6. Repita o passo 2.8.5 mais duas vezes com o mesmo rato de tal forma que haja 3 ensaios no total. Coloque o rato de volta na gaiola quando o tempo acabar. Remova os objetos para limpeza minuciosa, e limpe os objetos e a arena com 70% de etanol.
      NOTA: O intervalo inter-ensaio para um rato deve ser de aproximadamente 1-2 min.
    7. Repetir as etapas 2.8.5-2.8.6 para cada rato.
    8. Se o tempo de atraso for menor que 24h, mantenha as gaiolas na sala de experimento até o teste. Se não, devolva todas as gaiolas para a sala de alojamento quando concluída.
  2. Teste de teste (Sessão 4)
    NOTA: O período de atraso deve ser contado desde o início do ensaio de codificação.
    1. Em caso de atraso de 24 horas (ou qualquer atraso que exija que o teste seja realizado no dia seguinte), leve todas as gaiolas para a sala de experimentos, deixando tempo suficiente antes do primeiro teste para que os ratos possam ser deixados por pelo menos 30 minutos. De acordo com o cronograma, coloque os objetos nos locais designados (um dos objetos em um novo local).
    2. Quando for a hora, inicie o gravador (se manual). Coloque o primeiro rato na arena de frente para uma parede ou um canto que não seja ocupado por qualquer objeto (distância igual a cada objeto).
    3. Deixe o rato explorar a arena e objetos por 5 minutos. Em seguida, pare o gravador (se manual). Coloque o rato de volta na jaula. Remova os objetos e limpe os objetos e a arena com 70% de etanol.
    4. Repita as etapas 2.9.2-2.9.3 para cada rato. Devolva todas as gaiolas de volta para a sala de alojamento.
      NOTA: Em cada sessão de codificação/teste seguinte, inicie o protocolo de habitação a partir da etapa 2.7 (habitação de contexto) após um intervalo de pelo menos 48h e até 1 semana.

3. Análise de dados

  1. Para cada rato, marque o tempo de exploração de cada objeto tanto nos testes de codificação quanto de teste usando software projetado para este fim ou usando uma configuração manual. Testes de codificação de pontuação durante toda a duração. Teste de pontuação por 2 min para melhor desempenho de discriminação3. Se usar a pontuação automatizada de software on-line, exporte os dados de pontuação do software.
  2. Conte o tempo de exploração quando o rato estiver em contato com o objeto, cheirando o objeto ou de frente para o objeto a uma distância inferior a 2 cm. Inclua escalar e sentar-se no objeto como exploração, a menos que a atenção do rato pareça estar em outro lugar além do objeto (por exemplo, olhando para longe do objeto).
  3. Calcule o tempo total de exploração de ambos os objetos para cada rato. Considere excluir qualquer rato que tenha um tempo total de exploração inferior a 10 s no teste (para pontuação de 2 minutos) deste teste, pois pode refletir exploração não confiável.
  4. Calcule a porcentagem de exploração para cada objeto (equação 1)ou o índice de discriminação (DI) para cada rato (equação 2) e calcule valores médios para os grupos.
    figure-protocol-4 (1)
    figure-protocol-5
    NOTA: Se a exploração % for de 50% ou DI é 0, significa que o desempenho está no nível de chance, e o rato não tem preferência por nenhum dos dois objetos. A porcentagem média de exploração e DI durante os ensaios de codificação deve ser de ~50% ou 0, respectivamente. Qualquer rato que mostrar preferência superior [± média (2 × SD)] para qualquer objeto no ensaio de codificação deve ser excluído da análise do respectivo teste. Isso permite uma interpretação confiável da preferência no ensaio de teste como a memória do local do objeto estável. Esse valor pode ser calculado para um teste individual ou para dados combinados de codificação de vários testes.
  5. Analise os dados pelo método que melhor se encaixa na configuração experimental. Use um teste tde uma amostra para detectar uma preferência significativa acima do nível de chance.
  6. Ao utilizar mais de um contexto com contrabalanceamento, combine os resultados da mesma condição experimental em contextos.
    NOTA: Isso resultará em grupos que consistem nos mesmos ratos, permitindo a comparação entre sujeitos usando um teste temparelhado para dois grupos e utilizando análise de medidas repetidas de variância (ANOVA) para mais de dois grupos.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui estão os resultados representativos para os protocolos de codificação fortes e fracos descritos usando hidroxilase de tyrosina masculina (Th)-Cre ratos transgênicos13 com a tensão Long-Evans cruzada quatro vezes para Lister Hooded e ratos de lister encapuzados do tipo selvagem. Ratos transgênicos th-Cre foram usados, pois esta linha de ratos será usada em estudos futuros envolvendo optogenética. Utilizando cada protocolo, a memória foi testada com atrasos de 1 e 24 h. Testes a 1h demonstram memória de curto prazo, enquanto testes de 24h demonstram memória de longo prazo. O valor de exclusão para preferência de codificação foi calculado conforme descrito no protocolo, utilizando os dados combinados de cinco testes (protocolos de codificação fortes e fracos) como [50,8% ± (2×10,8%)]. Os ratos que tinham preferência de codificação acima e abaixo desses valores foram excluídos das análises dos respectivos testes.

Para experimentos de codificação fortes, foram utilizados 16 ratos, e para experimentos fracos de codificação, 19 ratos foram usados. Durante os fortes ensaios de codificação (codificação de 3 × 5 min; Figura 4A), não houve preferência significativa por qualquer objeto (52,0 ± 1,9%, n = 16, t15 = 1,1, p = 0,29; t -testede uma amostra versus nível de chance). Este forte protocolo de codificação levou à preferência pelo objeto no local do novo, como mostrado em termos de exploração percentual médio, que foi significativamente maior do que o nível de chance (50%) em testes com atrasos de 1h e 24h (memória 1h, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t7 = 11,8, p < 0,001; memória 24-h, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t7 = 2,8, p = 0,025; t -testede uma amostra versus nível de chance). Não houve diferença significativa entre memória de 1 h e 24h (p = 0,056; teste tde Welch não remunerado).

Durante os testes fracos de codificação (codificação de 20 min; resultados agrupados a partir de quatro contextos; Figura 4B), não houve preferência significativa por qualquer objeto (51,1 ± 1,0%, n = 66, t65 = 1,2, p = 0,24; t -testede uma amostra versus nível de chance). Este fraco protocolo de codificação produziu um aumento significativo na preferência pelo objeto no local novo em comparação com o nível de chance em testes com um atraso de 1h, mas não atraso de 24h (dados combinados de todos os quatro contextos; memória 1 h, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t31 = 8,2, p < 0,001; memória 24h, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t33 = 0,16, p = 0,87; t -testede uma amostra versus nível de chance). Houve diferença significativa entre o desempenho nos testes com atrasos de 1h e 24 horas (memória 1-h: n = 32, memória 24-h: n = 34, t61,5 = 5,2, p < 0,001; não pago o t-testede Welch).

A memória no nível do grupo não foi observada no teste de atraso de 24 horas como indexada pelo desempenho de nível de acaso, mas apresentou variações individuais. Esta maior variação para condições fracas para não memória (por exemplo,teste de 24 h) foi comumente observada devido à exploração mais aleatória dos objetos. Por isso, é importante não interpretar o desempenho dos ratos individualmente. Em vez disso, a distribuição de pontos de dados individuais pode ser usada juntamente com a média do grupo como o resultado confiável do teste. Quanto mais forte a codificação, mais uniforme o comportamento dos ratos se torna, e menor o número de ratos necessários para atingir significância estatística, como pode ser observado na Figura 4A para o forte protocolo de codificação. Em contrapartida, grupos maiores são necessários para obter resultados confiáveis para condições fracas(Figura 4B).

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Figura 4: Desempenho da memória após codificação forte e fraca. (A) O forte teste de codificação (3 × codificação de 5 min) seguido de ensaios de teste de 1 h ou 24 h. Não houve preferência significativa por nenhum dos dois objetos durante os ensaios de codificação (n = 16). A forte codificação produziu significativamente maior preferência pelo objeto no local novo nos testes com atrasos de 1h e 24h em comparação com o nível de chance (memória 1-h e 24-h: n = 8 em cada grupo). Não houve diferença significativa entre os grupos. (B) O teste de codificação fraco (codificação de 20 min) seguido de ensaios de teste de 1 h ou 24h. Não houve preferência significativa por nenhum dos dois objetos como grupo durante os ensaios de codificação (n = 66). A codificação fraca produziu significativamente maior preferência pelo objeto no local novo no teste com um atraso de 1-h, mas não 24h, em comparação com o nível de chance (memória 1-h: n = 32; memória 24-h: n = 34). Houve diferença significativa entre o desempenho nos testes com atrasos de 1h e 24h. Os resultados foram agrupados a partir de quatro contextos. Os pontos de dados individuais são apresentados como pontos. Todas as barras mostram a porcentagem de exploração do objeto no local da novela como média ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001; t -testede uma amostra versus nível de chance (50%, linha tracejada). ###p < 0,001; ns, não significativo; não foi testado no teste doWelch. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma vantagem significativa deste protocolo estabelecido é que ele pode ser realizado quatro vezes usando quatro contextos distintos (Figura 1C) com a mesma coorte de ratos. Os resultados apresentados na Figura 5 demonstram uma maneira possível de usar o contrabalanceamento com dois grupos experimentais (grupos de memória 1-h e 24h). Os dois grupos foram contrabalançados em dois contextos (contextos 1 e 2), e isso se repetiu em dois contextos adicionais (contextos 3 e 4; Figura 5A). Os resultados dos quatro contextos são apresentados individualmente na Figura 5B,D, onde a memória de cada grupo experimental foi avaliada comparando-se a preferência ao nível de acaso em cada contexto (memória 1-h: Contexto 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t8 = 5,5, p < 0,001; Contexto 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t8 = 4,0, p = 0,004; Contexto 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t6 = 4,0, p = 0,007; Contexto 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t6 = 2,7, p = 0,035; Memória 24-h: Contexto 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t8 = 0,77, p = 0,46; Contexto 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t8 = 0,18, p = 0,86; Contexto 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t7 = 1,7, p = 0,12; Contexto 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t7 = 0,52, p = 0,62; t -testede uma amostra versus nível de chance).

Nos contextos 1, 2 e 4, a comparação entre os grupos revelou diferenças significativas entre a memória de 1 h e 24 h (memória 1-h versus memória 24-h: Contexto 1, t12,7 = 3,4, p = 0,005; Contexto 2, t15.2 = 2,6, p = 0,019; Contexto 3, t13.0 = 1,4, p = 0,17; Contexto 4, t12,2 = 2,4, p = 0,032; não foi testado o testede Welch). Para uma melhor representação e comparação interna dos dados, os resultados de dois contextos contrabalanceados foram combinados (Figura 5C,E). Os grupos experimentais combinados foram comparados ao nível de chance individualmente novamente (Contextos 1 e 2 combinados: memória 1 h, 67,8 ± 2,6%, n = 18, t17 = 6,7, p < 0,001; memória 24-h, 47,1 ± 3,9%, n = 18, t17 = 0,74, p = 0,47; Contextos 3 e 4 combinados: memória 1-h, 65,3 ± 3,3%, n = 14, t13 = 4,7, p < 0,001; Memória 24-h, 52,4 ± 3,2%, n = 16, t15 = 0,73, p = 0,48; t -testede uma amostra versus nível de chance). Então, os grupos experimentais foram comparados entre si.

Em ambos os pares de contexto, houve diferenças significativas entre os grupos revelados por comparações dentro do assunto (memória 1 h versus memória 24h: Contextos 1 e 2 combinados, t16 = 3,5, p = 0,003; Contextos 3 e 4 combinados, t13 = 2,4, p = 0,032; t-teste emparelhado). Resultados comparáveis foram obtidos com ratos de lister encapuzados do tipo selvagem, também, no protocolo de codificação fraco usando os contextos 1 e 4 para as duas sessões contrabalanceadas (dados não mostrados). A replicabilidade e confiabilidade dos resultados foram validadas comparando cada conjunto de dados usando a ANOVA unidirecional. Não foi detectada diferença significativa entre os quatro contextos (memória 1-h: F3,28 = 0,31, p = 0,81; memória 24-h: F3,30 = 0,99, p = 0,41). Portanto, o teste de localização do objeto pode ser repetido de forma confiável com influência mínima de repetições, dado que as instruções neste protocolo são seguidas.

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Figura 5: Diferentes formas de apresentar e analisar os resultados do fraco protocolo de codificação com dois grupos experimentais contrabalançados ao longo de duas sessões. (A) O desenho experimental para contrabalanceamento com dois grupos experimentais (grupos de memória 1-h e 24 h) ao longo de duas sessões (contextos 1 e 2). O contrabalançar foi repetido em duas sessões adicionais (contextos 3 e 4). (B e D) Os resultados de cada contexto e dos grupos experimentais foram individualmente comparados ao nível de chance e uns aos outros. Em todos os quatro contextos, a preferência pelo objeto no local novo em testes com atraso de 1h foi significativamente aumentada em comparação com o nível de chance [Contexto 1 e 2: n = 9 por grupo (B); Contexto 3 e 4: n = 7 por grupo (D)]. Nos testes de atraso de 24h, a preferência pelo objeto no local da novela não difere do acaso (Contexto 1 e 2: n = 9 por grupo; Contexto 3 e 4: n = 8 por grupo). Houve diferença significativa entre as preferências dos grupos experimentais nos contextos 1, 2 e 4, mas não no contexto 3, conforme revelado pela comparação entre os sujeitos. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; t -testede uma amostra versus nível de chance (50%, linha tracejada). #p < 0,05; ##p < 0,01; ns, não significativo; não foi testado no teste doWelch. (C e E) Os resultados são apresentados após a combinação dos grupos experimentais dos dois contextos contrabalanceados [Contextos 1 e 2 combinados, n = 17 por grupo (C); Contextos 3 e 4 combinados, n = 14 por grupo (E)]. A preferência pelo objeto no local novo aumentou significativamente em comparação com o nível de chance em testes com um atraso de 1h, mas não 24h, em ambos os pares de contexto. A comparação interna dos grupos experimentais revelou diferenças significativas entre as preferências do objeto no local da novela em testes com atrasos de 1h e 24h em ambos os pares de contexto. p < 0,001; t -testede uma amostra versus nível de chance (50%, linha tracejada). #p < 0,05, ##p < 0,01; t-testeemparelhado. Os pontos de dados individuais são apresentados como pontos. Todos os bares mostram a porcentagem de exploração do objeto no local da novela como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A tarefa de localização do objeto pode ser usada em uma variedade de estudos para investigar a memória espacial, como descrito anteriormente. A flexibilidade da configuração permite a modelagem da memória de curto e longo prazo de diferentes pontos fortes, e pode ser facilmente implementada a um baixo custo. No entanto, como há muitos parâmetros no protocolo que podem influenciar os resultados, e diferentes estudos variam ligeiramente nesses parâmetros6,pode-se enfrentar dificuldades para implementar a tarefa com sucesso pela primeira vez. O protocolo acima destina-se a orientar os leitores através deste processo sem problemas. Outras etapas cruciais que podem ser significativas na implementação bem sucedida da tarefa com alta replicabilidade serão discutidas abaixo.

Embora a sessão de codificação/teste muitas vezes seja o foco ao executar experimentos de localização de objetos, os protocolos de manuseio e habitação têm um efeito profundo no resultado deste tipo de testes comportamentais onde o resultado depende do comportamento natural de ratosnão perturbados 14,15. Como tal, as etapas anteriores à sessão de codificação/teste devem ser projetadas com cautela, pois podem influenciar o comportamento e a memória dos ratos e, consequentemente, influenciar os resultados finais. Um bom nível de manuseio e habitação de tal forma que os ratos se familiarizem com o experimentador e a tarefa minimizará o efeito dos fatores de estresse, aumentando a probabilidade de exibir comportamento natural8. Como mencionado no protocolo, o manuseio pode começar tão cedo quanto o desmasar de filhotes se a cepa de rato for mantida na instalação doméstica. Com base na experiência prévia (dados não apresentados) e a partir de vários estudos anteriores16,17, esse manejo precoce resulta em baixa ansiedade e maior curiosidade nos meses seguintes.

Como a tarefa de localização do objeto depende apenas do impulso exploratório intrínseco dos ratos, o comportamento esperado pode ser facilmente dificultado se os ratos não estiverem ansiosos para explorar ou relutantes em abordar a novidade, que é chamada de "comportamento neofóbico"1. Como tal, é altamente recomendável incluir um protocolo de manuseio e habitação completo de acordo com as necessidades específicas do estudo. Este protocolo pode ser usado como um guia de exigência mínima, e outras etapas podem ser implementadas (por exemplo,se o estudo for incluir injeções em um estágio posterior, é necessária a habituação a procedimentos de injeção e posição de retenção específica. A tensão e a idade dos ratos experimentais são dois outros fatores influentes e devem ser considerados antes de planejar um experimento para evitar resultados subótimos. Diferentes cepas de ratos podem ter diferentes comportamentos e níveis de ansiedade de linha de base18,19,20 e, portanto, ajustes específicos ao protocolo podem ser necessários dependendo da tensão utilizada.

Este protocolo é confirmado para funcionar bem com ratos transgênicos Th-Cre com a tensão Long-Evans cruzada quatro vezes para Lister Hooded tensão e ratos de lister encapuzados. Uma idade inicial logicamente ideal para ratos em experimentos comportamentais é de cerca de 12 semanas20,mas a variabilidade entre tensões e os requisitos específicos da tarefa devem ser contabilizados. Também pode ser possível usar ratos em desenvolvimento se for de interesse para o estudo, embora ajustes no protocolo possam ser necessários e não estejam cobertos aqui. No entanto, é importante considerar se o rato em uma determinada idade desenvolveu as funções cognitivas necessárias para executar essa tarefa com sucesso. Um estudo21 que investiga isso relatou que apenas os ratos adolescentes no pós-natal 38 e não antes, mostraram memória espacial aocêntrica refletida na preferência pelo objeto no local do romance, como observado em ratos adultos. O protocolo aqui apresentado foi bem sucedido usando ratos que tinham de 15 a 16 semanas no início da primeira sessão de codificação/teste. Anteriormente, o mesmo protocolo de codificação forte produzia resultados subótimos para negativos ao usar ratos de 23 semanas de idade que não tinham atingido o nível ideal de habituação devido à falta de manuseio e habituação em uma idade jovem o suficiente. Esses ratos não conseguiram ter um desempenho diferente do nível do acaso ou, de fato, exibiram aversão à novidade como observado em termos de preferência pelos objetos estáveis em vez dos objetos deslocados (dados não mostrados). Esses resultados evidenciam que a idade e o tempo de utilização do manuseio podem ter impacto na eficácia da habituação e, consequentemente, contribuir para a observação do comportamento ansioso e neofóbico nos testes.

Aqui, dois protocolos diferentes são delineados, garantindo codificação forte ou fraca na tarefa de localização do objeto. Durante o estabelecimento desses protocolos, observou-se que o interesse pelos objetos diminuiu após 5-10 minutos de exploração durante ensaios longos únicos(por exemplo, codificação de 20 min), e os ratos eventualmente pararam de explorar. Isso resulta em memória mais fraca dos locais do objeto. Um protocolo de codificação que intercala ensaios de codificação com curtos períodos de descanso (por exemplo, codificação de 3 x 5 minutos) supera isso e leva a uma alta exploração ao longo dos ensaios. Assim, o tempo de exploração ativo e o layout diferente desses dois protocolos de codificação influenciam a força da memória, que é mais forte após codificação de 3 x 5 min do que após protocolos de codificação de 20 min. Resultados semelhantes também podem ser alcançados usando durações ligeiramente diferentes com protocolos de ensaio único versus intercalados, e ajustes podem ser feitos para atender às necessidades do estudo e da cepa de ratos.

Ao contrário dos protocolos usando um campo aberto branco simples com apenas pistas externas na sala, o protocolo aqui apresentado usa uma arena com contextos distintos e pistas intra-maze que provavelmente requer mais tempo para aprender. Assim, recomenda-se a adição de uma etapa de habitação de contexto no protocolo anterior ao teste de codificação. Isso permitirá que os ratos formem um mapa espacial de cada contexto durante a habituação e diminuam a duração do seguinte ensaio de codificação, pois os ratos só precisarão codificar os locais dos objetos em relação a este mapa. Além disso, a habituação de contexto permitirá que os ratos se habituam a qualquer possível distrator dentro de cada contexto, como as pistas espaciais 3D, minimizando comportamentos que não sejam a exploração de objetos na sessão de codificação/teste a seguir. Com a implementação de um método de contrabalanceamento completo que consiste em vários níveis (ou seja, uma ampla gama de combinações de localização de objeto (contadores) e direção do deslocamento do objeto), preferências indesejadas que podem aumentar devido a variações na intensidade da luz e cores/padrões de parede nos cantos da arena são minimizadas.

Vários fatores devem ser considerados ao repetir a tarefa de aumentar a replicabilidade entre sessões de codificação/teste e minimizar a influência da repetição. Em primeiro lugar, contextos distintos (tanto quanto o número de repetições de sessões de codificação/teste) precisam ser projetados para evitar o acúmulo de memória espacial que pode ser causado pela realização das sessões repetidas usando o mesmo contexto. Para isso, utilizou-se um aparelho com paredes substituíveis de diferentes cores e padrões(Figura 1B,C). As paredes distintas e objetos 3D (como brinquedos ou pequenos itens cotidianos de cores e formas distintas, ver protocolo e Figura 1C) pendurados nas paredes são os sinais espaciais e pontos turísticos que os ratos potencialmente usam para aprender locais de objetos em relação aos seus contextos. No caso de um teste não produzir preferência pelo objeto movido, pode-se considerar a alteração desses parâmetros do contexto (design de parede e pistas espaciais). Alternativamente, uma arena retangular ou em forma circular pode ser usada para tarefas de localização de objetos em vez de uma arena quadrada como neste protocolo. Arenas circulares são relatadas para eliminar preferências de canto22 que é frequentemente observada em arenas com cantos e, portanto, pode ser benéfico ao lidar com uma tensão particularmente alta de ratos ou ratos. Enquanto os requisitos de criação de quatro contextos distintos neste protocolo funcionam de forma ideal com uma forma quadrangular, uma arena circular também pode ser funcional após alguns ajustes.

Em segundo lugar, os intervalos entre cada sessão de codificação/teste devem ser determinados de modo que os ratos mantenham o mesmo nível de interesse cada vez, evitando o risco de aprendizado cumulativo resultante de um cronograma denso de repetições. Normalmente, um intervalo de pelo menos o dobro do tempo de atraso entre os ensaios de codificação e teste é suficiente, com intervalos mais longos sendo mais favoráveis para mais de duas repetições. Isso significa que, enquanto um intervalo mínimo de 48h após um teste de 24 horas é suficiente para uma ou duas repetições, o uso de um intervalo de 1 semana é recomendado para quatro repetições. Como os resultados na Figura 5 e a comparação usando a ANOVA mostram, a tarefa pode ser repetida com sucesso quatro vezes. Com base nisso, o protocolo estabelecido pode ser usado para contrabalançar até quatro condições experimentais. O número de grupos experimentais determina o número de repetições de sessões de codificação/ensaio em contextos distintos. Os resultados na Figura 5 representam uma forma possível de utilizar o protocolo com dois grupos experimentais. Os grupos foram contrabalançados em duas sessões, e as mesmas condições foram repetidas em duas sessões adicionais (para fins de validação). O segundo conjunto de sessões contrabalanceada também poderia ser usado para contrabalançar novas condições. Da mesma forma, três ou quatro condições experimentais podem ser comparadas usando três ou quatro sessões contrabalanceadas, respectivamente.

Nesses casos, os contextos devem ser projetados para acomodar características contrastantes descritas no protocolo. Vale ressaltar que o design contrabalanceado pode não ser adequado para experimentos nos quais manipulações adicionais, como uma intervenção farmacológica que possa deixar um efeito ou dano duradouro, devem ser usadas. Para manter a eficácia e a replicabilidade dos testes, o experimento deve ser projetado em conformidade. Os dados dos ensaios repetidos podem ser apresentados e analisados de várias formas, conforme demonstrado na Figura 5. Para uma análise inicial, os grupos experimentais em cada contexto podem ser individualmente comparados ao nível de acaso usando um teste tde uma amostra para determinar qualquer preferência significativa(Figura 5B,D). Isso pode ser útil para obter uma rápida compreensão dos dados, mas garante apenas uma comparação indireta dos grupos. Assim, para comparar dois ou mais grupos, os dados devem ser analisados usando testes tde duas amostras (emparelhados ou não) ou ANOVA, respectivamente. Isso pode ser na forma de comparação entre os sujeitos dos grupos dentro de uma única sessão de codificação/teste (Figura 4A e Figura 5B,D) ou comparação dentro do assunto dos grupos de dois (ou mais) contextos contrabalanceados(Figura 5C,E). Este último método é fortemente recomendado, especialmente quando se trata de condições de memória fracas, o que, como explicado anteriormente, resulta em alta variância devido à aleatoriedade no comportamento.

A combinação dos contextos contrabalanceados leva a grupos maiores que são necessários para visualizar de forma confiável o comportamento do grupo com variação mínima. Usando um protocolo com repetições em sessões contrabalanceadas, pode-se esperar uma diminuição no número de ratos para cerca de um terço do número que seria necessário usando um único teste com o mesmo poder estatístico. Normalmente, tamanhos amostrais em uma faixa de 7 a 15 ratos (total) para sessões contrabalanceada e em uma faixa de 20 a 50 ratos (10 a 25 por grupo) para uma única sessão com tamanho de efeito e potência ambos maiores que 0,8 são suficientes. A diminuição do número de animais necessários e o aumento das informações obtidas de cada animal utilizando esse protocolo refinam o estudo e servem aos princípios 3R dos usos éticos dos animais em pesquisa. É importante nesta etapa ter em mente que o comportamento aleatório do rato, que não é acompanhado com uma memória forte, pode resultar em preferências individuais fortes tanto abaixo quanto acima do acaso, mas a média do grupo deve render uma preferência não significativamente diferente do acaso. Os dados individuais devem ser interpretados cuidadosamente. A distribuição de pontos de dados individuais dentro de um grupo também pode ser informativa para a interpretação dos resultados. Como visto na Figura 4 e Figura 5,a distribuição muda dependendo da força da memória. No geral, o protocolo aqui apresentado pode ser seguido facilmente para implementar a tarefa de localização do objeto com repetições para modelar memória espacial de curto e/ou longo prazo. O protocolo de treinamento simples e flexível e a possibilidade de implementar novas manipulações tornam essa tarefa uma escolha popular. Essas modificações no protocolo permitem a investigação de etapas específicas, como aquisição de memória, consolidação e recall.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer a Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O'Hara e David Bett por comentários e sugestões perspicazes. Este estudo foi apoiado por Erasmus+ (para G.B. e L.N.); a Escola de Pós-Graduação em Saúde da Universidade de Aarhus (para K.H.); Novo Nordisk Foundation Young Investigator Award 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) e PROMEMO - Center for Proteins in Memory, um Centro de Excelência financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa Dinamarquesa (DNRF133) (para T.T.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Caixa de campo aberto/experimentalO'Hara & amp Co (Japão)OF-3001Caixa de campo aberto para a tarefa de localização de objetos
Objeto 1: conesO'Hara & Co (Japão)ORO-RR
Objeto 2: bolas de futebolO'Hara & Co (Japão)ORO-RB
Objeto 3: blocos retangularesO'Hara & Co (Japão)ORO-RCBlocos retangulares foram modificados após a compra
Aparelho de tarefa de localização de objetosO'Hara & Co (Japão)SPP-4501Caixa de atenuação de som que contém a caixa de campo aberto para a tarefa de localização de objetos
Software de rastreamentoO'Hara & Co (Japão)TimeSSIPara rastreamento de movimento e funções de câmera
automatizadas Lister do tipo selvagem Ratos encapuzadosCharles River603

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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