Aspectos práticos da preparação e configuração da amostra de ¹H R_1ρ Experimentos de dispersão de relaxamento do RNA

As RNAs realizam uma infinidade de funções regulatórias^1,catalítica²e estrutural³ na célula, muitas das quais estão correlacionadas a uma estrutura molecular flexível e mudanças intrincadas dessas estruturas^4,5,6,7. Estados pouco populosos permanecem invisíveis para a maioria dos métodos de determinação da estrutura ou não permitem o estudo desses estados ocultos em alta resolução atômica. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) combina ambos os aspectos, fornecendo acesso a núcleos atômicos individuais, bem como oferecendo uma grande caixa de ferramentas de experimentos visando dinâmicas através de todos os regimes de tempo⁸. Os experimentos de RD NMR fornecem acesso à troca conformacional na escala de tempo intermediária, onde podem ser esperadas alterações nos padrões de emparelhamento de base e rearranjos estruturais locais^{5,9,10,11,12,13,14}. Os experimentos RD são realizados como medidas longas R₂ na forma de um trem de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill¹⁵ ou como medidas de relaxamento no quadro rotativo, chamado R_1ρ RD experimentos¹⁶.

Embora ambos possam ser usados para extrair diferença populacional e cambial e de mudança química para o estado menor, os experimentos R_1ρ RD também dão o sinal da diferença de mudança química do estado animado. Isso permite uma inferência sobre a estrutura secundária, que se correlaciona fortemente com a mudança química nas estruturas de RNA¹⁷. A mudança química é um bom indicador de helicidade no caso de prótons aromáticos e carbonos nas nucleobases, de parceiros de emparelhamento de base para prótons imino, e de discos de açúcar nos átomos C4' e^{C1' 18,19}. Deve-se notar que recentemente um experimento de transferência de saturação de câmbio químico (CEST) usando maior potência de bloqueio de giro (SL), mudando assim a aplicabilidade do experimento CEST para escalas de tempo de câmbio mais rápidas, foi publicado como uma alternativa ao experimento R_1ρ RD para sistemas com um estado animado.

Embora os isótopos ^{de 13}C e ¹⁵N tenham sido frequentemente usados para acessar a troca estrutural, trabalhos recentes deste laboratório usaram prótons aromáticos e iminos como sondas para troca conformacional^9,10. O uso de ¹H como núcleo observado traz várias vantagens, por exemplo, acesso à troca em escalas de tempo mais rápidas e lentas, maior sensibilidade e tempos de medição mais curtos. Isso é facilitado ainda pela abordagem SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE), proporcionando acesso a prótons aromáticos através da despovoamento do espectro unidimensional (1D) utilizando acoplamentos escalares homonucleares, em vez de uma transferência de magnetização heteronuclear, e eliminando a necessidade de rótulos de isótopos²⁰. Este protocolo aborda a medição em experimentos ^{RD de 1}H R_1ρ de amostras uniformemente ^rotuladase sem rótulos^N. Portanto, este artigo apresenta um método de preparação amostral que foi considerado o mais versátil para diferentes necessidades de preparação amostral²¹ e discute alternativas na última seção deste artigo (Figura 1).

Neste ponto, o leitor deve observar que outras técnicas de preparação da amostra são aceitáveis para experimentos ^{rd de 1}H R_1ρ, e que outros métodos de análise estrutural e funcional podem ser realizados com as amostras sintetizadas com a técnica apresentada. ¹ Os experimentos H R_1ρ RD requerem altas concentrações de RNA (idealmente >1 mM) bem como alta homogeneidade, tanto no comprimento do RNA quanto na conformação estrutural para garantir uma caracterização confiável da dinâmica molecular. A transcrição in vitro (IVT) é o método de escolha para muitos pesquisadores produzirem amostras de RNA com ¹³C/¹⁵N rotulados devido à disponibilidade de triptosfatos nucleosídeos rotulados (NTPs) e incorporação fácil na reação enzimática²². No entanto, a polimerase T7 RNA amplamente utilizada (T7RNAP)^23,24,25 sofre de baixa homogeneidade de 5' no caso de certas sequências de iniciação^26,27 e muitas vezes também 3' homogeneidade durante o escoamento de transcrição²⁸. A purificação das espécies de RNA alvo torna-se mais cara e trabalhosa devido à necessidade de grandes quantidades de ~200 nmol. O método aqui utilizado foi apresentado anteriormente onde as vantagens foram discutidas em geral²¹. Resumindo, ele resolve os problemas descritos transcrevendo uma transcrição em tandem maior que é então especificamente cortada por Escherichia coli RNase H, guiada por um oligonucleotídeo^{quimérico 29,30} (ver Figura 2 para detalhes).

A incorporação de uma sequência espaçadora nas extremidades de 5' e 3' da transcrição tandem permite o uso de uma sequência de iniciação de alto rendimento e remoção de saliências terminais próximas ao local de linearização do modelo plasmídeo, respectivamente (Figura 2B). O método mostrou-se para melhorar significativamente os rendimentos, ao mesmo tempo em que reduz o custo e a mão-de-obra, com a ressalva de uma síntese de modelo mais complexa e a necessidade de uma enzima adicional e oligonucleotídeo. A alta especificidade do decote RNase H facilita a purificação devido à falta de espécies de RNA em uma faixa de tamanho semelhante. O presente protocolo utiliza uma etapa de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de intercâmbio de íons que foi publicada por este laboratório recentemente^31,embora outros métodos sejam alternativas possíveis. ¹ H R_1ρ RD pode, em geral, ser adquirido em amostras rotuladas ou não com duas respectivas sequências de pulso, o experimento "rotulado" ¹H R_1ρ heteronuclear single correlação (HSQC)-based experimento com uma dimensão indireta ^{de 13}C¹⁰ e o "unlabeled" ¹H R_1ρPE-based experimento com uma dimensão indireta ²⁰H .

Esses experimentos bidimensionais (2D) podem servir como uma primeira verificação, independentemente de a dinâmica na escala de tempo R_1ρ estar presente na amostra. Uma visão geral do RD para todos os picos resolvidos nos espectros pode ser obtida, e picos de interesse para uma análise rd mais completa podem ser identificados. Isso significa que mesmo amostras não rotuladas podem ser verificadas antes da decisão de produzir uma amostra mais cara e rotulada. Uma vez que um pico com contribuição de troca conformacional é selecionado para ser estudado mais detalhadamente, é melhor mudar para as versões 1D dos experimentos acima (se o pico ainda pode ser resolvido) para realizar os chamados experimentos fora de ressonância. Para a versão rotulada, a transferência do HSQC para ¹³C é substituída por um passo seletivo de polarização cruzada heteronuclear (HCP) como usado em ^{experimentos 13}C R_1ρ ^32,33,34,35, enquanto no caso do experimento SELOPE, o experimento é simplesmente executado como um 1D, o que é especialmente útil para sinais H8 e H2 que estão deitados na diagonal no 2D de qualquer maneira. Um critério sobre qual sequência de uso, desde que tanto, uma amostra rotulada e não rotulada estejam disponíveis, é o quão bem isolado o pico de interesse está nos dois experimentos.

Em geral, recomenda-se o experimento SELOPE para amostras de RNA de até 50 nucleotídeos. Para rnas maiores, a sobreposição será maior; no entanto, nucleotídeos estruturalmente interessantes frequentemente aparecem em regiões de mudança química que são menos sobrepostas e ainda podem ser acessíveis em RNAs ainda maiores. Outro argumento seria que, em amostras sem rótulo, nenhum acoplamento J ocorre entre ¹H e ¹²C. No entanto, como o poder mínimo de bloqueio de rotação é definido pela potência mínima usada para desacoplar esses dois giros (~1 kHz) no experimento rotulado, o experimento sem rótulo permite o uso de uma gama mais ampla de pontos fortes de bloqueio de giro (SL) e, portanto, acesso a uma escala de tempo mais ampla de troca. Esses experimentos de ressonância extra fornecem informações adicionais para k_ex, como população do estado animado (conformr alternativo), p_ES, bem como informações de mudança química muito valiosas na forma de Δω (a diferença de mudança química do estado terrestre e do estado animado).

Figura 1: Fluxo de trabalho do protocolo apresentado. Preparação antes da produção real de amostras em larga escala, consistindo na preparação do modelo e confirmação da transcrição in vitro bem sucedida e do decote RNase H. Produção em larga escala, incluindo purificação hplc, enchimento do tubo NMR e confirmação de dobramento de RNA. Em caso de síntese rotulada por isótopos, deve ser realizada uma purificação sem rótulo para otimização de gradiente no mesmo dia. Caracterização nMR da dinâmica conformacional com experimentos R_1ρ. Cada etapa pode ser realizada de forma independente, por exemplo,a análise ^{RD de 1}H R_1ρ pode ser aplicada a qualquer amostra de RNA adequada produzida com outro método. Abreviaturas: IVT = transcrição in vitro; HPLC = cromatografia líquida de alto desempenho; NMR = ressonância magnética nuclear; RD = dispersão de relaxamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O objetivo deste protocolo é fornecer detalhes práticos e parâmetros críticos para o estudo da dinâmica conformacional com dispersão de relaxamento ^{de 1}H R_1ρ em moléculas de grampos de RNA. Depois de fornecer um protocolo detalhado do design, síntese e purificação hplc de troca de íons de um RNA de destino que pode ser realizado usando todos, alguns ou nenhum NTPs como versões com ¹³C/¹⁵N, foi descrito o fluxo de trabalho de finalizar a amostra NMR e confirmar a troca conformacional com espectroscopia NMR. Finalmente, são descritos os detalhes para a configuração de ^{experimentos 1}H R_1ρ RD em um espectrômetro Bruker NMR(Figura 1). O protocolo dá cada passo para configurar a versão 1D para amostras rotuladas e comentários adicionais e uma tabela para ajustar para a configuração da versão SELOPE (Tabela 2). Após o protocolo, são discutidas etapas críticas e rotas alternativas para a preparação da amostra e a configuração RD ^de1 H R_1ρ.

Figura 2: Representação esquemática do protocolo ivt tandem relatado. (A) Transcrição tandem de um modelo plasmídeo linearizado com T7RNAP (esquerda) e sucessivas decotes por RNAse H da transcrição para alcançar o comprimento-alvo RNA, dirigido por um guia de DNA quimérico (à direita). (B) Esquema detalhado do modelo tandem começando com o promotor T7RNAP viral, uma sequência de iniciação. A sequência de destino (azul escuro, exemplo aqui tem 20 nt de comprimento) é repetida "n" vezes. As repetições ladeadas por uma sequência espaçadora de 5′ e 3′ constituídas pelos últimos oito e quatro primeiros nucleotídeos, respectivamente, para permitir a remoção das sequências de iniciação e restrição da primeira e última unidade de repetição. (C) Hibridização da transcrição tandem (vermelho) e das guias de decote quimérico (verde). RNase H aperta o RNA oposto ao DNA 5′ final. Os flancos RNA 2'-OMe aumentam a especificidade aumentando a afinidade vinculante do guia de decote ao RNA alvo. Este número foi modificado a partir de ²¹. Abreviaturas: T7RNAP = T7 RNA polymerase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparando o trabalho para uma nova construção de RNA

1. Projeto e preparação plasmid
   1. Escreva a sequência de modelos em uma ferramenta de clonagem, por exemplo,Serial Cloner.
   2. Pegue a sequência de promotor T7 e adicione uma sequência de iniciação de alto rendimento (T7: 5'-TAATACGACTACTATA ^GGGAGA-3').
      NOTA: A transcrição começará no nucleotídeo indicado com um caret (^). A sequência de iniciação GGGAGA é variável, mas fortemente dependente de sequência; portanto, recomenda-se o uso desta sequência.
   3. Adicione os últimos 8 nucleotídeos (nt) da sequência de destino como um espaçador de 5''(5'S).
   4. Adicionar repetições da sequência de destino (TS).
   5. Adicione os quatro primeiros nucleotídeos como espaçador de 3' após as repetições (5'S).
   6. Adicione um site de restrição BamHI (RS) ou um site de restrição exclusivo semelhante.
      NOTA: A sequência total mostrada será clonada ou prontamente ordenada em um plasmídeo bacteriano de alta cópia(por exemplo,pUC19): 5'-T7-5'S-(TS)_n-3'S-RS-3'(Figura 2B). O número de repetições deve ser tão alto quanto o permitido pela síntese genética ( um máximo de 600 nt neste protocolo).
   7. Amplie o plasmídeo em E. coli usando um kit comercial.
   8. Linearize o plasmídeo purificado a 20 ng/μL usando o local de restrição apropriado. A restrição de escala digere com BamHI em até 1 mL.
   9. Purifique o plasmídeo digerido, e confirme a linearização bem sucedida em um gel de 1% de agarose. Armazene o plasmídeo linearizado a -20 °C por vários meses.
2. Design do guia de decote(Figura 2C)
   1. Escreva os últimos oito nucleotídeos da sequência de RNA alvo na direção de 5'-3', e adicione os quatro primeiros nucleotídeos da sequência de RNA alvo no final de 3' também na direção de 5'-3'.
   2. Gerar o complemento de DNA reverso dessa sequência
   3. Altere o primeiro e último quatro nucleotídeos para suas modificações de 2'-OMe adicionando um 'm' antes da letra nucleotídea.
      NOTA: Para síntese, o mU é usado em vez de mT.
   4. Ordene o oligo com purificação de desalização padrão.
      NOTA: Verifique se o oligo gerado pode se ligar em outro lugar que não seja a conexão de duas sequências de RNA. A complementaridade total nos quatro núcleos centrais de DNA é necessária, enquanto as regiões de flanqueamento podem permitir uma incompatibilidade. Se necessário, estenda os flancos até 18 nt para gerar uma sequência de ligação única³⁶.
3. IVT de pequena escala
   NOTA: Para o trabalho sem RNase, prepare todos os reagentes em condições estéreis e livres de RNase. Use reagente de descontaminação RNase (ver tabela de materiais) e 95% v/v de etanol para limpar superfícies de trabalho e pipetas antes de usar. Lave luvas com 95% de etanol e use roupas de manga comprida sem fiapos. Para minimizar a contaminação rnase, não respire sobre tubos abertos.
   1. Preparar soluções de estoque de Tris-Cl (pH 8.0), dithiothreitol, MgCl₂, espermidina e NTPs/GMP (não oferecido). Misture reagentes como mostrado na Tabela 1. Prepare uma mistura mestre desses reagentes com antecedência, antes da adição de enzimas ou ácidos nucleicos.
      NOTA: Se usar reagentes congelados, misture-os completamente após o descongelamento. Os reagentes podem precipitar-se se misturados em concentrações muito altas, por isso é fortemente recomendado seguir a ordem na Tabela 1.
   2. Adicione na seguinte ordem: plasmid, guia de decote, fosfatismo inorgânico (IPPase), RNase H, T7RNAP. Como a atividade enzimática pode variar para enzimas produzidas internamente, teste várias concentrações antes de selecionar a melhor.
      NOTA: Inclua um controle negativo para a reação do decote, por exemplo, sem RNase H, para atribuir uma faixa de alvo ausente ao decote RNase H falho e não à transcrição mal sucedida.
   3. Incubar a reação a 37 °C por 1h e confirmar a reação em uma eletroforese de gel de poliacrilamida de desnaturação (PAGE) (Figura 3A). Diluir a amostra 10 vezes na solução de carregamento e carregar 1 μL no gel.
      NOTA: Mistura de gel: 8 M de ureia, 20% acrilamida (19:1 acrilamida:bisacrilamida) em 1x TBE. Solução de carregamento: 5 mM ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA), 300 μM azul bromofenol em formamida. As reações de decote RNase H não podem ser completas após 1h, já que o novo RNA é produzido constantemente. Neste ponto, procure uma faixa-alvo clara e a ausência de uma espécie de peso molecular semelhante (por exemplo,±3 produtos nucleotídeos (nt).

Tabela 1: Tabela reagente para TANDEM IVT e decote RNase H simultâneo. As concentrações de estoque podem ser adaptadas à conveniênciadousuário. Se o decote RNase H deve ser realizado após t7 IVT, adicione guia de decote e RNase H após a inativação de calor de T7RNAP. As quantidades utilizadas escalam linearmente com escala de reação. Abreviaturas: T7RNAP = T7 RNA polymerase; IVT = transcrição in vitro.

2. Preparação da amostra de NMR

1. Dimensione a reação ao volume desejado (tipicamente 10 mL) e execute a reação durante a noite. Teste para conclusão de reação no dia seguinte com um gel PAGE desnaturado(Figura 3A).
   NOTA: A reação incompleta do decote é mostrada por espécies de peso molecular mais altas acima da faixa-alvo.
   1. Se o decote não foi bem sucedido ou completo, o RNA reanneal e o guia de decote no vaso de reação aquecendo a solução em um micro-ondas convencional a 450 W para 15 s.
   2. Esfrie a solução lentamente a 37 °C por 40 min. Use um bloco de aquecimento para volumes abaixo de 1 mL. Note a formação de novo precipitado.
   3. Adicione mais IPPase e RNase H, e incubar por mais 1-3 h a 37 °C. Confirme a conclusão da reação do decote com a DEsnaturação PAGE.
   4. Quando a reação de decote RNase H estiver concluída, sacie a reação adicionando EDTA a 50 mM de concentração final e vórtice completamente.
      NOTA: A precipitação potencial do pirofosfato se dissolverá, e novas formas de precipitação de proteínas.
   5. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,2 μm e concentre-se em um volume injetável em um sistema HPLC, dependendo do tamanho do loop de injeção.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui congelando a amostra a -20 °C.
2. Purificação hplc em larga escala
   1. Prepare os buffers de troca de íons A e B dentro de uma semana de uso. Filtrar e desgas os buffers.
      NOTA: Tampão A: acetato de sódio de 20 mM; Perclorato de sódio de 20 mM, pH 6,5. Tampão B: acetato de sódio de 20 mM; Perclorato de sódio de 600 mM, pH 6,5.
   2. Equilibre a coluna com 100% de buffer B seguido de 100% tampão A para pelo menos 2 volumes de coluna a 75 °C.
   3. Prepare a sequência HPLC(Figura 3B) a uma vazão de 5,5 mL/min. Use a seguinte sequência para purificação de um RNA de tamanho entre 20 e 30 nt: 0-7 min: 0% B; 7-16 min: gradiente 0-20% B; 16-46 min: elução, tipicamente com gradiente de 20-30% B (otimizar de acordo com as necessidades); 46-62 min: 100% B; 62-73 min: 0% B.
      NOTA: Uma mudança na vazão de 5,5 para 8 mL/min não influenciou a separação neste protocolo.
   4. Otimize o gradiente de elução pela injeção de um equivalente a 1 mL de reação de transcrição (sem rótulo) de cada vez.
      NOTA: Para maiores detalhes e discussão, consulte Karlsson et al.³¹ e Feyrer et al.²¹.
   5. Teste as frações coletadas em uma PÁGINA de desnaturação. Se o pico de elução principal estiver bem isolado e contiver o RNA de destino puro, aumente a purificação para um equivalente a 10 mL de reação de transcrição.
   6. Colete as frações de juros, concentre-se e troque o buffer com o buffer NMR. Use uma unidade de filtro ultracentrifugal (ver a Tabela de Materiais) para volumes acima de 50 mL.
      NOTA: Tampão de RMN: fosfato de sódio de 15 mM; Cloreto de sódio de 25 mM; 0,1 mM EDTA, pH 6.5. Para minimizar a perda da adesão do RNA às paredes dos tubos de plástico, lave todos os tubos de coleta com 1 mL de água, vórtice e centrífuga para coletar todo o líquido.
   7. Determine a concentração através de espectroscopia ultravioleta. Calcule o rendimento da reação de acordo com Feyrer et al²¹.
      NOTA: A concentração de uma amostra de RMN para experimentos rd não deve ser inferior a 130 nmol, o que corresponde a 500 μM em um volume amostral de 250 μL usando tubos de RN(Tabela de Materiais).
3. Dobramento de uma amostra de RNA
   1. Diluir e alíquotar a amostra de um volume de ~10 mL em 1 mL por tubo.
   2. Aqueça as alíquotas de RNA a 95 °C por 5 minutos.
   3. Esfrie as amostras colocando-as no gelo ou em uma mistura de água-gelo-sal e incubar por 30 minutos.
   4. Possua amostras e concentre-se em ~250 μL em uma unidade de filtro centrífugo de 2 mL.
4. Enchimento de um tubo NMR
   1. Limpe o tubo NMR no limpador de tubos NMR lavando com água abundante, reagente de descontaminação RNase, água, 95% de etanol (EtOH) e água novamente. Deixe secar.
   2. Limpe o êmbolo enxaguando com água e limpando com reagente de descontaminação RNase e 95% EtOH usando um lenço sem fiapos. Deixe secar.
   3. Adicione 10% (v/v) de D₂O à amostra NMR.
   4. Encha a amostra de RNA no tubo NMR usando uma grande ponta de pipeta. Deixe o líquido fluir ao longo da lateral da parede do tubo.
   5. Insira o êmbolo e remova as bolhas de ar empurrando o êmbolo para baixo junto com um movimento de torção rápida.
   6. Puxe o êmbolo lentamente sem criar novas bolhas de ar e fixá-lo com filme de cera de parafina.
5. Confirme a dobra por NMR.
   NOTA: Neste ponto, é necessário realizar pelo menos uma atribuição de ressonância parcial para confirmar a estrutura secundária da amostra de RNA e identificar regiões de interesse para o estudo da dinâmica conformacional. Uma descrição exaustiva sobre a atribuição de ressonância RNA excederia este protocolo, portanto nos referimos à literatura bem estabelecida neste ponto^19,37,38. Um ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) pode ser um indicador útil de dobramento de RNA e servir como dados complementares para experimentos de RN.
   1. Compare os seguintes espectros da amostra para os quais são realizados experimentos ^{de 1}H R_1ρ RD com a amostra de referência devidamente dobrada (Figura 4): ¹H 1D, especialmente a região imino 10–15 ppm; Aromático ¹H,¹³C-HSQC; ¹ H,¹H-SELOPE (opcional).
      NOTA: Uma impressão digital aromática também é necessária, mesmo em caso de concordância entre sinais iminos, pois a formação de dimer muitas vezes mostra os mesmos sinais iminos ou similares como um grampo de cabelo de RNA. O experimento SELOPE pode substituir um ¹H,¹³C-HSQC por impressão digital aromática, já que experimentos heteronucleares em amostras não rotuladas são muito demorados.
   2. Use o loop UUCG como referência de impressão digital (se estiver presente).
   3. Realize esta comparação todas as ^vezesantes que os experimentos 1 H R_1ρ RD sejam registrados.

3. ¹H R_1ρ Dispersão de relaxamento—naressonância (versão 1D rotulada)

NOTA: As etapas abaixo descrevem a configuração de experimentos RD para uma amostra rotulada usando a versão 1D da sequência de pulso RD baseada em HSQC. Siga os mesmos passos para a sequência 1D baseada em SELOPE para amostras sem rótulo. Uma visão geral dos nomes dos parâmetros e configurações para ambos os casos são mostradas na Tabela 2. O foco nas versões 1D é porque elas são mais práticas para medições fora da ressonância, e a configuração das versões 2D dos experimentos baseados em SELOPE e HSQC foram discutidas detalhadamente por Schlagnitweit et al.²⁰ e Steiner et al.^{10, respectivamente.}

1. Determine a potência ^{de 1}H para um pulso rígido de 90° (P1).
   1. Opção A: Use o comando pulsecal Bruker.
   2. Opção B: Em um experimento zg, determine o pulso de 360° medindo uma curva de noz no nível de energia de pulso rígido de prótons no pico da água.
      NOTA: O comprimento do pulso de 90° é um quarto da duração onde o sinal zero é observado (se uma curva de noz completa é medida, então é o segundo zero; porém, na prática, apenas a região ao redor do valor esperado para o 360° é amostrada).
2. Execute um espectro ¹H 1D zgesgp.f2f3dec usando o comprimento do pulso determinado na etapa 3.1 para confirmar o RNA dobrando antes de cada medição R_1ρ.
   NOTA: Se os experimentos ^{de 1}H SL forem executados pela primeira vez, verifique se a potência SL calculada corresponde à potência fornecida à amostra calibrando a potência SL para cada largura de banda desejada. As etapas detalhadas de calibração são descritas em Steiner et al.¹⁰.
3. Crie um conjunto de dados de ¹ H R_1ρ para o conjunto de dados rotulado e defina parâmetros-chave.
   1. Criar um novo conjunto de dados; idealmente baseado em um conjunto de dados H-13 C aromáticos HSQC de ^1H-13C, usado em amostras de RNA totalmente rotuladas para atribuição de RNA.
      NOTA: Isso garantirá que ¹³C, bem como ¹⁵N de potência e energia de dissociação já estejam configurados.
   2. Defina os parâmetros gerais de acordo com a primeira parte da Tabela 2.
   3. Defina parâmetros específicos do RD de acordo com a segunda parte da Tabela 2.
   4. Defina ¹H de potência SL ao menor valor (1,2 kHz) para testes.
   5. Gere uma lista vd de teste com apenas uma entrada, 0 ms, (para otimizar a lista vd, conforme descrito na etapa 3.4), definir TDF1 para 1 e atualizar D30.
   6. Execute um espectro de teste com essas configurações.
4. Otimize a lista vd (lista de comprimentos SL a serem usados).
   1. Execute o experimento com uma lista de vds de teste (por exemplo,seis entradas: 0 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 40 m; embaralhar esses valores para evitar erros sistemáticos devido ao aquecimento).
   2. Atualização D30 e TDF1 em conformidade (neste exemplo, D30 = 42m e TDF1 = 6).
   3. Intensidade do gráfico do pico vs. comprimento SL. Identifique o comprimento de SL no qual a intensidade do pico original diminui para 1/3.
   4. Criar a lista vd final a ser usada no experimento, levando em consideração o seguinte: determinar o comprimento SL mais longo descrito na etapa anterior; evitar o uso de uma lista com ordem decrescente ou ascendente; e adicionar algumas duplicatas para estudos estatísticos. Lembre-se de atualizar D30 e TDF1 toda vez que houver alterações na lista vd.
      NOTA: O experimento é executado com diferentes comprimentos de SL, conforme dado na lista vd de forma pseudo-2D.
   5. Selecione o número de varreduras para que o pico mais fraco da lista tenha uma relação sinal-ruído (SINO) de pelo menos 10.
      NOTA: Embora a lista vd tenha sido otimizada para uma potência SL baixa (1,2 kHz), esta lista vd também deve ser testada na maior potência SL a ser usada (por exemplo,15 kHz). Isso porque a decadência será muito mais lenta na alta potência de SL para picos com contribuição significativa k_EX. Portanto, uma decadência suficiente também deve ser verificada com alta potência de SL.

Tabela 2: Visão geral dos parâmetros para configurar experimentos baseados em HCP 1D e 1D-SELOPE ¹H R_1ρ. Abreviaturas: 1D = unidimensional; HCP = polarização cruzada heteronuclear; SELOPE = Experimento de próton otimizado selectivo; ppm = partes por milhão; HSQC= correlação quântica de spin heteronuclear; SL = trava de giro; RD = dispersão de relaxamento

5. Configuração e aquisição de experimentos on-resonance ¹H R_1ρ
   1. Copie o experimento da seção 3.4 em uma nova pasta em Topspin.
   2. Nesta pasta, configure experimentos em diferentes pontos fortes de SL, sempre alterando PL25 e CNST12. Determine o nível de alimentação correto para cada força SL usando o comando de pulso. Use pontos fortes SL variando de 1,2 a 15 kHz, com uma amostragem mais densa para forças SL mais baixas (ver Figura 5G para pontos fortes SL selecionados). Adicione cópias de alguns dos experimentos para ter duplicatas para alguns dos pontos fortes da SL.
   3. Executar esses experimentos.

6. Análise de experimentos on-resonance ¹H R_1ρ
   1. No TopSpin, processe cada fatia de cada conjunto de dados pseudo-2D usando os mesmos parâmetros de processamento (por exemplo, ampliação da linha, fase) usando o comando xf2e divida o conjunto de dados em 1Ds usando o programa Bruker AU split2D.
   2. Obtenha intensidades de sinal e volumes para cada fatia 1D.
      NOTA: Na prática, é melhor desconvolver o espectro para se livrar de contribuições de picos potencialmente sobrepostos e permite o uso do programa Bruker AU multidcon, que convenientemente resume as intensidades ou áreas dos picos de todas as fatias em um experimento no arquivo de texto decall.txt, que podem ser lidos facilmente com outros programas (scripts Python escritos internamente foram usados aqui, como descrito por Steiner et al.¹⁰) nas etapas 3.6.3 e 3.6.4.
   3. Encaixe uma decadência mono exponencial para cada força SL para obter o valor R_1ρ (ou on-resonance, R₂+R_EX).
   4. Plote esses valores R₂+R_EX (y) vs. Força SL (x) (Figura 5F,G).
      NOTA: Se os valores forem significativamente mais elevados para baixos pontos fortes da SL e diminuírem com maior potência SL (como mostrado na Figura 5G),então o pico investigado mostra dispersão, e pode ser interessante realizar experimentos adicionais (fora da ressonância) para obter informações sobre a diferença populacional e de mudança química do estado animado vs. o estado terrestre.

4. ¹H R_1ρ Dispersão de relaxamento — fora da ressonância (versão 1D rotulada)

1. Configuração e aquisição de experimentos off-resonance ¹H R_1ρ
   1. Em uma nova pasta topspin, configure experimentos com uma certa força SL (geralmente primeiro na menor resistência sl como a contribuição R_EX é mais alta lá, ver Figura 5G para uma seleção representativa de SLs fora de ressonância), mas com diferentes deslocamentos, cada vez mudando CNST30.
   2. Use compensações até ± (3 ou 4)*SL de força, com uma amostragem mais densa em torno de 0 offset, como pode ser visto na Figura 5H,I.
   3. Executar esses experimentos.
2. Análise de experimentos fora de ressonância ¹H R_1ρ
   1. Use a mesma estratégia de processamento, como em 3.6.1-3.6.3, para determinar um valor de R_1ρ para cada deslocamento.
   2. Plote esses valores vs. offset(Figura 5G).
      NOTA: Uma assimetria nesta curva já pode indicar que informações de mudança química para o estado animado podem ser obtidas. A montagem e análise minuciosas usando equações bloch-McConnell ou Laguerre devem ser realizadas para obter informações sobre k_EX, p_ES, bem como Δω^10,20 (Figura 5G). Exemplos de conjuntos de dados, programas de pulso e macros para ambos os experimentos 1D podem ser encontrados no repositório Petzold Lab Github (https://github.com/PetzoldLab). Uma visão geral dos parâmetros é dada na Tabela 2.

O protocolo para produção de RNA facilita a purificação através da geração de transcrições de alta pureza. A Figura 3A mostra os resultados de várias reações de decote de transcrições tandem, fornecendo reações bem sucedidas e mal sucedidas. A faixa 1 mostra o caso ideal de uma transcrição totalmente cortada com apenas traços fracos de produtos laterais. A pista 2a mostra decote incompleto, que pode ser resolvido re-annealing e a adição de mais RNase H (Lane 2b, passo 2.1.2). As construções RNA das pistas 1, 2a e 2b são as mesmas. A amostra na faixa 3 mostra decote mal sucedido. A solução de problemas nesta reação envolveria uma verificação da sequência do guia de decote, pureza do modelo de DNA e temperaturas de ressarcial. Potencialmente, o decote RNase H terá que ser realizado após T7 IVT, como mostrado para a amostra 2.

A amostra na faixa 4 mostra uma quantidade significativa de produtos laterais de decote, que são difíceis de remover via HPLC de troca de íons. A solução de problemas como essa amostra pode envolver (a) redução da temperatura, quantidade de RNase H ou tempo de reação, (b) reduzir o gradiente de elução e o volume de injeção e tentar separar as frações-alvo dos produtos laterais. Mais informações sobre como aumentar a resolução na purificação do HPLC de intercâmbio de íons foram discutidas por Karlsson et al.31. O HPLC separa o RNA alvo de ácidos nucleicos mais longos ou mais curtos e contaminantes de proteínas ou pequenas moléculas. A Figura 3B mostra o resultado ideal para a purificação HPLC de troca de íons. O gradiente de elução deve ser escolhido de tal forma que a espécie RNA alvo elutes pelo menos um volume de coluna (neste exemplo: 35 mL) após as próximas espécies menores e um volume de coluna antes da próxima espécie maior.

Espécies menores neste método incluem nucleotídeos únicos, produtos abortivos (8-12 nt), sequências espaçadoras de 3' e 5' (5-14 nt) e guia de decote (ácido nucleico quimérico de 12 nt), enquanto sequências mais longas são potencialmente impuros e o plasmídeo. Quando um pico de elução bem separado é alcançado, a purificação pode ser dimensionada até o equivalente a ~20 mL de reação IVT por injeção. A dobra correta de uma amostra de RNA é crucial para experimentos rd e deve ser confirmada antes de cada medição. A Figura 4 mostra um RNA de 22-mer com rótulo A antes que o protocolo de dobramento na etapa 2.4 (azul) seja aplicado, e a mesma amostra após a dobra correta tenha sido alcançada (vermelho). Uma previsão de estrutura secundária mc-fold(Figura 4C) propõe a estrutura de grampos apresentado com 4 pares de base resultando em 5 sinais imino.

Ambos os espectros na Figura 4A confirmam esses sinais previstos, embora com intensidades relativas ligeiramente diferentes, o que indica que alguma estrutura desdobrada (aqui, um dimer) pode ser problemática para avaliar com apenas 1H 1D espectros. Um espectro aromático de 1H,13C-HSQC (Figura 4B),no entanto, mostra apenas 3 dos sinais aromáticos para a amostra antes do protocolo de dobramento (azul), mas todos os 4 sinais para a amostra que foi dobrado de acordo com a etapa 2.4 (vermelho). A amostra mostrada em azul provavelmente formou um homodimer (estrutura proposta na Figura 4D) que resultaria nos mesmos sinais iminos que o grampo de cabelo. O sinal do A13H2 parece ampliado. Esses resultados ajudam a destacar a importância da confirmação dobrável com experimentos de impressão digital imino e aromática antes de cada experimento rd. As sequências de pulso 1H R1ρ descritas neste protocolo permitem a detecção de dinâmicas no regime de troca intermediária. Inicialmente é registrada uma curva de ressonância e, se houver dinâmica para um resíduo específico, uma dispersão é visível dentro dos valores R 2+REX obtidos, enquanto esta curva é plana para resíduos sem troca.

A Figura 5 mostra curvas representativas de ressonância obtidas para dois átomos H8 diferentes em um grampo de RNA sintético(Figura 5A),em que as experiências G6H8 trocam(Figura 5C),enquanto A4H8 não(Figura 5B). Como a troca é relativamente lenta nesta amostra (kEX = 292 ± 40 Hz), a vantagem do experimento SELOPE para alcançar baixos pontos fortes de SL foi explorada, e as duas curvas de ressonância foram registradas usando a versão 1D da sequência de pulso. A mesma sequência de pulso foi então usada para obter dados de ressonância para o resíduo mostrando dispersão no perfil de ressonância. A Figura 5D mostra os valores R1ρ obtidos versus deslocamento em que uma ligeira assimetria da curva já indica o sinal de Δω.

Isso se torna ainda mais evidente no lote R2+REX onde a contribuição R1 é removida(Figura 5E). A coluna direita da mesma figura mostra curvas representativas de ressonância obtidas para dois átomos H8 diferentes em um grampo de RNA sintético ligeiramente diferente com troca mais rápida, em que as experiências G6H8 trocam(Figura 5G),enquanto A4H8 não(Figura 5F). A taxa de câmbio mais rápida (kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) permitiu o registro rd de todos os prótons aromáticos de uma só vez usando a versão SELOPE 2D para obter dados de ressonância contínua e externa (dados G6H8 exibidos na Figura 5H,I).

Identificadores gerais para resultados positivos e negativos
Resultados positivos no tandem IVT e RNase H decote podem ser identificados da seguinte forma: 1) A banda alvo é a banda mais forte no gel PAGE desnaturação. 2) Não há bandas fracas ou apenas fracas ao redor da banda principal. 3) Não existem ou apenas espécies de peso molecular mais fracas. 4) O cromatógrafo HPLC mostra um pico bem separado do RNA alvo. 5) Quando o pico principal é amostrado, apenas uma banda aparece em um gel PAGE desnaturado.

Resultados negativos no tandem IVT e RNase H decote presente da seguinte forma: 1) Não ou apenas uma faixa principal fraca é visível em um gel PAGE desnaturando. 2) Um padrão de espécies de alto peso molecular de RNA tandem repete é visível. 3) Embora a banda principal esteja presente, bandas de intensidade semelhante estão acima ou abaixo da faixa principal dentro de ± 3 nt.

Uma amostra bem dobrada pode ser identificada da seguinte forma: 1) O número de prótons imino observados corresponde ao número de prótons imino esperados de uma simulação de estrutura secundária (por exemplo,Mc-Fold39, Figura 4A). 2) O par de bases de oscilação syn G-U em um loop UUCG (se presente) é visível a ~9,5 ppm, às vezes apenas visível em temperatura mais baixa. Outras impressões digitais do loop UUCG foram descritas por Fürtig e colegas40. 3) A impressão digital aromática concorda com uma amostra previamente atribuída que foi confirmada para dobrar corretamente(Figura 4C).

Uma amostra descasada ou degradada pode ser identificada da seguinte forma: 1) Há mais sinais de imino do que uma simulação de estrutura secundária prevê (NOTA: menos sinais imino não implicam necessariamente dobras erradas, pois os pares de base de fechamento muitas vezes não são visíveis, e a troca conformacional amplia as linhas). 2) Ausência de sinais imino. 3) Sinais estreitos de alta intensidade na região aromática, indicando produtos de degradação de nucleotídeos únicos. 4) Divergência entre sinais iminos ou aromáticos a uma amostra de referência de dobramento confirmado(Figura 4C).

Um átomo que não mostra nenhuma troca na escala de tempo detectável pode ser identificado da seguinte forma: 1) a partir de um perfil RD plano (devido à contribuição REX ausente variando com a potência SL aplicada) (Figura 5B e Figura 5F). 2) É preciso ter cuidado para o caso de troca lenta-intermediária quando kEX e Δω são da mesma magnitude. Nesse caso, a contribuição sobre ressonância pode ser muito pequena como pode ser visto na Figura 5C (neste caso os parâmetros montados são kEX = 292 ± 40 Hz e Δω = 112 ± 4 Hz). Em caso de dúvida, uma curva de baixa ressonância SL pode ser registrada para verificação.

Um átomo mostrando troca na escala de tempo intermediário pode ser identificado 1) a partir de um perfil de dispersão de relaxamento não plano em um experimento RD de ressonância(Figura 5B e Figura 5F); 2) uma largura de linha mais ampla no experimento HSQC ou SELOPE também pode ser um indicador de troca.

Os valores de potência SL bem selecionados para curvas fora da ressonância(Figura 5E,F): 1) têm uma contribuição considerável kEX na curva de ressonância (os valores de potência SL selecionados são indicados na Figura 5C e Figura 5G). 2) À medida que as curvas de ressonância são medidas para pelo menos 3 valores de potência SL, os valores de energia SL selecionados devem ser espalhados sobre a região da curva de ressonância com contribuição kEX. 3) Leve a curvas não planas R2+REX após o ajuste de Laguerre (por exemplo, Figura 5D: Pontos fortes SL 25, 50 e 75 Hz; Figura 5E).

Valores de potência SL mal selecionados para curvas fora de ressonância(Figura 5E,F) levam a curvas planas R2+REX após o ajuste de Laguerre. Um exemplo é mostrado na Figura 5E, onde a curva de 100 Hz fora de ressonância é muito plana e, portanto, não fornece informações significativas sobre Δω.

Indicações para artefatos nucleares de overhauser de quadro rotativo (ROE): 1) Δω obtidos a partir de curvas de ressonância fora correspondem a mudanças químicas de prótons nas proximidades espaciais / prótons, que mostram um pico cruzado com o pico de interesse no espectro nuclear de espectro de efeito Overhauser (NOESY). (por exemplo,a Figura 5I mostra curvas largas fora de ressonância como esperado para troca rápida-intermediária, mas as curvas também têm características mais nítidas, por exemplo,a -3000 Hz e +1500 Hz. Estes são muito prováveis devido a um artefato ROE em vez de uma mudança química para este H8 em um conformr diferente). 2) Laguerre fit funciona, mas não funciona bem (dá altos erros ou valores fisicamente impossíveis) para uma ressonância on-resonance e pelo menos 3 curvas fora de ressonância, embora os exponenciais tenham sido obtidos a partir de experimentos com alto SINO (>20) (por exemplo, kEX = 43.502 ± 38.478 Hz). Muitas vezes cada SL se encaixa individualmente bem, mas encaixá-los em conjunto dá um erro muito maior; o comportamento oposto é esperado para um verdadeiro estado animado.

Indicações para troca "verdadeira" Δω: 1) Δω obtidas a partir de curvas fora de ressonância não correspondem a mudanças químicas de prótons em proximidade espacial/prótons, que mostram um pico cruzado com o pico de interesse no espectro NOESY (por exemplo, Figura 5E). 2) O ajuste de Laguerre dá baixos erros para uma ressonância on-resonance e pelo menos 3 curvas fora de ressonância (por exemplo, Figura 5E vs. Figura 5I, veja legenda para resultados adequados).

Figura 3: Produção amostral por T7 tandem IVT e RNase H reação de decote. (A) Desnaturação PAGE de resultados positivos e negativos de tandem IVT e RNase H decote. A altura da escada refere-se às referências de RNA, 12* refere-se ao guia quimérico de decote. Raia 1: Geração bem sucedida de um RNA alvo de 20 nt. Poucos produtos mais curtos e longos estão presentes. Faixa 2a: Decote incompleto da transcrição tandem. Embora a purificação do HPLC seja possível, muito material seria desperdiçado. Pista 2b: O decote RNase H continuado da Faixa 2 produz uma amostra limpa pronta para injeção HPLC (idêntica à Faixa 1). Lane 4: O decote RNase H não teve sucesso, e nenhuma banda alvo foi produzida. A transcrição em conjunto ainda é visível a 600 nt. Lane 5: Uma banda alvo foi produzida, mas uma banda forte -1 está presente. Embora o HPLC possa ser realizado, é necessária uma remoção cuidadosa do produto lateral. (B) Exemplo de uma injeção hplc bem sucedida. O pico em 38 min contém RNA puro do comprimento alvo, enquanto produtos mais longos e mais curtos são bem separados do RNA alvo. O painel B foi modificado a partir de 21. Abreviaturas: IVT = transcrição in vitro; HPLC = cromatografia líquida de alto desempenho; nt = nucleotídeos; UA = unidades arbitrárias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplo de um grampo de RNA antes (azul) e depois (vermelho) da etapa dobrável 2.4 (ver protocolo) em NMR. (A) região Imino de um espectro 1H-1D de um RNA de 22-mer rotulado A. As regiões esperadas para a identidade do par de bases de sinais imino são indicadas em cinza abaixo. (B) 1H,13C-HSQC espectro das ressonâncias aromáticas do RNA do painel A. A amostra após a dobra (vermelho) mostra 4 sinais como esperado, enquanto a amostra antes de dobrar (azul) mostra apenas 3 sinais. (C) Previsão mc-fold do RNA 22-mer como um grampo de cabelo. Cinco sinais imino são esperados a partir desta estrutura secundária, que pode ser encontrada em ambas as amostras no painel A. (D) Estrutura proposta de um homodimer formado pelo RNA de 22-mer, resultando nos mesmos 5 pares de base que a estrutura do grampo de cabelo. Abreviaturas: NMR = ressonância magnética nuclear; 1D = unidimensional; HSQC = correlação quântica única heteronuclear; ppm = partes por milhão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: 1H R1ρ RD resultados representativos para duas construções diferentes baseadas em um grampo de cabelo RNA. (A) A coluna esquerda mostra os resultados obtidos no RNA com um par de base C-G acima do U abaulado, enquanto a coluna direita mostra os resultados obtidos em uma amostra onde o par base foi trocado para G-C em vez disso. (B) e (F) apresentam perfis de dispersão plana obtidos para A4H8 para as duas construções, indicando nenhuma troca conformacional. (C–E) mostrar sobre ressonância, off-resonance e dados instalados obtidos para G6 na construção (G-C). O fit laguerre leva ao seguinte resultado: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) mostram sobre ressonância, off-resonance, e dados instalados obtidos para G6 na construção (G-C). O fit de Laguerre leva ao seguinte resultado: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43.502 ± 38.478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Este número foi modificado a partir de 20. Abreviação: SL = trava de giro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

K.P. é consultor da Arrakis Therapeutics, uma empresa que descobre pequenas moléculas voltadas para o RNA.