Artigo de método

Co-cultura de microglia e neurônios corticais diferenciados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

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DOI:

10.3791/62480

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21 de setembro de 2021

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Chemical Biology Program, Broad Institute of MIT & Harvard, 3Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 4Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, 5Program in Neuroscience, Harvard University, 6Program in Chemical Biology, Harvard University, 7Harvard Stem Cell Institute

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma metodologia para diferenciar microglia de iPSCs humanas e mantê-las em co-cultura com neurônios corticais derivados de iPSC, a fim de estudar os fundamentos mecanicistas das interações neuroimunes usando neurônios humanos e microglia.

Resumo

A capacidade de gerar microglia a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) fornece novas ferramentas e caminhos para investigar o papel da microglia na saúde e na doença. Além disso, a microglia derivada de iPSC pode ser mantida em co-cultura com neurônios corticais derivados de iPSC, o que permite investigações de interações microglia-neurônio que se supõe serem desreguladas em vários distúrbios neuropsiquiátricos. As iPSCs humanas foram diferenciadas para gerar microglia usando uma versão adaptada de um protocolo desenvolvido pelo grupo de Fossati, e as microglia derivadas de iPSC foram validadas com análise de marcadores e PCR em tempo real. A microglia humana gerada usando este protocolo foi positiva para os marcadores CD11C, IBA1, P2RY12 e TMEM119, e expressou os genes relacionados à microglia AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 e TMEM119. Neurônios corticais humanos derivados de iPSC que foram diferenciados por 30 dias foram plaqueados com microglia e mantidos em co-cultura até o dia 60, quando os experimentos foram realizados. A densidade de espinhas dendríticas em neurônios corticais em co-cultura com microglia foi quantificada em condições basais e na presença de citocinas pró-inflamatórias. A fim de examinar como a microglia modula a função neuronal, experimentos de imagem de cálcio dos neurônios corticais foram realizados usando o indicador de cálcio Fluo-4 AM. A atividade de cálcio vivo dos neurônios corticais foi obtida usando um microscópio confocal e a intensidade de fluorescência foi quantificada usando ImageJ. Este relatório descreve como a co-cultura de microglia derivada de iPSC humana e neurônios corticais fornece novas abordagens para interrogar os efeitos da microglia nos neurônios corticais.

Introdução

No cérebro humano, a microglia é a principal célula imune inata1. O desenvolvimento cerebral é regulado pela microglia por duas vias: liberação de fatores difusíveis e fagocitose1. Fatores difusíveis derivados da microglia ajudam a apoiar a mielinização, neurogênese, formação sináptica, maturação, morte celular e sobrevivência celular1. A microglia também fagocita vários elementos nas sinapses cerebrais, axônios e em células vivas e mortas 2,3,4,5,6,7,8. Os receptores na microglia reconhecem marcadores como calreticulina, ATP e ácido siálico e regulam a fagocitose celular 9,10. No hipocampo, a microglia mantém a homeostase da neurogênese por meio de seu papel fagocítico11.

A fagocitose sináptica no núcleo geniculado dorsolateral (dLGN) do cérebro do roedor demonstrou ser regulada pela microglia1. Em roedores, foi demonstrado que existem dois períodos durante o desenvolvimento em que é observada intensa fagocitose sináptica microglial. O primeiro período ocorre durante a formação inicial da sinapse e o segundo período ocorre quando as conexões estão sendo ajustadas e podadas12. Outros fatores envolvidos na poda sináptica são proteínas inflamatórias e o complexo principal de histocompatibilidade de Classe I (MHC1, H2-Kb e Db)13,14. Foi sugerido que C1q (componente do complemento 1q) na microglia colocaliza com MHC1, o que desencadeia a poda sináptica15. Além disso, estudos em camundongos mostram que a interleucina-33 (IL-33) secretada pelos astrócitos regula a homeostase das sinapses no tálamo e na medula espinhal por meio de seus efeitos na microglia, embora isso ainda não tenha sido investigadoem humanos. A microglia secreta uma variedade de citocinas que ajudam a manter a saúde neuronal, como o fator de necrose tumoral α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 e interferon-γ (IFN-γ) e essas citocinas podem modular a espinha dendrítica e a formação de sinapses 16,17,18. Existem lacunas significativas em nosso conhecimento das interações neurônio-microglia durante o desenvolvimento do cérebro humano. A maior parte do nosso conhecimento vem de estudos de modelos de roedores, enquanto há uma escassez de informações sobre os aspectos temporais e mecanicistas da poda sináptica no córtex humano. A microglia suporta a sobrevivência neuronal no neocórtex, e outros tipos de células também contribuem1. Não está claro como a microglia contribui para essa preservação e qual é a interação entre a microglia e os outros tipos de células. A microglia libera várias citocinas que afetam o desenvolvimento neuronal e sináptico, mas a base mecanicista de seus efeitos dessas citocinas nos neurônios é amplamente desconhecida19,20. Para desenvolver uma compreensão mais completa da função da microglia no cérebro humano, é fundamental explorar suas interações com diferentes tipos de células encontradas no cérebro humano. Este relatório descreve um método para co-cultura de neurônios e microglia derivados de iPSC humanos gerados a partir do mesmo indivíduo. O estabelecimento dessa metodologia permitirá investigações bem definidas para interrogar a natureza das interações microglia-neuronais e desenvolver modelos celulares in vitro robustos para estudar a disfunção neuroimune no contexto de diferentes distúrbios do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricos.

O papel da microglia na esquizofrenia
A poda sináptica é um importante processo de neurodesenvolvimento que ocorre no cérebro do adolescente21,22. Várias linhas de evidência sugerem que a poda sináptica durante esse período crítico é anormal na esquizofrenia (SCZ) 23 , 24 , 25 , 26 . A SCZ é um transtorno psiquiátrico crônico e debilitante caracterizado por alucinações, delírios, processos de pensamento desordenados e déficits cognitivos23,24. A microglia, os macrófagos residentes no cérebro, desempenham um papel central na poda sináptica25,26. Estudos post-mortem e de tomografia por emissão de pósitrons (PET) mostram evidências de atividade microglial disfuncional na SCZ 25,26,27,28,29,30,31,32. Os cérebros SCZ post-mortem mostram diferenças bem replicadas, mas sutis, no cérebro - os neurônios piramidais na camada cortical III mostram diminuição da densidade da coluna dendrítica e menos sinapses 33,34,35. A poda sináptica é um processo pelo qual conexões sinápticas excitatórias supérfluas são eliminadas pela microglia durante a adolescência, quando os pacientes com SCZ geralmente têm seu primeiro surto psicótico22,36. Estudos post-mortem mostram uma associação entre SCZ e ativação microglial, com aumento da densidade de microglia em cérebros SCZ, bem como aumento da expressão de genes pró-inflamatórios27. Além disso, estudos de PET de cérebros humanos usando radioligantes para ativação microglial mostram níveis aumentados de microglia ativada no córtex 25,26,27,28. Estudos recentes de associação genômica ampla (GWAS) mostram que a associação genética mais forte para SCZ reside no locus do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), e essa associação resulta de alelos dos genes do componente do complemento 4 (C4) que estão envolvidos na mediação da poda sináptica pós-natal em roedores37. Essa associação forneceu suporte adicional para a hipótese de que a poda aberrante por microglia pode resultar na diminuição da densidade da coluna dendrítica observada em cérebros post-mortem da SCZ. As investigações do envolvimento microglial na poda sináptica na SCZ até agora foram limitadas a estudos indiretos com imagens PET ou inferências de investigações de cérebros post-mortem.

Gerando microglia humana em laboratório
A micróglia primária de camundongo cultivada tem sido freqüentemente usada no estudo da micróglia, embora haja várias indicações de que a micróglia de roedores pode não ser representativa da anatomia microglial humana e da expressão gênica (Tabela 1) 38 . Vários estudos também diferenciaram a microglia diretamente dos monócitos sanguíneos por meio da transdiferenciação 39,40,41,42. As células semelhantes à micróglia derivadas de monócitos sanguíneos exibem grandes diferenças da micróglia humana nas respostas pró-inflamatórias do perfil de expressão gênica e proteica, e parecem ser mais semelhantes a macrófagos em sua biologia43. Avanços metodológicos recentes agora permitem a geração de micróglias a partir de iPSCs humanas, que oferecem oportunidades para estudar micróglias vivas que se assemelham com mais precisão à biologia da micróglia encontrada no cérebro humano (Tabela 2). Essas células microgliais derivadas de iPSC demonstraram recapitular o fenótipo, os perfis de expressão gênica e as propriedades funcionais da microglia humana primária 44,45,46,47,48. Este artigo fornece um método para co-cultura de neurônios derivados de iPSC humanos e microglia gerados a partir do mesmo indivíduo, a fim de desenvolver modelos in vitro personalizados de interações neurônio-microglia. Para este modelo de co-cultura in vitro, um protocolo de diferenciação microglial do grupo Fossati foi adaptado (Tabela 3) e combinado com uma versão adaptada de um protocolo de geração neuronal cortical do grupo Livesey (Tabela 4)49,50.

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Protocolo

As iPSCs humanas usadas neste estudo foram reprogramadas a partir de fibroblastos que foram obtidos por meio do consentimento informado de indivíduos de controle saudáveis, com aprovação do conselho de revisão institucional (IRB). A reprogramação e caracterização das iPSCs utilizadas neste estudo (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) foram descritas em um estudo anterior51.

1. Manutenção de iPSCs

  1. Preparar uma diluição de 1:50 da matriz da membrana basal do factor de crescimento reduzido isento de LDDEV em DMEM/F12 sem vermelho de fenol e pré-revestir uma placa de 6 poços com 1 ml da solução diluída durante, pelo menos, 2 h a 37 °C antes de descongelar as células.
  2. Descongele os estoques de iPSC criopreservados em banho-maria a 37 °C por 2 min. Adicione as células a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5 mL de DMEM/F12. Gire as células para baixo a 300 x g por 5 min.
  3. Remova a solução de revestimento da placa de matriz da membrana basal pré-revestida sem fator de crescimento reduzido sem LDEV e adicione 1 mL de meio de células-tronco (SCM) com inibidor de rocha de 10 μM (Y-27632).
  4. Ressuspenda o pellet celular em SCM com 10 μM de Y-27632 e adicione à placa pré-revestida para um volume final de 2 mL de SCM mais Y-27632. Manter as culturas de células iPSC neste meio durante 24 h numa incubadora a 37 °C.
  5. Substitua o meio por 2 mL de SCM fresco sem Y-27632 24 h após o descongelamento.
  6. Depois que as iPSCs atingirem 80-90% de confluência, passe-as para frascos de 75 mL revestidos com matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido livre de LDEV.
    1. Passe as células enxaguando primeiro as células com HBSS e remova depois de deixar descansar por 30 s. Adicione 1 ml de reagente de dissociação celular não enzimática e incube durante 4 min a 37 °C. Prepare a placa com SCM contendo 10 μM Y-27632.
    2. Aspire o reagente de dissociação celular não enzimática e adicione 1 mL de SCM + 10 μM Y-27632 a cada poço. Raspe suavemente o poço com um elevador de células e obtenha células com uma pipeta de 1000 μL.
    3. Deposite as células em um frasco de 75 mm revestido com matriz de fator de crescimento reduzido sem LDEV em um volume total de 8 mL de SCM + Y-27632.

2. Diferenciação da microglia

NOTA: Um esquema descrevendo o protocolo de diferenciação da microglia é representado na Figura 1A. Os meios foram aquecidos à temperatura ambiente antes do uso.

  1. Dia 0: Realize uma troca completa do meio com meio SCM suplementado com 80 ng/mL BMP-4. Realize trocas diárias de meio com este mesmo meio durante os dias 1-3, sem qualquer lavagem entre as trocas de meio.
  2. Dia 4: Prepare o dia 4-5 médio: Meio hematopoiético (HM), suplementado com 25 ng/mL de FGF, 100 ng/mL de SCF e 80 ng/mL de VEGF. Remova o meio e substitua por um meio de dia 4-5 contendo 5 μM Y-27632.
    NOTA: As células começam a flutuar neste ponto - cerca de metade das células estão flutuando e metade está aderida.
  3. Dia 6: Prepare o meio do dia 6-13: HM suplementado com 50 ng/mL SCF, 50 ng/mL IL-3, 5 ng/mL TPO, 50 ng/mL m-CSF e 50 ng/mL Flt3-L. Colete o sobrenadante, adicione a um tubo cônico de 15 mL e gire para baixo por 8 min a 300 x g. Ressuspenda o pellet em um frasco com 8 mL de meio do Dia 6-13 suplementado com 5 μM de Y-27632.
  4. Dia 10: Adicione 8 mL de meio do dia 6-13 em cima do meio existente.
  5. Dia 14: Preparar Dia 14+ médio: HM suplementado com 50 ng/mL m-CSF, 50 ng/mL Flt3-L, 50 ng/mL GM-CSF. Colete o sobrenadante, adicione a um tubo cônico de 50 mL e gire para baixo por 8 min a 300 x g. Ressuspenda o pellet em 8 ml de meio Dia 14+ contendo 5 μM de Y-27632 e continue a cultivar neste meio.
  6. Dia 18: Adicione 8 mL de meio Day14+.
  7. Dia 22: Adicione 8 mL de meio fresco Day14+ sem remover o meio existente.
  8. Dia 25: Mova as células para a etapa 2.9 ou continue a manter no meio Dia 14+ até o dia 50 de diferenciação.
  9. Após o dia 25, colete o sobrenadante em um tubo cônico de 50 mL e gire para baixo por 8 min a 300 x g.
    1. Prepare o meio aderente: RPMI suplementado com 1% de 200 mM de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina em solução de NaCl a 0,85%, 25 ng/mL GM-SCF e 100 ng/mL IL-34.
    2. Ressuspenda o pellet no meio aderente contendo 5 μM Y-27632.
    3. Células de placa com densidade de 50.000 células por cm2 em placas de 24 poços para diferentes experimentos: placas revestidas com matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido sem LDEV para monocultura microglial, 10 μg/mL de poli-L-ornitina e 10 μg/mL de placas de imagem de vidro revestidas com laminina para experimentos de imagem.
    4. Diluir a poli-L-ornitina e a laminina em DPBS e adicionar 250 μL/poço para uma placa de imagem de 24 poços.
      NOTA: As células em cultura agora são de natureza aderente (Figura 1C).
  10. Mantenha as células em cultura por pelo menos 14 dias, com trocas de meio quinzenais. Após o 14º dia pós-adesão, as células atingiram a maturação e podem ser usadas para experimentos.

3. Diferenciação de neurônios corticais

NOTA: Um esquema descrevendo o protocolo de diferenciação de neurônios corticais é representado na Figura 1G.

  1. Dia 0:
    1. Uma vez que as iPSCs sejam confluentes em placas revestidas com matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido livre de LDEV, mude de SCM para uma mistura 50/50 de meio N2 / B27 suplementado com 10 μM SB431542, 1 μM de dorsomorfina, 100 nM LDN193189.
      NOTA: O meio N2 consiste em meio basal suplementado com suplemento de N-2 a 1%, dipeptídeo L-alanil-L-glutamina a 1% a 200 mM em solução de NaCl a 0,85%, caneta / estreptococo a 1%. O meio B27 consiste em DMEM/F12 suplementado com 2% de suplemento de B-27, dipeptídeo de L-alanil-L-glutamina a 1% 200 mM em solução de NaCl a 0,85%, caneta/estreptococo a 1%.
    2. Troque o meio com os suplementos acima adicionados diariamente por 7 dias.
  2. Dia 7:
    1. Pré-revestir placas em matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido sem LDEV por pelo menos 2 h.
    2. Células de passagem 1:1 em placas pré-revestidas. Enxágue as células com 1 mL / poço HBSS e remova depois de deixá-lo descansar por 30 s. Adicione 1 mL / poço de meio de descolamento celular (por exemplo, Accutase) e incube por 4-5 min a 37 ° C. Durante a incubação, prepare tubos cônicos de 15 mL com 5 mL de DMEM.
    3. Pipete suavemente o agente de dissociação enzimática para remover as células da placa com um pipetador P1000. Colete o agente de dissociação enzimática e a mistura de células no tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de DMEM.
    4. Centrifugue os tubos por 5 min a 300 x g. Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio N2/B27 contendo 10 μM de Y-27632. Continue as mamadas diárias com meio N2/B27 sem suplementos.
  3. Dia 12: Células de passagem 1:1 usando os métodos descritos em 3.2.2. Continue as mamadas diárias com meio N2/B27.
  4. Dia 15/16: Células de passagem 1:2 usando os métodos descritos em 3.2.2. Continue as mamadas diárias com meio N2/B27.
  5. Dia 18/19: Células de passagem 1:3 usando os métodos descritos em 3.2.2. Continue as mamadas diárias com meio N2/B27 até o dia 25.
  6. Dia 25: Alimentar as células com meio N2/B27 suplementado com 10 μM de DAPT.
  7. Dia 28: Alimente as células com meio N2/B27 fresco e não tratado.
  8. Dia 30: Passagem de células usando os métodos descritos em 3.2 para as placas de cultura da microglia e manutenção em meio BrainPhys suplementado com 1% de suplemento de B-27.

4. Co-culturas de microglia / neurônio

  1. Placa Dia 30 neurônios corticais em cima de culturas microgliais a uma densidade de 50.000 células por cm2. Suplemente o meio com laminina 1 μg/mL para melhorar a adesão celular.
  2. Mantenha as culturas em uma mistura de 50% de meio aderente e 50% de meio Brainohys suplementado com 1% de suplemento B-27. Realize a mudança de meio a meio quinzenalmente até a experimentação.
  3. Realize experimentos depois que os neurônios atingirem o dia 60.

5. Tratamento com interferon-γ

  1. Prepare meio fresco suplementado com 100 ng/mL de IFN-γ. Adicione o meio e deixe incubar por 24 h. Remova o meio e prossiga para a experimentação.

6. Imunocitoquímica

  1. Fixe as células na placa de cultura com 100 μL de paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 20 min.
  2. Enxágue as células em 1 mL de PBS três vezes por 5 minutos cada.
  3. Adicione 1 mL de PBST (PBS + 0,1% Triton X) por 10 min.
  4. Adicione tampão de bloqueio: 1 mL de PBS mais 5% de soro de cabra por 1 h.
  5. Adicionar o anticorpo primário diluído em 100 μL de PBS + 1% de soro de cabra - durante a noite a 4 °C. Otimize todos os anticorpos primários de acordo.
  6. Enxágue as células em 1 mL de PBS três vezes por 5 minutos cada.
  7. Adicione anticorpo secundário, diluído em 100 μL de PBS mais 1% de soro de cabra - por 1 h em temperatura ambiente.

7. Análise da coluna vertebral

  1. Obtenha imagens em um microscópio confocal com ampliação de 60x.
  2. Use a função ImageJ NeuronJ52 para analisar imagens.
  3. Obtenha medições de comprimento de neuritos, comprimento da coluna vertebral e contagem de espinha por meio do NeuronJ.

8. Imagem de cálcio

  1. Prepare o meio fresco com 3 μM de corante Fluo-4AM. Incubar coculturas neste meio durante 30 min a 37 °C. Em seguida, enxágue as células com PBS, adicione solução de imagem de células vivas às células e prossiga para a imagem.
  2. Usando um microscópio confocal equipado para imagens de células vivas, obtenha imagens de lapso de tempo a 40x por 2 min. A atividade pode ser registrada no início do estudo, com exposição a 15 mM de glutamato, ou no cenário de despolarização com cloreto de potássio 5 mM.
  3. Usando o ImageJ, meça a intensidade da fluorescência ao longo do tempo para corpos celulares individuais. Usando a ferramenta de seleção, selecione a região de interesse (ROI) individual ao redor de cada corpo celular. Abra o ROI Manager e pressione Adicionar para selecionar. Continue a adicionar novas seleções ao gerenciador de ROI.
  4. Use a ferramenta Definir medidas para medir a área cinza média. Quando o número de corpos de células desejados tiver sido adicionado ao gerenciador de ROI, selecione todos eles e use a ferramenta Multi-Measure . Isso fornecerá uma leitura da área cinza média para cada um ao longo do tempo do arquivo de vídeo. Os dados exportados fornecerão a intensidade média de fluorescência para a região de interesse para cada quadro.
  5. Determine a razão de intensidade de fluorescência, F / F0, onde F é a intensidade de fluorescência em um determinado momento e F0 é a intensidade de fluorescência inicial. F / F0 pode ser representado graficamente ao longo do tempo para examinar a atividade espontânea nos neurônios ou examinado na intensidade fluorescente máxima no cenário de estimulação.

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Resultados

Validação de protocolo
A microglia derivada de iPSC foi gerada a partir de sete linhas de iPSC em três rodadas diferentes de diferenciação. Foram utilizadas as linhas de controle iPSC ML27, ML56, ML292 e ML364 e as linhas de esquizofrenia iPSC ML40, ML141 e ML250. A caracterização dessas linhagens de iPSC foi descrita anteriormente51. Essas microglias derivadas de iPSC foram validadas usando ICC e qPCR. A microglia gerada a partir do protocolo adaptado exibiu morfologia microgl...

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Discussão

O desenvolvimento de métodos de diferenciação ao longo de diferentes trajetórias para células-tronco pluripotentes abriu muitos caminhos para a investigação da função cerebral e processos de doenças 53,54,55. Os estudos iniciais se concentraram no desenvolvimento de tipos específicos de células neuronais que se acredita serem importantes em distúrbios cerebrais específicos

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por um Prêmio de Pesquisa Biocomportamental do Instituto Nacional de Saúde Mental para Novos Cientistas Inovadores (BRAINS) R01MH113858 (para RK), Prêmio de Desenvolvimento de Cientistas Clínicos do Instituto Nacional de Saúde Mental K08MH086846 (para RK), o Prêmio de Desenvolvimento de Cientistas Clínicos da Doris Duke Charitable Foundation (para RK), a Fundação Bipolar Ryan Licht Sang (para RK), a Fundação da Família Jeanne Marie Lee-Osterhaus e o Prêmio Jovem Investigador NARSAD da Fundação de Pesquisa do Cérebro e Comportamento (para A.K.), a Fundação Phyllis & Jerome Lyle Rappaport (para R.K.), o Instituto de Células-Tronco de Harvard (para R.K.) e por Steve Willis e Elissa Freud (para R.K.). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Bruce M. Cohen e à Dra. Donna McPhie, da Harvard Medical School e do McLean Hospital, por nos fornecerem os fibroblastos usados no estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 suplementoGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C anticorpoBiolegend337207Diluição 1:200
Placas de cultura de células de fundo plano CostarCorning07-200-83
Anticorpo monoclonalAbcamab18465
CUTL1AbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, sem vermelho de fenolGibco21041025
dorsomorfinaSigma-AldrichP5499
DPBS, sem cálcio, sem magnésioGibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Frascos de Cultura de CélulasNunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigantePeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 MLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Cabra Anti Frango- IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Diluição 1: 1000
Cabra Anti mouse - IgG H & L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Diluição 1:1000
Cabra Anti Rat- IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Diluição 1:1000
Cabra Anti-cobaia IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Diluição 1: 1000
Soro de cabraSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
anticorpo IBA1Abcamab5076Diluição 1: 500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart Primers verdes SYBRSigma-AldrichKSPQ12012
LamininaSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
Solução de imagem de células vivasInvitrogenA14291DJ
MAP2Synaptic Systems188 004
M-CSFPeprotech300-25
Suplemento N-2Gibco17502001
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
P2RY12 anticorpoBiolegend848002
Paraformaldeído 16%Fisher Scientific50-980-488
Penicilina-estreptomicinaGibco15140122
Poly-L-OrthinineSigma-AldrichP3655
SATB2 anticorpoAbcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate Placa de Fundo de Vidro de 24 PoçosGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 anticorpoAbcamab185333Diluição 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 dicloridrato (inibidor de ROCK)Tocris1254

Referências

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