Artigo de método

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

DOI:

10.3791/62486

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5 de junho de 2021

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1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Neste artigo

Resumo

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O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Resumo

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À medida que a pandemia COVID-19 causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) continua a evoluir, tornou-se evidente que a presença de anticorpos neutralizantes contra o vírus pode fornecer proteção contra infecções futuras. Assim, à medida que a criação e tradução de vacinas eficazes COVID-19 continua em uma velocidade sem precedentes, o desenvolvimento de métodos rápidos e eficazes para medir anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2 se tornará cada vez mais importante para determinar a proteção a longo prazo contra infecções para indivíduos previamente infectados e imunizados. Este artigo descreve um protocolo de alto rendimento usando o vírus da estomatite vesicular (VSV) pseudotipado com a proteína de pico SARS-CoV-2 para medir a presença de anticorpos neutralizantes em soro convalescente de pacientes que se recuperaram recentemente do COVID-19. O uso de um vírus pseudotipado replicante elimina a necessidade de uma instalação de nível 3 de contenção necessária para o manuseio sars-cov-2, tornando este protocolo acessível a praticamente qualquer laboratório nível de contenção 2. O uso de um formato de 96 poços permite que muitas amostras sejam executadas ao mesmo tempo com um curto tempo de retorno de 24 horas.

Introdução

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Em dezembro de 2019, foi identificado um novo coronavírus, que hoje conhecemos como SARS-CoV-2, o agente causador da doença coronavírus 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 é um betacoronavírus pertencente à família Coronaviridae. Esses vírus envoltos compreendem um genoma de RNA de grande senso positivo e são responsáveis por infecções respiratórias e intestinais em humanos e animais2. Até maio de 2021, foram registrados mais de 157 milhões de casos notificados de COVID-19 globalmente e mais de 3,2 milhões de mortes3. O desenvolvimento de uma vacina eficaz tornou-se o objetivo principal de pesquisadores em todo o mundo com pelo menos 77 vacinas pré-clínicas sob investigação e 90 atualmente submetidas a testes clínicos4.

Coronavírus codificam quatro proteínas estruturais, incluindo a proteína do pico (S), nucleocapsid (N), proteína envelope (E) e a proteína da membrana (M). A entrada do SARS-CoV-2 requer interação do domínio receptor-vinculativo (RBD) de S com o receptor hospedeiro, enzima conversor de angiotensina humana 2 (hACE2), e posterior fusão de membrana seguindo o decote proteolítico por serina hospedeira, soro de protease transmembrana 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . A imunodominância humoral da proteína S do SARS-CoV foi relatada anteriormente e agora foi mostrada também para SARS-CoV-211,12,13. De fato, as respostas neutralizantes de anticorpos contra S foram detectadas em soro convalescente de pacientes sars-cov 24 meses após a infecção14, destacando seu papel crítico na resposta imune a longo prazo. A proteína S foi identificada como um alvo vacinal promissor e, portanto, tornou-se um componente-chave da maioria das vacinas em desenvolvimento15,16.

Embora a rápida detecção de anticorpos neutralizantes seja um aspecto crítico do desenvolvimento de vacinas, também pode lançar luz sobre a taxa de infecção e vigilância soro-epidemiológica nas áreas impactadas17. Um pseudotipado VSV competente para replicação com a glicoproteína SARS-CoV-2 S, no lugar da glicoproteína VSV do tipo selvagem, para estudar a infecção pelo SARS-CoV-2 em configurações de biossegurança nível 2 foi gentilmente doada por Whelan e colegas de trabalho18. O pico de expressão VSV (VSV-S) será utilizado para determinar a resposta neutralizante de anticorpos contra a proteína de pico SARS-CoV-2. Como o VSV-S usado aqui também expressa proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP), os focos eGFP podem ser detectados dentro de 24 horas para quantificar a infecção, enquanto a formação de placas pode levar de 48 a 72 h. Resumido aqui está um protocolo simples e eficaz para determinar a capacidade do soro convalescente do paciente de neutralizar a infecção vsv-S-eGFP. Este método também pode ser facilmente adaptado para interrogar outras terapêuticas potenciais que visam interromper a interação hosmá-viral da proteína SARS-CoV-2 S.

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Protocolo

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1. Células de chapeamento (Dia 1) para a produção e quantificação do pseudovírus SARS-CoV-2

  1. Preparação para a cultura tecidual
    1. Salina Fosfato-Tampão-Tampão de Dulbecco (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (opcional); e 0,25% de ácido tetraáctico de tripca-etilenodiamina (EDTA) a 37 °C em banho-maria por aproximadamente 15 minutos.
    2. Desinfete uma capa de cultura tecidual com 70% de etanol, e coloque pratos de cultura tecidual, pipetas pasteur e pipetas sorológicas na capa da cultura tecidual conforme necessário. Remova PBS, DMEM e trypsin do banho de água, e desinfete com 70% de etanol antes de colocar na capa da cultura tecidual.
  2. Emplacando e mantendo células
    1. Cultivar células Vero E6 em DMEM (contendo 10% de FBS) em frascos de cultura tecidual T75 ou pratos de cultura tecidual de 15 cm em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2. Passagem as células conforme necessário quando as células são 80-90% confluentes.
    2. Lave as células adicionando 10 mL de 1x PBS a cada prato e balançando suavemente 4-5 vezes; aspirar o PBS. Adicione 3 mL de trypsin-EDTA em cada prato, balance a placa para garantir que toda a superfície esteja coberta. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por aproximadamente 5 minutos, ou até que as células se despem.
    3. Adicione 7 mL de DMEM (contendo 10% de FBS) para desativar a trippsina e resuspensar as células ao tubular várias vezes. Gire as células para remover a trippsina usando uma centrífuga de bancada a 500 × g por 5 minutos, aspire a mídia sem perturbar a pelota celular e resuspense as células em 10 mL de DMEM (contendo 10% de FBS). Se as células forem necessárias para experimentos futuros, coloque 1 mL em um novo prato contendo 15 mL de DMEM fresco (contendo 10% de FBS).
    4. Conte as células usando um contador celular automatizado ou hemótmetro, e adicione aproximadamente 1 ×10 7 células a cada placa de 15 cm, e incubar a 37 °C com 5% de CO2 até que sejam 100% confluentes (1-2 dias).

2. PREPARAÇÃO DE pseudovírus VSV-S-EGFP

  1. Infeção
    1. Infectar células na multiplicidade de infecção (MOI) 0,01 com vírus de estoque VSV-S-eGFP em 12 mL de DMEM sem soro por 1 h a 37 °C com 5% de CO2, ocasionalmente balançando as placas. Substitua o inóculo por DMEM fresco (contendo 2% de FBS e 20 mM HEPES, pH 7.7), e mude-se para uma incubadora definida para 34 °C com 5% de CO2.
      NOTA: É necessária uma temperatura de 34 °C para a propagação do VSV-S-eGFP na cultura celular.
    2. Coletar supernantes celulares após observação de efeito citopático extensivo (CPE) e descolamento celular, aproximadamente 48 h pós-infecção. Use um microscópio fluorescente para visualizar a expressão extensiva do eGFP por células infectadas a partir de 24 horas após a infecção.
  2. Coleção
    1. Centrifugar os supernacantes usando uma centrífuga de bancada por 5 min a 1.000 × g a 4 °C para remover os detritos celulares. Aliquot o supernatante para evitar múltiplos ciclos de congelamento e armazene a -80 °C.

3. Titering o pseudovírus VSV-S-eGFP

  1. Diluição em série para determinar o título viral
    1. Placa Vero E6 células em placas de 6 poços a uma densidade de semeadura de 6 ×10 5 células por poço em DMEM (com 10% de FBS), e incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Também podem ser utilizadas células Vero que superexpressam TMPRSS2 e hACE2.
    2. Configure uma série de diluição serial de 10 vezes do vírus VSV-S-eGFP no DMEM sem soro frio, colocando 900 μL de mídia em sete tubos de microcentrifuuga. Tubos de etiqueta de 1 a 7. Adicione 100 μL do estoque viral ao primeiro tubo e vórtice brevemente. Transferir 100 μL de vírus diluído do tubo 1 para o tubo 2 e vórtice brevemente; continuar até o tubo 7.
    3. Aspire o meio de todos os poços da placa de 6 poços contendo células Vero E6, e substitua por 500 μL de diluições 10-2 a 10-7. Incubar as placas por 45 min a 37 °C com 5% de CO2,balançando suavemente a cada 15 minutos.
    4. Aspire o inóculo e substitua por sobreposição contendo uma mistura de 1:1 de DMEM 2x e 6% de celulose carboximetil (CMC), concentração final de 3% CMC, suplementada com 10% de FBS; incubar a 34 °C com 5% de CO2 por 48 h.
      NOTA: Pré-aqueça a mistura de sobreposição em um banho de água de 37 °C durante 15 minutos durante a etapa de infecção. Uma mistura de 1:1 de 1% de agarose com 2x DMEM complementada com 10% de FBS pode ser usada no lugar de CMC. Para sobrepor com agarose, ferva 1% de agarose (em dH2O) e misture com DMEM frio de 2x. Certifique-se de que a mistura é uma temperatura adequada antes de adicionar à monocamada celular (aproximadamente 37-40 °C). Se a agarose for usada para a sobreposição, as células devem ser fixadas incubando em 2 mL de 3:1 metanol:ácido acético por pelo menos uma hora antes da coloração.
  2. Colorindo e calculando o título viral
    1. Visualize placas com coloração com violeta cristalina ou visualização direta de eGFP sob um microscópio fluorescente.
    2. Para colorir as placas, aspire a sobreposição, lave uma vez com PBS, depois adicione 2 mL de 0,1% de violeta cristalina (em 80% de metanol e dH2O) a cada poço. Coloque em um roqueiro de placas por aproximadamente 20 minutos em temperatura ambiente antes da des coloração. Remova o cristal violeta e lave suavemente cada poço duas vezes usando dH2O ou PBS.
      NOTA: As etapas de lavagem e coloração devem ser realizadas suavemente através da tubulação lentamente em direção ao lado de cada poço para garantir que a monocamada da célula permaneça intacta durante todo o procedimento.
    3. Deixe as placas secarem por pelo menos 1h antes de contar placas. Certifique-se de que as contagens de placas sejam obtidas de poços contendo de 20 a 200 placas. Para calcular o título do vírus em unidades formadoras de placas (PFU) por mL, multiplique o fator de diluição do poço contado com o volume de infecção, e divida esse número das placas presentes no poço respectivo.
      figure-protocol-1

4. Células de chapeamento (Dia 1) para a medição da neutralização do pseudovírus SARS-CoV-2 por anticorpos comercialmente disponíveis e soro convalescente do paciente

  1. Preparação para a cultura tecidual
    1. Prepare a capa de cultura média e tecidual, conforme descrito na seção 1. Além disso, prepare o número necessário de 96 placas de poço para acomodar um mínimo de 2 réplicas por amostra (ou seja, 1 placa por 6 amostras); adicionar réplicas adicionais se o volume da amostra permitir.
  2. Emplacando e mantendo células
    1. Cresça e mantenha as células Vero E6 como descrito na seção 1. Prepare pelo menos 10 mL de suspensão celular por placa de 96 poços a uma concentração de 2 × 105 células por mL (placa 1,5 × 105 células por mL para ensaios realizados após 48h, se necessário). Adicione 100 μL de suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal, e incubar por 24 h a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Misture bem a suspensão da célula e balance cada placa suavemente em todas as direções para garantir a distribuição uniforme das células.

5. Diluições e infecções por anticorpos ou soros (Dia 2)

NOTA: Este protocolo pode ser aplicado para medir a neutralização do VSV-S-eGFP tanto por anticorpos disponíveis comercialmente quanto pelo soro do paciente, bem como pelo soro coletado de animais para estudos pré-clínicos de desenvolvimento de vacinas. *Tome nota das etapas adicionais listadas ao manusear amostras de soro de pacientes/animais.

  1. Série de diluição em série
    1. Antes de diluir amostras de soro, inativar o calor de cada amostra em um banho de água de 56 °C por 30 minutos para inativar o complemento. Certifique-se de que as precauções de segurança necessárias sejam tomadas ao manusear amostras do paciente; apenas abra recipientes de amostra quando na capa da cultura tecidual, e garanta que os equipamentos de proteção individual de nível 2 adequados sejam usados.
    2. Configure a série de diluição em uma placa vazia de 96 poços (Placa 1).
    3. Inicie todas as diluições na linha A da placa de 96-well em 80 μL. *Para amostras de pacientes, inicie a série de diluição em 1 em 10 colocando 8 μL de soro em 72 μL de DMEM sem soro (com penicilina/estreptomicina de 1%).
      NOTA: A concentração de anticorpos neutralizantes utilizados dependerá da atividade prevista pelo fabricante. Para o anticorpo neutralizador sars-CoV-2 spike utilizado aqui (ver a Tabela de Materiais), comece com 5 μg/mL para observar pelo menos 50% de neutralização.
    4. Adicione 40 μL de DMEM sem soro (com penicilina/estreptomicina de 1%) às linhas B a G e 80 μL à linha H. Não adicione vírus à linha H, pois serve como um controle somente para células.
    5. Usando uma pipeta multicanal de 12 poços, misture e transfira 40 μL de soro diluído ou anticorpo da linha A para a linha B. Misture e repita até a linha F, descarte 40 μL da linha F. Não adicione soro à linha G, pois representa a linha de controle somente para vírus.
  2. Infecção e sobreposição
    1. Prepare um volume apropriado de VSV-S-eGFP diluído para tratar cada poço em MOI 0.05 (ou 2000 pfu). (Ao completar este cálculo, tenha em mente que apenas 60 μL do volume total de 80 μL serão movidos para as células; portanto, certifique-se de multiplicar o volume do vírus por 1,33 para manter 2000 pfu).
      NOTA: Como o VSV-S-eGFP é sensível à temperatura, certifique-se de que os estoques virais permaneçam no gelo sempre que não estiver em uso e evite vários ciclos de congelamento, pois os títulos diferem após o congelamento repetido.
    2. Adicione 40 μL de vírus diluído a cada poço nas linhas A a G da Placa 1 e misture por pipetar para cima e para baixo 4-5 vezes. Incubar a placa por 1h a 37 °C com 5% de CO2.
    3. Remova a placa contendo células da incubadora (Placa 2) e aspire cuidadosamente a mídia de todos os poços. Transfira 60 μL de mistura anticorpo/vírus da Placa 1 para a Placa 2, e incubar por 1h a 37 °C com 5% de CO2, balançando a placa a cada 20 minutos.
    4. Cubra cada poço com 140 μL de sobreposição contendo CMC em DMEM para uma concentração final de 3% cmc (com 10% de FBS e 1% penicilina/estreptomicina). Coloque a placa 2 em uma incubadora definida para 34 °C com 5% de CO2 por aproximadamente 24 h antes da imagem.
      NOTA: Pré-aqueça a mistura de sobreposição em um banho de água de 37 °C durante 15 minutos durante a etapa de infecção.

6. Imagem e quantificação (Dia 3)

  1. Placas de imagem usando um imager fluorescente automatizado (usando um filtro isothiocianato fluoresceína (FITC) ou um filtro alternativo com um comprimento de onda de excitação de 488 nm). Quantifique a infecção viral criando um protocolo que identifica e conta automaticamente focos eGFP individuais. Se um recurso de contagem automática não estiver disponível, use o software ImageJ para quantificar o número de focos eGFP.

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Resultados

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Este protocolo descreve um método rápido e eficaz para detectar anticorpos neutralizantes contra a proteína SARS-CoV-2 S através da inibição da infecção por pseudovírus VSV-S-eGFP (quantificável pela perda de focos eGFP detectados). Uma representação esquemática do protocolo é retratada na Figura 1. Recomenda-se que um anticorpo comercialmente disponível seja usado como um controle positivo cada vez que o ensaio é executado para garantir a consistência do ensaio. Aqui, demonstramos uma curva...

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Discussão

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O método aqui descrito pode ser adaptado para atender a diferentes ambientes e recursos de laboratório, conforme necessário. É importante ressaltar que a principal limitação deste protocolo é a necessidade de um espaço de contenção nível 2 e uma capa de cultura tecidual. A aplicação de um vírus RNA replicante pseudotipado com o pico SARS-CoV-2, como VSV-S-eGFP, é uma alternativa formidável ao vírus SARS-CoV-2, que requer uma área de trabalho nível 3 de contenção, mas pode permanecer uma limitação para alguns grupos. Toda...

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes relacionados a esta publicação.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer ao laboratório Whelan por fornecer generosamente o vírus VSV-S-eGFP usado neste protocolo (descrito no Case et al. 2020). Agradecemos também aos Drs. Bill Cameron e Juthaporn Cowan (e equipe) pela coleta das amostras de sangue do paciente (ID do protocolo REB 20200371-01H). Os autores divulgam o recebimento do seguinte apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo: Este trabalho foi financiado pelo generoso apoio da Fundação Hospitalar de Ottawa e uma bolsa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (#448323) e uma Bolsa Rápida da Fundação Thistledown para a Ciência COVID-19 para c.S.I. T.R.J. é financiada por uma bolsa de pós-graduação de Ontário e uma bolsa mitacs de cluster. JP é financiado por uma bolsa mitacs cluster. A T.A. é financiada por uma Cihr Banting Fellowship. Também gostaríamos de agradecer a todos os indivíduos que participaram e doaram suas amostras de sangue para este estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher ScientificImageador fluorescente automatizado
carboximetilceluloseSigmaC5678
Meio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco)Fisher scientific10-013-CV
Eagle modificado de Dulbecco's medium (Pó) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
Controle de isotipo IgG (mouse)Thermo Fisher Scientific31903
Penicilina/estreptomicinaThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorpo neutralizador de pico, camundongo MabSinoBiological40592-MM57
Células Vero E6ATCC  CRL-1586

Referências

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Pseudovirus Neutralization AssayHigh Throughput ImagingVero E6 CellsSpike Protein PseudovirusConvalescent SerumPlaque AssayCrystal Violet StainingAntibody Quantification

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