Identificação de RNAs envolvidos na interação direta RNA-RNA com um RNA longo não codificante

Resumo

Um protocolo pull-down de RNA fácil de usar é projetado para a identificação de RNAs envolvidos na interação direta RNA/RNA com um RNA longo não codificante. O protocolo usa psoraleno como fixador para reticular apenas interações RNA/RNA e fornece todo o interactoma direto de RNA de um RNA longo não codificante quando acoplado ao sequenciamento de RNA.

Resumo

O papel crescente atribuído hoje em dia aos RNAs longos não codificantes (lncRNA) na fisiologia e fisiopatologia torna crucial caracterizar seu interactoma identificando seus parceiros moleculares, DNA, proteínas e/ou RNAs. Estes últimos podem interagir com lncRNA por meio de redes envolvendo proteínas, mas também podem estar envolvidos em interações diretas de RNA/RNA. Portanto, desenvolvemos um procedimento de retirada de RNA fácil de usar que permitiu a identificação de RNAs envolvidos na interação direta de RNA / RNA com um lncRNA usando psoraleno, uma molécula que reticula apenas interações de RNA / RNA. A modelagem bioinformática da estrutura secundária do lncRNA permitiu a seleção de várias sondas de oligonucleotídeos de DNA antisense específicas com forte afinidade por regiões que exibem baixa probabilidade de emparelhamento interno de bases. Uma vez que as sondas específicas que foram projetadas visavam regiões acessíveis em todo o comprimento do lncRNA, as zonas de interação do RNA poderiam ser delineadas na sequência do lncRNA. Quando acoplado a um sequenciamento de RNA de alto rendimento, este protocolo pode ser usado para todos os estudos diretos de interactoma de RNA de um lncRNA de interesse.

Introdução

RNAs longos não codificantes (lncRNAs) são transcritos não codificantes de proteínas com mais de 200 nucleotídeos de comprimento. Seu número está sempre aumentando, mais de 58.000 em humanos. Além disso, seu papel crucial na fisiologia e fisiopatologia torna essencial caracterizar seus parceiros moleculares que lhes permitam implementar suas funções regulatórias. Na verdade, uma abordagem para entender as funções dos lncRNAs é a detecção dos parceiros moleculares que interagem de cada lncRNA.

Os alvos moleculares dos lncRNAs podem ser DNA, proteínas ou RNAs, e várias técnicas foram desenvolvidas para identificá-los. Nesse sentido, a identificação de proteínas que interagem com lncRNAs é o objetivo de vários protocolos, incluindo diferentes procedimentos de imunoprecipitação de RNA (RIP) nos quais um anticorpo contra a proteína de interesse é usado para puxar especificamente os lncRNAs (para uma revisão¹). Outras técnicas, como a Análise de Hibridização de Captura de Alvos de RNA² (CHART) ou o Isolamento da Cromatina por Purificação de RNA³ (ChIRP), permitem puxar para baixo os lncRNAs junto com os complexos proteicos associados. Nessas últimas técnicas, o lncRNA é usado como isca. CHART e ChIRP também são técnicas poderosas para identificar mapas genômicos que mostram a ocupação do lncRNA ^2,3. Além disso, esses métodos de retirada de RNA tornam possível identificar os parceiros de RNA de um lncRNA. Um procedimento que permite a captura de RNAs direcionados por um lncRNA foi descrito. As sondas de oligonucleotídeos biotinilados de DNA antisense são projetadas contra regiões de baixa probabilidade de emparelhamento de bases internas, conforme determinado pela modelagem de bioinformática da estrutura secundária do lncRNA⁴. No entanto, este procedimento não discrimina se os parceiros de RNA interagem indiretamente por meio de uma rede de proteínas ou diretamente por meio de interações diretas de RNA/RNA com o lncRNA. Foi demonstrado que a reticulação com derivados de psoraleno é o método de escolha para selecionar interações diretas de RNA / RNA mediadas pelo emparelhamento de bases⁵. Os derivados do psoraleno são de fato capazes de se intercalar em DNA ou RNA de fita dupla e ligar covalentemente as pirimidinas após a irradiação com luz UV (365 nm) ⁶ . O acoplamento do pull-down de RNA usando sondas de oligonucleotídeos biotinilados com a reticulação com psoraleno é um procedimento fácil de usar proposto aqui para a identificação dos RNAs envolvidos em interações diretas de RNA/RNA com um lncRNA. Além disso, este procedimento pode permitir delinear as zonas de interação de RNA na sequência do lncRNA se diferentes sondas de oligonucleotídeos projetadas ao longo do comprimento do lncRNA forem usadas.

Protocolo

1. Projeto da sonda

1. Gere a estrutura secundária do lncRNA usando um software de servidor web gratuito especializado: software RNAstructure⁷ ou Vienna RNA web suite⁸. Selecione regiões que exibem uma baixa probabilidade de emparelhamento de bases internas e projete sondas de oligonucleotídeos antisense de 25 bases de comprimento para diferentes regiões deste lncRNA.
2. Confira todos os oligonucleotídeos projetados com o software acadêmico gratuito AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr), a fim de obter diferentes informações sobre essas sondas e escolher aquelas com os melhores parâmetros.
   NOTA: Verifique os parâmetros ideais no software da seguinte forma. Porcentagem de GC: entre 40 e 60%, estabilidade de 3 ', complexidade, dímero auto-terminado: "bom". A temperatura de fusão (T_M) não é importante porque a afinidade é realizada à temperatura ambiente.
3. Usando uma ferramenta de pesquisa de alinhamento (ou seja, Blast, etc.), certifique-se de que as sondas de oligonucleotídeos antisense selecionadas não reconheçam sequências de nucleotídeos em nenhum outro RNA expresso nas células de escolha.
   1. Projete uma sonda de oligonucleotídeo de DNA não específica de 25 bases de comprimento. Certifique-se de que esta sonda não mostre afinidade pelo lncRNA de interesse nem por qualquer outra sequência de RNA no genoma de interesse.
4. Encomende todas as sondas com uma modificação de biotina adicionada à sua extremidade 3 'junto com um espaçador de trietilenoglicerol (TEG). Este espaçador aumenta a distância da oligobiotina para evitar impedimentos estéricos.
   NOTA: Para obter um resultado ideal e avaliar a especificidade dos resultados do pull-down, projete um mínimo de duas sondas de oligonucleotídeos antisense diferentes na mesma região e, em seguida, compare sua eficiência experimentalmente.

2. Reticulação

1. Cultive células (por exemplo, células GH4C1 usadas neste experimento) até a confluência em placas de cultura de^{células de 78,5 cm 2} . Depois de remover o meio de cultura celular, enxágue a camada celular com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato frio enriquecida com Ca²⁺ e Mg²⁺ (PBS⁺) e adicione 3 mL de solução de molécula derivada de psoraleno (cloridrato de 4′Aminometiltrioxsaleno) preparada em PBS⁺ na concentração de 0,1 mg/mL.
2. Colocar a placa de cultura durante 30 minutos numa incubadora de cultura de células de mamíferos a 37 °C com 5% de CO₂. Após 30 min, retire a tampa, coloque as placas de cultura no gelo a 2,5 cm de distância de tubos UV de 365 nm em um reticulador UV por 10 min. Agite delicadamente a loiça e restaure a exposição aos raios UV durante um período adicional de 10 minutos.
3. Descarte o meio por aspiração, adicione 1 mL de PBS⁺ para coletar as células com um raspador de células e transfira para um microtubo. Centrifugue a 4 °C, 400 x g durante 5 min. Remova o máximo de sobrenadante possível e armazene pellets a -80 °C.

3. Lise celular

1. Prepare o tampão da proteinase K adicionando 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM de EDTA, 0,5% de SDS e 5 μL / mL de inibidor de RNase.
2. Ressuspenda os grânulos celulares neste tampão (aproximadamente 200 μL por 1 x 10⁷ células). Adicione a proteinase K a uma concentração final de 0,1 μg/μL e incube por 45 min a 50 °C. Em seguida, incubar por 10 min a 95 °C, para inativar a proteinase K.

4. Sonicação

1. Distribua 100 μL deste lisado (correspondendo a 5,10⁶ células) em dois microtubos e adicione 200 μL de tampão de hibridização (700 mM NaCl, 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 1,25% SDS, 5 μL / mL de solução inibidora de RNase e 15% de formamida) em cada tubo.
2. Coloque os tubos no banho-maria a 4 °C de um sonicador e inicie a sonicação com 2 séries de pulsos de 30 s (alta intensidade) separados por 30 s desligados.
3. Colete 20 μL de amostras para servir como amostras de controle de entrada e armazene a -80 °C.
   NOTA: Este procedimento de sonicação foi previamente otimizado para a linhagem GH4C1, a fim de obter fragmentos de RNA variando em 2.000 nucleotídeos⁹. Para outras linhagens celulares, o procedimento de sonicação deve ser otimizado. Quando esta técnica é realizada para estudar os RNA parceiros de um RNA não codificante muito longo, a etapa de sonicação mostra-se indispensável para obter uma recuperação adequada do lncRNA. Nesse caso, é, portanto, necessário projetar várias sondas com um sítio de ligação localizado a cada 4.000 nucleotídeos no máximo ao longo do comprimento do lncRNA. Para recuperar todo o comprimento do lncRNA, use um conjunto de várias sondas específicas. No entanto, se o objetivo for identificar as regiões do lncRNA envolvidas na ligação RNA-RNA, as sondas específicas devem ser usadas separadamente. Além disso, se estudar parceiros de RNA de um lncRNA menor, experimentos devem ser realizados para determinar se a etapa de sonicação é necessária.

5. Puxar para baixo o RNA

1. Dia 1 - Etapa de hibridização
   1. Adicionar 150 pmol (1,5 μL de uma solução-mãe de 100 μM) de uma sonda biotinilada específica ou não específica a cada tubo de amostra. Incubar durante 4 h sob agitação num rotador de tubos à temperatura ambiente (RT) (aproximadamente 30 rpm).
   2. Pegue o volume necessário de esferas magnéticas (ou seja, 40 μL de esferas por 150 pmol de reação de hibridização de sondas). Use o suporte magnético para separar as contas da mídia comercial. Rejeitar o sobrenadante e lavar os grânulos com 900 μL do tampão de hibridização. Uma vez feito isso, ressuspendeu as esferas magnéticas no mesmo volume do tampão de hibridização.
   3. Adicione esferas magnéticas em cada tubo de amostra (40 μL de esferas por 150 pmol de reação de hibridização de sondas). Incubar durante a noite sob agitação em um rotador de tubo em RT (aproximadamente 30 rpm).
2. Dia 2 - Etapa de isolamento de RNA
   1. Separe os grânulos do lisado celular usando o suporte magnético (2-3 min). Descarte o sobrenadante e lave os grânulos com 900 μL do tampão de lavagem (0,5% SDS, 2x SSC) com 5 min de incubação sob agitação no rotador em RT. Repita esta lavagem 5 vezes.
   2. Depois de remover a última lavagem, adicione 95 μL de tampão Proteinase K nos grânulos. Descongele as amostras de entrada e adicione 75 μL de tampão Proteinase K. Adicionar 5 μL de proteinase K a uma concentração final de 1 μg/μL em todos os tubos (amostras e amostras de entrada). Incubar a 45 °C durante 45 min e depois a 95 °C durante 10 min.
   3. Mantenha a amostra no gelo. Use suporte magnético para separar grânulos de RNAs presentes no sobrenadante. Purifique os RNAs com um kit de purificação de RNA que inclui uma etapa de digestão da DNase. Armazenar RNAs purificados a -80 °C.
      NOTA: O RNA eluído pode ser submetido a RT-qPCR ou sequenciamento de RNA de alto rendimento para detectar transcritos enriquecidos. Para análise de sequenciamento de RNA, as leituras podem ser alinhadas ao genoma de interesse usando software livre, como STAR¹⁰ ou HISAT2¹¹, e a quantificação pode ser feita usando FeatureCounts¹² ou HTSeq count¹³.

Resultados

A elucidação do interactoma de lncRNA, ou seja, os componentes celulares que interagem com lncRNAs, proteínas, RNA e DNA, é de fundamental importância para a compreensão das funções dos lncRNAs. Várias técnicas foram desenvolvidas para caracterizar o interactoma lncRNA, incluindo RIP, CHART, ChIRP e RNA pull-down. Embora este último tenha se mostrado poderoso na identificação de alvos de RNA de lncRNAs, esses procedimentos não indicam se os parceiros de RNA interagem indiretamente por meio de uma rede de proteínas ou dir...

Discussão

Numerosos lncRNAs desempenham sua função por meio do emparelhamento de bases complementares com mRNAs. É, portanto, importante desenvolver procedimentos que permitam caracterizar o interactoma direto de RNA dos lncRNAs. Portanto, foi desenvolvido um procedimento que combina o uso de psoraleno como reagente de reticulação com a técnica de pull-down de RNA.

No protocolo pull-down de RNA descrito, o projeto e a seleção das sondas de oligonucleotídeos biotinilados...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4′-Aminomethyltrioxsalen	Sigma	A4330	Crosslinker reagent
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Sondas biotinilatadas	IDT		Sondas de oligonucleotídeos
CFX96 Real Time System	BioRad	4351107	qPCR aparelho
DNA Olignucleotídeos	IDT		Primers para qPCR
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Grânulos magnéticos de estreptavidina
Formamida	Thermo-Fisher	15515-026	Formamida
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	qPCR reagente
Proteinase K	Sigma	P2308	Proteinase K
RNA para DNA	Thermo-Fisher	4387405	Kit de transcrição reversa
Kit de purificação de RNA XS	Macherey-Nagel	740902	Kit de purificação
RNA RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	Rotador de tubo inibidor de RNAse
	Stuart	SB2	Eppendorf rotador de tubo
UV Stratalinker 1800	Stratagene	# 400072	Reticulador UV

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