Artigo de método

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

DOI:

10.3791/62486

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5 de junho de 2021

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1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Neste artigo

Resumo

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O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Resumo

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À medida que a pandemia COVID-19 causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) continua a evoluir, tornou-se evidente que a presença de anticorpos neutralizantes contra o vírus pode fornecer proteção contra infecções futuras. Assim, à medida que a criação e tradução de vacinas eficazes COVID-19 continua em uma velocidade sem precedentes, o desenvolvimento de métodos rápidos e eficazes para medir anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2 se tornará cada vez mais importante para determinar a proteção a longo prazo contra infecções para indivíduos previamente infectados e imunizados. Este artigo descreve um protocolo de alto rendimento usando o vírus da estomatite vesicular (VSV) pseudotipado com a proteína de pico SARS-CoV-2 para medir a presença de anticorpos neutralizantes em soro convalescente de pacientes que se recuperaram recentemente do COVID-19. O uso de um vírus pseudotipado replicante elimina a necessidade de uma instalação de nível 3 de contenção necessária para o manuseio sars-cov-2, tornando este protocolo acessível a praticamente qualquer laboratório nível de contenção 2. O uso de um formato de 96 poços permite que muitas amostras sejam executadas ao mesmo tempo com um curto tempo de retorno de 24 horas.

Introdução

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Em dezembro de 2019, foi identificado um novo coronavírus, que hoje conhecemos como SARS-CoV-2, o agente causador da doença coronavírus 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 é um betacoronavírus pertencente à família Coronaviridae. Esses vírus envoltos compreendem um genoma de RNA de grande senso positivo e são responsáveis por infecções respiratórias e intestinais em humanos e animais2. Até maio de 2021, foram registrados mais de 157 milhões de casos notificados de COVID-19 globalmente e mais de 3,2 milhões de mortes3. O desenvolvimento de uma vacina eficaz tornou-se o objetivo principal de pesqu....

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Protocolo

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1. Células de chapeamento (Dia 1) para a produção e quantificação do pseudovírus SARS-CoV-2

  1. Preparação para a cultura tecidual
    1. Salina Fosfato-Tampão-Tampão de Dulbecco (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (opcional); e 0,25% de ácido tetraáctico de tripca-etilenodiamina (EDTA) a 37 °C em banho-maria por aproximadamente 15 minutos.
    2. Desinfete uma capa de cultura tecidual com 70% de etanol, e coloque pratos de cultura tecidual, pipetas pasteur e pipetas sorológicas na capa da cultura tecidual conforme necessário. Remova PBS, DMEM e trypsin do banho de água, e de....

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Resultados

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Este protocolo descreve um método rápido e eficaz para detectar anticorpos neutralizantes contra a proteína SARS-CoV-2 S através da inibição da infecção por pseudovírus VSV-S-eGFP (quantificável pela perda de focos eGFP detectados). Uma representação esquemática do protocolo é retratada na Figura 1. Recomenda-se que um anticorpo comercialmente disponível seja usado como um controle positivo cada vez que o ensaio é executado para garantir a consistência do ensaio. Aqui, demonstramos uma curva.......

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Discussão

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O método aqui descrito pode ser adaptado para atender a diferentes ambientes e recursos de laboratório, conforme necessário. É importante ressaltar que a principal limitação deste protocolo é a necessidade de um espaço de contenção nível 2 e uma capa de cultura tecidual. A aplicação de um vírus RNA replicante pseudotipado com o pico SARS-CoV-2, como VSV-S-eGFP, é uma alternativa formidável ao vírus SARS-CoV-2, que requer uma área de trabalho nível 3 de contenção, mas pode permanecer uma limitação para alguns grupos. Toda.......

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes relacionados a esta publicação.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer ao laboratório Whelan por fornecer generosamente o vírus VSV-S-eGFP usado neste protocolo (descrito no Case et al. 2020). Agradecemos também aos Drs. Bill Cameron e Juthaporn Cowan (e equipe) pela coleta das amostras de sangue do paciente (ID do protocolo REB 20200371-01H). Os autores divulgam o recebimento do seguinte apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo: Este trabalho foi financiado pelo generoso apoio da Fundação Hospitalar de Ottawa e uma bolsa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (#448323) e uma Bolsa Rápida da Fundação Thistledown para a Ciência COVID-19 para c.S.I. T.R.J. é financiada....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher ScientificImageador fluorescente automatizado
carboximetilceluloseSigmaC5678
Meio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco)Fisher scientific10-013-CV
Eagle modificado de Dulbecco's medium (Pó) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
Controle de isotipo IgG (mouse)Thermo Fisher Scientific31903
Penicilina/estreptomicinaThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorpo neutralizador de pico, camundongo MabSinoBiological40592-MM57
Células Vero E6ATCC  CRL-1586

Referências

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  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource....

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SARS CoV 2 Neutralizing AntibodiesPseudovirus Neutralization AssayHigh Throughput ImagingFluorescent ImagingVero E6 CellsSpike Protein PseudovirusConvalescent SerumPlaque AssayCrystal Violet StainingAntibody Quantification

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