É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Ensaios de migração celular e adesão celular para investigar a interação Leishmania-célula hospedeira

1.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/62461

⸱

4 de agosto de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host - Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, estudamos as implicações da interação Leishmania-hospedeiro, explorando a migração de células dendríticas infectadas por Leishmania. A diferenciação e infecção de células dendríticas, a análise de migração e a avaliação de complexos de adesão e dinâmica de actina são descritas. Este método pode ser aplicado a outros estudos de migração de células hospedeiras quando infectadas com Leishmania ou outras espécies de parasitas intracelulares.

Resumo

Leishmania é um protozoário parasita intracelular que causa um amplo espectro de manifestações clínicas, que vão desde lesões cutâneas localizadas auto-resolvidas até uma forma visceral altamente fatal da doença. Estima-se que 12 milhões de pessoas em todo o mundo estejam infectadas atualmente e outras 350 milhões enfrentam risco de infecção. Sabe-se que as células hospedeiras infectadas por parasitas Leishmania , como macrófagos ou células dendríticas, podem migrar para diferentes tecidos do hospedeiro, mas como a migração contribui para a disseminação e homing do parasita permanece pouco compreendida. Portanto, avaliar a capacidade desses parasitas de modular a resposta, adesão e migração da célula hospedeira lançará luz sobre os mecanismos envolvidos na disseminação e visceralização da doença. A migração celular é um processo complexo no qual as células sofrem polarização e protrusão, permitindo que migrem. Esse processo, regulado pela dinâmica dos microtúbulos à base de actina e tubulina, envolve diferentes fatores, incluindo a modulação da adesão celular ao substrato. Os processos de adesão e migração celular têm sido investigados usando vários modelos. Aqui, descrevemos um método para caracterizar os aspectos migratórios das células hospedeiras durante a infecção por Leishmania . Este protocolo detalhado apresenta a diferenciação e infecção de células dendríticas, a análise da motilidade e migração da célula hospedeira e a formação de complexos de adesão e dinâmica de actina. Este protocolo in vitro visa elucidar ainda mais os mecanismos envolvidos na disseminação de Leishmania dentro dos tecidos do hospedeiro vertebrado e também pode ser modificado e aplicado a outros estudos de migração celular.

Introdução

A leishmaniose, uma doença tropical negligenciada causada por protozoários parasitas pertencentes ao gênero Leishmania, resulta em um amplo espectro de manifestações clínicas, desde lesões cutâneas localizadas autocurativas até formas viscerais fatais da doença. Estima-se que até um milhão de novos casos de leishmaniose surjam anualmente, com 12 milhões de pessoas infectadas atualmente em todo o mundo1. A leishmaniose visceral (LV), que pode ser fatal em mais de 95% dos casos quando não tratada, causa mais de 50.000 mortes anualmente, afetando milhões na América do Sul, África Oriental, Sul da Ásia e região do Mediterrâneo2. O principal agente etiológico da LV no novo mundo, Leishmania infantum, é transmitido ao homem por flebotomíneos fêmeas infectadas durante a alimentação sanguínea3. Esses parasitas são reconhecidos e internalizados por fagócitos, por exemplo, macrófagos e células dendríticas 3,4,5. Dentro dessas células, os parasitas se diferenciam em suas formas intracelulares, conhecidas como amastigotas, que se multiplicam e são transportadas pelo sistema linfático e pela corrente sanguínea para diferentes tecidos do hospedeiro 6,7. No entanto, os mecanismos pelos quais os parasitas de Leishmania são disseminados no hospedeiro vertebrado, bem como o papel desempenhado pela migração da célula hospedeira nesse processo, permanecem obscuros.

A migração celular é um processo complexo executado por todas as células nucleadas, incluindo os leucócitos8. De acordo com o modelo clássico de ciclagem de migração celular, esse processo envolve vários eventos moleculares integrados que podem ser divididos em cinco etapas: protrusão de ponta; adesão da borda de ataque aos contatos da matriz; contração do citoplasma celular; liberação da borda traseira da célula dos locais de contato; e a reciclagem de receptores de membrana da parte traseira para a frente da célula9.

Para que ocorra a migração celular, as saliências devem ser formadas e estabilizadas por meio da ligação à matriz extracelular. Dentre os diferentes tipos de receptores envolvidos na promoção da migração celular, destacam-se as integrinas. A ativação da integrina resulta em sinalização relacionada à migração; a sinalização intracelular ocorre então via quinase de adesão focal (FAK) e quinases da família Src, além de molecus de talina, vinculina e paxilina 10,11,12. A fosforilação da paxilina por quinases ativadas, incluindo FAK, leva ao recrutamento de moléculas efetoras, que transduzem sinais externos que estimulam a migração celular. Foi demonstrado que a paxilina é uma molécula intracelular crucial para os processos de adesão celular, polimerização de actina e migração celular 13,14,15.

O citoesqueleto de actina desempenha um papel central na polarização e migração de fagócitos16. Durante o processo de migração celular, as saliências formadas devido à polimerização da actina tornam-se estabilizadas através da adesão celular à matriz extracelular. Esse processo pode ser modulado por receptores de integrina associados ao citoesqueleto de actina 17,18,19. Várias proteínas de ligação à actina regulam a taxa e a organização da polimerização da actina nas protrusões celulares20. Estudos têm demonstrado que RhoA, Rac e Cdc42 regulam a reorganização da actina após a estimulação de células aderentes por fatores extracelulares21,22. Durante a migração, Rac1 e Cdc42 estão localizados na borda de ataque da célula, controlando a extensão dos lamelipódios e filopódios, respectivamente, enquanto RhoA, localizado na parte posterior da célula, regula a contração do citoesqueleto de actomiosina 15,23,24,25.

Estudos têm demonstrado que a infecção por Leishmania modula as funções da célula hospedeira, como adesão ao substrato celular e migração 26,27,28,29,30,31. DCs imaturas residem em tecidos periféricos; após a interação com PAMPS, essas células são ativadas e migram para os linfonodos de drenagem, levando à apresentação do antígeno às células T. Um estudo anterior usando um modelo de camundongo mostrou que a infecção por L. amazonensis provoca uma redução na migração de DCs para linfonodos de drenagem29. Também foi demonstrado que a inibição do processo de adesão reduziu a migração de DC após a infecção por L. major30. No entanto, o impacto da migração DC na disseminação do parasita no hospedeiro, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo, permanecem pouco compreendidos.

Aqui apresentamos um protocolo passo a passo compilado para realizar um ensaio de adesão e migração in vitro envolvendo DCs humanas infectadas por Leishmania. Este método compreende não apenas a diferenciação e infecção de DCs, mas também permite a análise da motilidade e migração da célula hospedeira, a formação de complexos de adesão, bem como a dinâmica da actina. O protocolo in vitro atualmente descrito permite que os pesquisadores investiguem mais a fundo os mecanismos envolvidos na disseminação de Leishmania dentro dos tecidos do hospedeiro vertebrado e também pode ser manipulado e aplicado a outros estudos de migração celular.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, protocolo nº 2.751.345). Amostras de sangue foram obtidas de doadores voluntários saudáveis. Os procedimentos experimentais em animais foram conduzidos de acordo com os Princípios Éticos em Pesquisa Animal adotados pela lei brasileira 11.784/2008 e foram aprovados e licenciados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, protocolo nº 014/2019).

1. Isolamento e diferenciação de células dendríticas humanas

  1. Pipetar 10 mL do meio gradiente de densidade em tubos de centrifugação de 50 mL.
  2. Rotule os tubos de 50 mL de acordo com a amostra de cada doador.
  3. Colete ~ 50 mL de sangue venoso de doadores saudáveis e, após a coleta, siga os procedimentos descritos abaixo no gabinete de fluxo.
  4. Transfira cuidadosamente o sangue coletado para tubos de centrífuga e dilua em solução salina (cloreto de sódio a 0,9%) na proporção de 1:1 à temperatura ambiente.
  5. Cubra lentamente o sangue diluído no topo do meio de gradiente de densidade.
  6. Tubos de centrífuga contendo o meio de gradiente de sangue e densidade a 400 x g por 30 min à temperatura ambiente.
    NOTA: Desligue o freio antes de centrifugar para evitar a mistura de camadas de gradiente. Após a 1ª centrifugação, abaixe a temperatura da centrífuga para 4 °C.
  7. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga.
  8. Identificar o anel de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) na amostra (buffy coat); Remova suavemente o plasma residual com uma pipeta.
    NOTA: Após a centrifugação, as seguintes camadas de gradiente terão se formado: eritrócitos, meio de gradiente de densidade, anel PBMC e plasma. O anel PBMC está localizado entre o meio gradiente de densidade e as camadas de plasma.
  9. Transfira a camada de PBMC em forma de nuvem para um novo tubo e aumente o volume para 30 mL com solução salina.
  10. Centrifugar os tubos contendo a suspensão celular a 250 x g durante 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de solução salina.
  11. Colete uma alíquota para contagem de células com o método de exclusão de azul de tripano. Primeiro, dilua na proporção de 1:1.000. Em seguida, use 10 μL das células diluídas para coloração com azul de tripano e conte as células usando uma câmara de Neubauer para determinar a viabilidade celular.
  12. Centrifugue novamente a 200 x g por 10 min a 4 °C.
  13. Ressuspenda o pellet no buffer MACS. Use 80 μL do tampão para cada 1 x 107 células.
    NOTA: Composição do tampão MACS: Prepare uma solução contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e EDTA 2 mM. Diluir a solução tampão na proporção de 1:20 com a solução de enxaguamento. Mantenha o tampão frio e armazene a 2-8 °C.
  14. Adicionar microesferas de CD14 à suspensão celular preparada no passo 1.13. Use 20 μL de microesferas CD14 para cada 1 x 107 células.
    NOTA: As microesferas de CD14 são usadas para a seleção positiva de monócitos humanos de PBMCs, pois as esferas se ligam a células CD14-positivas expressas na maioria dos monócitos.
  15. Homogeneizar a solução que contém o pellet e as microesferas com uma pipeta. Mantenha no gelo por 15 min.
  16. Centrifugar a suspensão a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
  17. Ressuspenda as células no buffer MACS. Use 1-2 mL para 1 x 107 células na mistura de microesferas celulares.
  18. Centrifugar a suspensão a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
  19. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 μL de tampão MACS.
    NOTA: Este é o volume máximo da suspensão de célula que pode ser processado por meio de uma coluna.
  20. Monte a coluna magnética.
  21. Lave a coluna uma vez adicionando 500 μL de tampão MACS. Permita que o amortecedor flua sob gravidade através da coluna.
    NOTA: Não deixe a coluna secar, pois qualquer ar que entrar pode obstruir a coluna.
  22. Adicionar 500 μL da solução da amostra de células do passo 1.19 por coluna. Permitir que a solução da amostra de células flua por gravidade através da coluna.
  23. Lave a coluna adicionando 500 μL de tampão MACS (2x). Adicione o novo buffer apenas quando o reservatório da coluna estiver vazio. Evite secar.
  24. Pipetar 1 ml do tampão MACS na coluna e colocá-lo num novo tubo por baixo. Lave imediatamente as células marcadas magneticamente empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna.
  25. Centrifugar as células enriquecidas com CD14 a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
  26. Conte as células usando uma câmara de Neubauer.
  27. Ressuspenda as células em 1 mL de RPMI completo com interleucina-4 (IL-4) (100 μL / mL) + fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) (50 ng / mL).
    NOTA: GM-CSF é uma citocina secretada por macrófagos, células T, mastócitos, células natural killer, células endoteliais e fibroblastos que induz a diferenciação e proliferação de progenitores mieloides na medula óssea. GM-CSF e IL-4 são usados para induzir a diferenciação de células dendríticas32.
  28. Células-semente em uma placa de 24 poços a uma concentração de 2 × 105 células por poço em 500 μL de meio RPMI completo contendo e incubar as células por 7 dias na incubadora de cultura de células a 37 ° C.

2. Cultivo de Leishmania infantum

NOTA: Os parasitas Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262) são utilizados neste ensaio. Os hamsters foram infectados por via intravenosa com 20 μL da solução contendo 1 x 106 promastigotas de L. infantum em solução salina estéril. Após 1 a 2 meses, os animais foram eutanasiados e as formas amastigotas de Leishmania foram recuperadas de seus baços e diferenciadas em promastigotas33.

  1. Cultive promastigotas de L. infantum isolados de baços de hamster previamente infectados em um frasco inclinado de25 cm de cultura de células contendo 3 mL de meio Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) e 5 mL de meio essencial mínimo suplementado (MEM).
    NOTA: Neste ensaio, o meio MEM foi suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 24,5 nM de hemina bovina.
  2. Incubar a 24 °C durante 7 dias em incubadora de DBO (Bio-Oxygen Demand).
  3. Pipetar 100 μL de cultura promastigota para um novo balão de2 culturas de células de 25 cm contendo 5 ml de meio MEM suplementado.
  4. Incubar a cultura promastigota a 24 °C em estufa BOD até que as promastigotas atinjam a fase estacionária. Conte periodicamente os promastigotas cultivados transferindo uma alíquota da suspensão do parasita diluída em solução salina para uma câmara de Neubauer (ou seja, hemocitômetro) para determinar a fase estacionária de crescimento.
    NOTA: Não é recomendado o uso de parasitas de primeira passagem após o cultivo em meio NNN para evitar vestígios residuais de sangue de coelho.
  5. Transferir 1 x 105 da cultura estacionária da fase de crescimento de promastigotas de L. infantum para um novo balão de cultura de2 células de 25 cm e adicionar 5 ml de meio suplementado com MEM.
  6. Monitore o crescimento da cultura periodicamente por aproximadamente 7 dias usando uma câmara de Neubauer até que a fase estacionária seja alcançada. Os parasitas agora estão prontos para uso em procedimentos experimentais de infecção.
    NOTA: As culturas promastigotas são consideradas viáveis para infecção por até 7 passagens in vitro; passagens adicionais podem induzir perda de virulência.

3. Infecção de células dendríticas humanas

  1. Dentro de um gabinete de fluxo laminar biológico, transferir todo o conteúdo do frasco de cultura de parasitas para tubos de centrífuga de 50 mL.
  2. Adicione solução salina fria a um volume final de 40 mL.
  3. Centrifugue a 1.600 xg por 10 min a 4 °C.
  4. Descarte o sobrenadante após a centrifugação e ressuspenda o pellet em 1 mL de solução salina fria (repita as etapas 3.3-3.4 três vezes).
  5. Depois de lavar as células para remover quaisquer parasitas inviáveis, ressuspenda o pellet em 1 mL de solução salina fria.
  6. Passe o conteúdo lentamente por uma seringa de 1 mL com uma agulha de 16 G 5 vezes para separar os aglomerados de parasitas.
  7. Remover uma alíquota para determinar a concentração do parasita num hemocitómetro (calcular o número médio de parasitas em 4 quadrantes x factor de diluição x 104).
  8. Lave as células dendríticas adicionando 1 mL de solução salina e centrifugando as células a 300 x g por 10 min em temperatura ambiente (3 vezes).
  9. Calcular a quantidade de L. infantum necessária para a infecção experimental; Relação: 20 parasitas por célula.
  10. Colocar o volume necessário de L. infantum em cada alvéolo de placas de cultura celular.
  11. Incubar células dendríticas com parasitas durante 4 h numa incubadora a 37 °C a 5% de CO2.
  12. Após a etapa 3.11, centrifugue as placas a 300 x g por 10 min a 4 °C.

4. Ensaio de migração usando insertos de cultura de células

  1. Após a infecção, lave as células dendríticas (infectadas ou não) 3 vezes com 1 mL de solução salina em temperatura ambiente para remover parasitas não internalizados. Após cada lavagem, centrifugue as placas a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
  2. Uma vez removidos os parasitas não internalizados, desprenda as células adicionando 200 μL do reagente de dissociação celular em cada poço e incube por 15 min. Manter as células numa incubadora a 37 °C a 5% de CO2.
  3. Homogeneizar as células usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL para permitir que as células se soltem.
  4. Transfira as células dissociadas para um tubo de centrífuga de 50 mL.
  5. Centrifugue a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
  6. Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio RPMI suplementado com 10% de FBS.
  7. Passe o conteúdo de cada tubo lentamente através de uma seringa de 1 ml com uma agulha de 25 G 5 vezes para separar as células.
  8. Remover uma alíquota e diluir com azul de tripano para determinar a concentração celular com um hemocitómetro (média das células viáveis em 4 quadrantes × factor de diluição × 104).
  9. Preparação de insertos de microplacas de cultura celular:
    NOTA: Inserções de cultura de células (membrana de policarbonato de poros de 5,0 μM) são recomendadas para ensaios de migração usando células dendríticas, macrófagos e monócitos, pois essas inserções permitem que os fagócitos passem pelas membranas.
    1. Remova as inserções com uma pinça estéril e coloque em poços vazios.
    2. Adicione 600 μL de meio RPMI suplementado com 10% de FBS a cada poço; adicione quimiocina quimioatraente (motivo CC) ligante 3 (CCL3) (1 μL para cada 1 mL de meio).
      NOTA: CCL3 é uma quimiocina que regula a migração DC34.
    3. Usando uma pinça estéril, coloque as inserções nos poços que contêm o meio.
  10. Adicione 2 x 105 células dendríticas (infectadas ou não) em 100 μL de meio a cada inserção.
  11. Incube por 4 h para permitir que as células migrem.
  12. Após 4 h, retire a placa e aspire o meio. Adicione 100 μL de paraformaldeído a 4% e incube por 15 min.
  13. Remova o paraformaldeído e adicione 100 μL de solução salina.
    NOTA: As placas podem ser mantidas a 4 °C para montagem posterior.
  14. Colete o sobrenadante de inserções ou de poços para contar as células não migratórias ou aquelas que atravessaram a membrana, respectivamente. Incubar com paraformaldeído 4% por 15 min.
  15. Concentre as células usando uma técnica de citocentrifugação35.
  16. Adicione 10 μL do meio de montagem com DAPI às membranas e coloque lamínulas sobre os poços.
  17. Montagem da membrana de inserção.
    NOTA: Esta etapa pode ser realizada fora dos gabinetes de biossegurança.
    1. Remova as membranas de inserção dos poços.
    2. Raspe a superfície da inserção com um cotonete para remover todas as células que não migraram.
    3. Usando um bisturi, remova a membrana da inserção.
    4. Coloque a membrana em uma lâmina, com as células voltadas para cima.
    5. Adicione 10 μL de meio de montagem com DAPI a cada membrana e, em seguida, coloque lamínulas sobrepostas.
    6. Placas de cobertura com folha de alumínio.
    7. Incubar as placas à temperatura ambiente durante 30 min e conservar a -20 °C
  18. Para analisar a migração celular, conte o número de células por campo (não inferior a 10 campos) usando um microscópio de fluorescência em um comprimento de onda de excitação a laser de 405 nm.

5. Ensaio de adesão e avaliação da polimerização da actina por imunofluorescência

NOTA: Para este ensaio, use placas de 24 poços com lamínulas.

  1. Depois de infectar as células por 4 h, lave cada poço 3 vezes com solução salina estéril em temperatura ambiente para remover quaisquer parasitas não internalizados.
  2. Centrifugue a placa a 300 x g por 10 min a 4°C. Adicione 500 μL de paraformaldeído a 4% em cada poço por 15 min.
  3. Remova o paraformaldeído e adicione 1 mL de solução salina.
  4. Prepare as soluções conforme descrito na Tabela 1.
Soluções primáriasComposto químicoDiluente
Solução de cloreto de amônio0,134 g de NH4Cl50 ml de PBS 1X
Saponina 15%150 mg de saponina1 mL de PBS 1X
Albumina de soro bovino (ABS) 10%1 g de ABS10 mL de PBS 1X
Soluções secundáriasComponente 1Componente 2Componente 3
Saponina 0,15%1mL de saponina 15%100 mL de PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3% / Saponina 0,15%13,8 mL de PBS 1X6 mL de ABS 10%200 μL de saponina 15%
PBS1X / ABS 0,3% / Saponina 0,15%:19,2 mL de PBS 1X0,6 mL de ABS 10%200 μL de saponina 15%
PBS 1X / ABS 1% / Saponina 0,15%17,8 mL de PBS 1X2 mL de ABS 10%200 μL de saponina 15%

Tabela 1: Receitas de buffer.

  1. Imunocoloração
    NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas sob agitação.
    1. Lave as lamínulas 3 vezes com 1x PBS por 5 min.
    2. Adicione 500 μL de solução de cloreto de amônio por poço por 10 min.
    3. Lave as lamínulas 3 vezes com 1x PBS por 5 min.
    4. Permeabilize a membrana com saponina 0,15% por 15 min.
    5. Incubar as células com a solução de bloqueio (PBS 1x / ABS 3% / Saponina 0,15%) por 1 h.
    6. Lave as lamínulas 3 vezes com PBS 1x / Saponina 0,15% por 5 min.
    7. Dilua os anticorpos primários em PBS 1x / ABS 1% / Saponina 0,15% como: Coelho anti-FAK (pTyr397): diluição 1:500, coelho anti-paxilina (pTyr118): diluição 1:100. Camundongo Anti-Rac1: diluição 1:100. Rabbit Anti-CDC42: diluição 1:200. Coelho Anti-RhoA: diluição 1:200.
    8. Incubar células com anticorpo primário diluído em PBS 1x/ABS 1%/Saponina 0,15% por 1 h.
      NOTA: FAK e Paxilina são moléculas-chave envolvidas na formação de complexos de adesão 13,14,15. A família Rho GTPase é responsável pela organização do citoesqueleto de actina. RAC1 e Cdc42, localizados na borda frontal da célula, controlam a formação de lamelipódios e filopódios, respectivamente; RhoA está localizado na parte traseira da célula e está envolvido na contração do citoesqueleto15, 23,24,25.
    9. Lave as lamínulas 3 vezes com 1x PBS/Saponina 0,15% por 5 min.
    10. Diluir o anticorpo secundário ou a faloidina da seguinte forma: IgG anti-coelho, Alexa Fluor 568: diluição 1:500; IgG anti-rato, Alexa Fluor 488: diluição 1:500; IgG anti-rato, Alexa Fluor 594: diluição 1:500; Faloidina Alexa Fluor 488: diluição 1:1200.
    11. Incubar células com anticorpo secundário ou faloidina diluída em 1x PBS/ABS 0,3% Saponina 0,15% por 45 min.
      NOTA: A incubação do anticorpo secundário ou da faloidina deve ser realizada na ausência de luz. Cubra as placas com papel alumínio para proteger da luz durante as etapas a seguir.
    12. Lave as lamínulas 3 vezes com 1x PBS por 5 min.
    13. Remova as lamínulas dos poços.
    14. Na ausência de luz, adicione 10 μL de meio de montagem com DAPI em lâminas de vidro microscópicas limpas.
    15. Coloque lamínulas com as células voltadas para baixo para permitir o contato entre as células e a solução de DAPI.
      NOTA: Cubra as corrediças com papel alumínio para proteger da luz.
    16. Incubar por 30 min em temperatura ambiente.
    17. Conservar a -20 °C.

6. Microscopia confocal, aquisição de imagens e quantificação usando FIJI

NOTA: Para adquirir/capturar imagens de imunofluorescência, use um microscópio confocal de varredura a laser. A lente objetiva de imersão em óleo de 63x é recomendada para uma resolução ideal.

  1. Deixe as lamínulas atingirem a temperatura ambiente, protegidas da luz, por pelo menos 30 minutos antes da aquisição da imagem.
  2. Limpe as lamínulas com lenço absorvente.
  3. Adicione uma gota de óleo de imersão à objetiva e coloque cada lâmina sob o microscópio.
  4. Mova a objetiva até que o óleo toque a lâmina.
  5. Observe e ajuste o foco do microscópio; Selecione a objetiva 63X com óleo.
  6. Ligue os lasers nos comprimentos de onda de 488 nm, 552 nm e 405 nm .
  7. Selecione a resolução da imagem: 1024 x 1024.
  8. Clique no botão Ao vivo , defina a pilha Z e pressione Iniciar. Repita o processo e pressione Fim.
  9. Depois de selecionar a opção Projeção máxima no menu Ferramenta , aguarde até que a imagem seja adquirida.
  10. Salve o experimento.
  11. Exporte imagens no formato .lif em um computador. Use o software de análise de imagem de código aberto FIJI para analisar imagens.
  12. Selecione as imagens a serem analisadas e selecione Duplicar imagem.
  13. Para ter a imagem em tons de cinza, selecione Imagem | Ajustar | Limite de cor. Selecione 0 e 255 (saturação).
  14. Selecione o método de limite: Padrão.
  15. Selecione a cor limite: B e W (preto e branco).
  16. Não selecione Fundo escuro.
  17. Selecione: Processo | Binário | Opções e, em seguida, selecione os dados relevantes a serem medidos: Área, Mín, Máx, valor de cinza, densidade de integração.
  18. Selecione a ferramenta de mãos livres na barra de ferramentas Fiji e trace cada célula manualmente com cuidado.
  19. No menu Analisar , selecione Definir medidas. Certifique-se de que a intensidade integrada da área e o valor médio de cinzento estão selecionados. Repita esse processo para cada célula.
  20. Selecione todos os dados na janela Resultados e copie e cole em um arquivo de planilha.
  21. Calcule a fluorescência total corrigida da célula (CTCF): CTCF (Densidade de integração = Área da célula selecionada x Fluorescência média das leituras de fundo).
  22. Abra o arquivo que contém dados usando um software de análise estatística para realizar análises estatísticas.

7. Análise estatística

  1. Abra um novo projeto quando uma caixa de diálogo de boas-vindas for exibida.
  2. Escolha o tipo de gráfico e a mídia com SD.
  3. Aplique os valores obtidos dos resultados experimentais à tabela.
  4. Selecione Estatística Descritiva e escolha a coluna de opção Estatísticas [todos os testes] para analisar a distribuição de dados.
  5. Se os dados seguirem uma distribuição gaussiana, escolha o teste t para analisar amostras comparando dois pares. Se a distribuição não for gaussiana, analise os dados usando o teste de Mann-Whitney.
  6. Escolha a melhor opção de gráfico para uma representação de dados ideal.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Este protocolo aqui descrito permite a avaliação da migração celular e seus mecanismos associados, como dinâmica e adesão de actina, fornecendo assim uma ferramenta para determinar a migração de células hospedeiras infectadas por Leishmania dentro do hospedeiro vertebrado. Os resultados apresentados aqui demonstram que este ensaio in vitro fornece indicações rápidas e consistentes de mudanças na adesão celular, migração e dinâmica da actina antes da experimentação in vivo .

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O método descrito aqui para avaliar a migração celular usando o sistema de inserções de membrana de cultura celular permite que os pesquisadores estudem a resposta migratória das células em um ambiente bidimensional. Nessa técnica, algumas etapas são consideradas críticas. Em primeiro lugar, a diferenciação de CDs humanas e a infecção por Leishmania são determinantes, uma vez que a taxa de infecção é dependente do doador. O uso de mais de um doador por experimento e culturas sau...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa da Bahia (Fapesb), processo nº 9092/2015. Os autores agradecem ao CNPq, Capes e Fapesb pelo apoio financeiro via bolsas. Os autores gostariam de agradecer a Andris K. Walter pela análise crítica, revisão da língua inglesa e assistência na edição do manuscrito.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha de calibre 16Descarpack353101
placa de cultura de células de 24 poçosJET-BIOFILJ011024
Agulha de calibre 25Descarpack353601
Albumina de soro bovinoSigma AldrichA2153-100G
Cloreto de amônioSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-coelho IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Frasco de Cultura de Células 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Microscópio confocalLeicaTCS SP8
Coverslip círculos 13mmPerfecta10210013CE
Pinça de dissecaçãoVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Tubo de falcãoKASVIK19-0051
Fetal Soro bovinogibco
Microscópio de fluorescênciaOlympus  BX51
Lâmina de vidro  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovinoSigma AldrichH2250
HemocitômetroPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Mínimo Essencial MouseGibco41090093
anti-Rac1BD610650
ParaformaldeídoSigma Aldrich158127
Faloidina Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Tamponado com Fosfato SalinoThermoFisherAM9624
Inserções de Transwell de Membrana de Policarbonato - Tamanho do poro 5.0 µ mCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilina (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
R & CCL3 Humano Recombinante D Systems270-LD-010
Recombinante Humano GM-CSFPeproTech300-03
Recombinante Humano IL-4PeproTech200-04
Recombinante Humano M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MédioGibco21870076
SaponinaSigma Aldrich47036 - 50G - 50G - F
Seringa 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061
16000044 Médio

Referências

  1. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  2. Bi, K., Chen, Y., Zhao, S., Kuang, Y., John Wu, C. H. Current Visceral Leishmaniasis Research: A Research Review to Inspire Future Study. BioMed Research International. 2018, (2018).
  3. Serafim, T. D., Iniguez, E., Oliveira, F. Leishmania infantum. Trends in Parasitology. 36 (1), 80-81 (2020).
  4. Van Assche, T., Deschacht, M., da Luz, R. A. I., Maes, L., Cos, P. Leishmania-macrophage interactions: Insights into the redox biology. Free Radical Biology and Medicine. 51 (2), 337-351 (2011).
  5. Podinovskaia, M., Descoteaux, A. Leishmania and the macrophage: A multifaceted interaction. Future Microbiology. 10 (1), 111-129 (2015).
  6. Antoine, J. C., Prina, E., Jouanne, C., Bongrand, P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-infected macrophages maintain an acidic pH. Infection and Immunity. 58 (3), (1990).
  7. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  8. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  9. Sheetz, M. P., Felsenfeld, D., Galbraith, C. G., Choquet, D. Cell migration as a five-step cycle. Biochemical Society symposium. 65, 233-243 (1999).
  10. Yano, H., et al. Roles played by a subset of integrin signaling molecules in cadherin-based cell-cell adhesion. Journal of Cell Biology. 166 (2), 283-295 (2004).
  11. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: In command and control of cell motility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (1), 56-68 (2005).
  12. Deramaudt, T. B., et al. Altering FAK-Paxillin Interactions Reduces Adhesion, Migration and Invasion Processes. PLoS One. 9 (3), (2014).
  13. Turner, C. E. Paxillin and focal adhesion signalling. Nature Cell Biology. 2 (12), (2000).
  14. Linder, S., Aepfelbacher, M. Podosomes: Adhesion hot spots of invasive cells. Trends in Cell Biology. 13 (7), 376-385 (2003).
  15. Huveneers, S., Danen, E. H. J. Adhesion signaling - Crosstalk between integrins, Src and Rho. Journal of Cell Science. 122 (8), 1059-1069 (2009).
  16. Jones, G. E. Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 593-602 (2000).
  17. De Fougerolles, A. R., Koteliansky, V. E. Regulation of monocyte gene expression by the extracellular matrix and its functional implications. Immunological Reviews. 186 (1), 208-220 (2002).
  18. Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. a, Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. The Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 9998-10006 (2011).
  19. Verkhovsky, A. B., et al. Orientational order of the lamellipodial actin network as demonstrated in living motile cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (11), 4667-4675 (2003).
  20. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  21. Hall, A. Small GTP-binding proteins, and the regulation of the actin cytoskeleton. Annual Review of Cell Biology. 10, 31-54 (1994).
  22. Machesky, L. M., Hall, A. Rho: A connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 6 (8), 304-310 (1996).
  23. Ridley, A. J., Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70 (3), 389-399 (1992).
  24. DeMali, K. A., Burridge, K. Coupling membrane protrusion and cell adhesion. Journal of Cell Science. 116 (12), 2389-2397 (2003).
  25. López-Colomé, A. M., Lee-Rivera, I., Benavides-Hidalgo, R., López, E. Paxillin: A crossroad in pathological cell migration. Journal of Hematology and Oncology. 10 (1), (2017).
  26. Carvalhal, D. G. F., et al. The modelling of mononuclear phagocyte-connective tissue adhesion in vitro: Application to disclose a specific inhibitory effect of Leishmania infection. Experimental Parasitology. 107 (3-4), 189-199 (2004).
  27. Pinheiro, N. F., et al. Leishmania infection impairs β1-integrin function and chemokine receptor expression in mononuclear phagocytes. Infection and Immunity. 74 (7), 3912-3921 (2006).
  28. de Menezes, J. P. B., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), (2017).
  29. Hermida, M. D. R., Doria, P. G., Taguchi, A. M. P., Mengel, J. O., dos-Santos, W. L. C. Leishmania amazonensis infection impairs dendritic cell migration from the inflammatory site to the draining lymph node. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 450(2014).
  30. Ballet, R., et al. Blocking junctional adhesion molecule c enhances dendritic cell migration and boosts the immune responses against Leishmania major. PLoS Pathogens. 10 (12), (2014).
  31. Rocha, M. I., et al. Leishmania infantum enhances migration of macrophages via a phosphoinositide 3-Kinase î-dependent pathway. ACS Infectious Diseases. 6 (7), 1643-1649 (2020).
  32. Hiasa, M., et al. GM-CSF and IL-4 induce dendritic cell differentiation and disrupt osteoclastogenesis through M-CSF receptor shedding by up-regulation of TNF-α converting enzyme (TACE). Blood. 114 (20), 4517-4526 (2009).
  33. de Melo, C. V. B., et al. Phenotypical characterization of spleen remodeling in murine experimental visceral leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 11, 653(2020).
  34. Gibaldi, D., et al. CCL3/macrophage inflammatory protein-1α is dually involved in parasite persistence and induction of a TNF- and IFNγ-enriched inflammatory milieu in Trypanosoma cruzi-induced chronic cardiomyopathy. Frontiers in Immunology. 11, 306(2020).
  35. Finger, P. T., Papp, C., Latkany, P., Kurli, M., Iacob, C. E. Anterior chamber paracentesis cytology (cytospin technique) for the diagnosis of intraocular lymphoma. British Journal of Ophthalmology. 90 (6), 690-692 (2006).
  36. Zhang, C., Barrios, M. P., Alani, R. M., Cabodi, M., Wong, J. Y. A microfluidic Transwell to study chemotaxis. Experimental Cell Research. 342 (2), 159-165 (2016).
  37. Glynn, S. A., O'Sullivan, D., Eustace, A. J., Clynes, M., O'Donovan, N. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors, simvastatin, lovastatin and mevastatin inhibit proliferation and invasion of melanoma cells. BMC Cancer. 8, (2008).
  38. van de Merbel, A. F., vander Horst, G., Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Protocols for migration and invasion studies in prostate cancer. Methods in Molecular Biology. 1786, 67-79 (2018).
  39. Omar Zaki, S. S., Kanesan, L., Leong, M. Y. D., Vidyadaran, S. The influence of serum-supplemented culture media in a transwell migration assay. Cell Biology International. 43 (10), 1201-1204 (2019).
  40. Borovikov, I. S. Izuchenie strukturnykh izmeneniǐ sokratitel'nykh belkov myshechnogo volokna s pomoshch'iu poliarizatsionnoǐ ul'trafioletovoǐ fluorestsentnoǐ mikroskopii. VIII. Vliianie glutaral'degida i falloidina na konformatsiiu F-aktina. Tsitologiya. 26 (11), 1262-1266 (1984).
  41. Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The Journal of Cell Biology. 105 (4), 1473-1478 (1987).
  42. Allen, W. E., Jones, G. E., Pollard, J. W., Ridley, A. J. Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages. Journal of Cell Science. 110, 707-720 (1997).
  43. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Infec o por LeishmaniaC lulas Dendr ticasMigra o de Macr fagosDin mica da ActinaComplexos de Ades oEnsaio In VitroDissemina o do Parasita

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.