Este protocolo descreve as etapas para a criação de um modelo de coelho com dois aneurismas digeridos por elastase com diferentes hemodinâmicas (constelação de coto e bifurcação). Isso permite o teste de novos dispositivos endovasculares em aneurismas com diferentes condições angioarquiteturais e hemodinâmicas dentro de um único animal.
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Artigo de método
Criação de dois aneurismas saculares digeridos por elastase com hemodinâmicas diferentes em um coelho
Neste artigo
Resumo
Resumo
Modelos animais pré-clínicos com características hemodinâmicas, morfológicas e histológicas próximas aos aneurismas intracranianos humanos desempenham um papel fundamental na compreensão dos processos fisiopatológicos e no desenvolvimento e teste de novas estratégias terapêuticas. Este estudo tem como objetivo descrever um novo modelo de aneurisma de coelho que permite a criação de dois aneurismas saculares digeridos por elastase com diferentes condições hemodinâmicas dentro de um mesmo animal.
Cinco fêmeas de coelhos brancos neozelandeses com peso médio de 4,0 (± 0,3) kg e idade média de 25 (±5) semanas foram submetidas à criação de coto microcirúrgico e aneurisma de bifurcação. Um aneurisma (coto) foi criado pela exposição da artéria carótida comum direita (CCA) em sua origem no tronco braquiocefálico. Um clipe temporário foi aplicado na origem do CCA e outro, 2 cm acima. Este segmento foi tratado com uma injeção local de 100 U de elastase por 20 min. Um segundo aneurisma (bifurcação) foi criado pela sutura de uma bolsa arterial tratada com elastase na anastomose de ponta a ponta da CCA direita para a CCA esquerda. A patência foi controlada por angiografia por fluorescência imediatamente após a criação.
A duração média da cirurgia foi de 221 min. A criação de dois aneurismas no mesmo animal foi bem sucedida em todos os coelhos sem complicações. Todos os aneurismas estavam patenteados imediatamente após a cirurgia, exceto um aneurisma de bifurcação, que mostrou uma reação tecidual extrema devido à incubação de elastase e uma trombose intraluminal imediata. Não foi observada mortalidade durante a cirurgia e até um mês de seguimento. A morbidade foi limitada a uma síndrome vestibular transitória (um coelho), que se recuperou espontaneamente em um dia.
Demonstrada aqui, pela primeira vez, está a viabilidade da criação de um modelo de coelho de dois aneurismas com características hemodinâmicas de coto e bifurcação e condições de parede altamente degeneradas. Este modelo permite o estudo do curso natural e potenciais estratégias de tratamento com base na biologia do aneurisma sob diferentes condições de fluxo.
Introdução
O aneurisma intracraniano é uma condição grave, com taxa de mortalidade após ruptura de 50% e incapacidade a longo prazo em 10-20% dos pacientes1. A última década tem visto um rápido desenvolvimento de opções de tratamento endovascular, mas, ao mesmo tempo, também uma taxa crescente de recorrência com até 33% de recanalização de aneurisma após enrolamento 2,3. Para melhor compreensão da fisiopatologia subjacente à oclusão e recanalização de aneurismas, bem como para o desenvolvimento e teste de novos dispositivos endovasculares, atualmente há necessidade de modelos pré-clínicos confiáveis cujas características hemodinâmicas, morfológicas e histológicas imitem as dos aneurismas intracranianos humanos 4,5,6 . A partir de hoje, não existe um modelo definido como padrão para ensaios pré-clínicos, e uma grande variedade de espécies e técnicas estão disponíveis para os pesquisadores 7,8.
No entanto, o coelho é uma espécie de particular interesse devido ao tamanho e semelhanças hemodinâmicas entre suas artérias do pescoço e os vasos cerebrais humanos, bem como seus perfis semelhantes de coagulação e trombólise. Vários modelos com aneurismas saculares digeridos por elastase nas artérias carótidas comuns (CCAs) mostraram semelhanças qualitativas e quantitativas com os aneurismas intracranianos humanos em termos de condições de fluxo, características geométricas e características da parede 9,10,11,12. Este estudo tem como objetivo descrever uma técnica para criar um novo modelo de aneurisma de coelho com aneurismas digeridos por elastase de coto e bifurcação em um mesmo animal. As técnicas cirúrgicas são inspiradas nas de Hoh et al.13 e Wanderer et al.14 com pequenas modificações para proporcionar uma boa padronização e reprodutibilidade e garantir baixa mortalidade e morbidade.
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Protocolo
NOTA: O experimento foi aprovado pelo Comitê Local de Cuidados com Animais do Cantão de Berna, Suíça (Número de Inscrição BE108/16), e todos os cuidados e procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e os princípios 3R15,16. Os dados são reportados de acordo com as diretrizes do ARRIVE. O manejo perioperatório foi conduzido por um anestesiologista veterinário certificado pelo conselho. Para o estudo, as fêmeas de coelhos brancos neozelandeses, com peso médio de 4,0 (± 0,3) kg e idade média de 25 (±5) semanas, foram alojadas a uma temperatura ambiente de 22-24 °C com um ciclo claro/escuro de 12 horas com livre acesso a água, pellets e feno.
1. Fase pré-cirúrgica e anestesia
- Realizar um exame clínico conforme recomendado pela Associação de Anestesistas Veterinários e pelo Colégio Europeu e Americano de Anestesia Veterinária e analgesia para confirmar que os coelhos estão saudáveis, pesando cada animal, avaliando a mucosa, documentando o tempo de enchimento capilar e a qualidade do pulso, e realizando uma ausculta pulmonar e cardíaca, bem como uma palpação abdominal.
- Com base no achado clínico, atribua uma classificação da Sociedade Americana de Anestesiologistas (ASA) a cada coelho17. Realizar cirurgia apenas em animais com escore ASA I.
- Raspe ambas as orelhas externas e aplique creme de lidocaína-prilocaína nas artérias e veias auriculares. Alcançar sedação profunda com uma combinação de cetamina 20 mg/kg, dexmedetomidina 0,1 mg/kg e metadona 0,3 mg/kg injetada por via subcutânea (SC). Deixe os animais imperturbáveis por 15 min. Dê oxigenação suplementar (3 L/min) através de uma máscara facial solta e monitore com um oxímetro de pulso.
- Coloque uma cânula de 22 G na artéria central auricular esquerda, bem como em uma veia auricular. Induzir anestesia geral com propofol 1-2 mg/kg por via venosa (IV) até o efeito (perda do reflexo de deglutição). Proceder à intubação endotraqueal através de um tubo de silicone (3 mm de diâmetro interno).
- Raspe a testa para colocar os sensores eletroencefalográficos pediátricos (EEG). Raspe o campo cirúrgico e injete cloridrato de ropivacaína a 0,75% por via intradérmica.
- Coloque o coelho na mesa de operação em decúbito dorsal, instale o monitoramento completo e conecte o tubo endotraqueal a um sistema de círculo pediátrico de baixa resistência. Manter a anestesia com a administração de isoflurano em oxigênio, visando uma concentração máxima de maré final (Et) de 1,3%.
- Fornecer uma infusão contínua de lactato de ringer 5 mL/kg/h através do acesso venoso. Garantir o monitoramento clínico e instrumental até a extubação por meio de oximetria de pulso, doppler e pressão arterial invasiva, eletrocardiograma de 3 derivações, EEG, temperatura retal e gases inalados e exalados.
- Desinfete o campo cirúrgico com iodo povidona do esterno do manúbrio para ângulos da mandíbula e aplique o drapeado estéril. Durante a cirurgia, fornecer analgesia com lidocaína (infusão de taxa constante (CRI) de 50 μg/kg/min) e fentanil (IRC de 3-10 μg/kg/h). Realizar ventilação espontânea ou assistida. Permitir hipercapnia permissiva.
- Realizar pelo menos uma análise de gasometria arterial durante a cirurgia. Em caso de hipotensão (pressão arterial média abaixo de 60 mmHg), trate-a com noradrenalina, titulada até o efeito. Use uma almofada de aquecimento ou um sistema de aquecimento de ar forçado de aquecimento para evitar a hipotermia (objetivo: temperatura retal 37,5-38,5 °C).
NOTA: Como a pressão arterial invasiva é medida na artéria da orelha esquerda, o recorte da CCA esquerda interromperá o fluxo sanguíneo e suprimirá a curva. A pressão arterial deve então ser medida com a técnica Doppler até a reabertura do vaso.
2. Cirurgia
- Aproximação
- Faça uma incisão cutânea mediana do osso hioide até um ponto 1,5 cm caudal ao manúbrio esterno com um bisturi. Prepare o tecido subcutâneo e adiposo da incisão medial enquanto realiza hemostasia meticulosa.
- Liberte o músculo esternocefálico do tecido conjuntivo aderente e aplique a lidocaína topicamente (2-4 mg/kg, prefira lidocaína 1%) para evitar a mioclonia. Exponha o CCA direito medialmente do músculo esternocefálico e mantenha-o molhado com cotonetes molhados.
- Agora prepare as partes lateral e proximal do músculo esternocefálico e retraia-o medialmente com uma alça do vaso para expor o CCA. Identifique a veia jugular externa e proteja-a com um micro cotonete molhado.
- Dissecar o tecido conjuntivo cuidadosamente ao longo da CCA proximal até a bifurcação do tronco braquiocefálico para expor a artéria. Na presença de pequenos ramos provenientes da artéria, coagule-os com o cauterizador.
NOTA: Tome cuidado para evitar qualquer dano nervoso.
- Criação de aneurisma de coto e captação de tecido para o aneurisma de bifurcação
- Antes de cortar a CCA direita, meça o tempo de anticoagulação (TCA) e dê heparina do nátrio (80 EI/kg) sistemicamente através da veia da orelha (realizada pela equipe de anestesia) para evitar eventos tromboembólicos.
- Agora aplique 2 clipes temporários: o primeiro na origem do CCA e o segundo a 2 cm distal dele (Figura 1A). Coloque uma almofada de borracha sob o recipiente e enxágue com papaverina HCL (40 mg / mL; 1:1 dissolvido em solução salina a 0,9%) para vasodilatação.
- Remova a adventícia cuidadosamente usando microtesouras. Realizar uma arteriotomia abaixo do clipe distal com cateter IV 22 G e inserir o cateter caudalmente até o clipe proximal (Figura 1A,B).
- Lavar o segmento por via intraluminal com NaCl heparinizado (500 U/100 mL em solução salina a 0,9%) até que não haja sangue visível e, finalmente, fixar o cateter com ligadura (4-0). Agora, através do cateter, injetar 0,1-0,2 mL de elastase (100 UI previamente dissolvidos em 5 mL de Tris-Buffer) no segmento da artéria e incubar por 20 min (Figura 1B).
- Comece com a dissecção do lado esquerdo para expor o CCA esquerdo (ver secção 2.3). Após 20 min de tempo de incubação com elastase, limpe a solução de elastase e troque a seringa para enxaguar o segmento da artéria cerca de 10 vezes com NaCl a 0,9%.
- Aplicar 2 ligaduras (6-0): a primeira 5 mm distal de clipe proximal e a segunda apenas proximalmente, sob a arteriotomia (Figura 1C). Corte o vaso ~3 mm acima da primeira ligadura e mais uma vez entre a segunda ligadura e o clipe distal. Manter este enxerto autólogo em solução heparinizada (500 U/100 mL em solução salina a 0,9%) até a criação do aneurisma de bifurcação (Figura 1D). Finalmente, abra cuidadosamente o primeiro clipe proximal e meça o aneurisma (comprimento, largura e profundidade).
- Criação de aneurisma de bifurcação
- Prepare o lado esquerdo dissecando o músculo esternocefálico medialmente para expor ~2 cm da CCA esquerda. Aplique a lidocaína topicamente no músculo para evitar a mioclonia.
- Subscreva a artéria carótida com uma bola de gaze e uma pequena zaragatoa com um pedaço de luva. Aplique um pouco de papaverina. HCl topicamente (40 mg/mL; 1:1 dissolvido em solução salina a 0,9%). Continue a trabalhar sob visão microscópica: prepare a bolsa do aneurisma e remova a adventícia. Meça a bolsa do aneurisma (comprimento, largura, profundidade).
- Lave a parte aberta do CCA direito com NaCl heparinizado e, se necessário, substitua o clipe para ter ~1 cm para permitir manipulações livres para a sutura. Remova a adventícia cuidadosamente e faça uma incisão longitudinal de ~2 mm lateralmente no coto da CCA direita.
- Agora aplique dois clipes temporários no CCA esquerdo para delimitar um segmento de ~ 1 cm e remover a adventícia no meio. Realizar uma arteriotomia com uma agulha 23 G. Lavar o segmento com NaCl heparinizado (500 U/100 mL em solução salina a 0,9%). Ampliar a arteriotomia com microtesoura para ~4-5 mm para permitir a sutura da CCA direita e da bolsa do aneurisma (Figura 1E). Irrigar os vasos durante todo o processo de sutura e protegê-los com micro trocas úmidas.
- Realizar a anastomose com sutura não reabsorvível 9-0.
- Sutura da parede posterior proximal da carótida direita com 5 pontos, iniciando-se na borda proximal da arteriotomia na CCA esquerda. Em seguida, suture a parte de trás da bolsa do aneurisma com 4-5 pontos, começando na borda distal da arteriotomia na CCA esquerda.
- Continue com a parte de trás distal ao nível da incisão da boca do peixe até a sutura com a parte traseira vertical do enxerto de aneurisma com 3 pontos. Suture o lado frontal da incisão da boca do peixe com 3 pontos, iniciando para cima e movendo-se para baixo.
- Finalize com a sutura frontal entre o CCA esquerdo e o lado frontal do enxerto de aneurisma e o CCA direito com ~6 pontos. Antes de finalizar a anastomose, enxaguar os vasos com solução salina heparinizada a 0,9% por via intraluminal.
- Antes de remover a braçadeira, meça o tempo anticoagulante (TCA) mais uma vez e administre uma dose adaptada de heparina sistemicamente (alvo: 2-3 vezes o TCA basal).
- Remova o clipe no CCA direito enquanto pressiona a anastomose com micro cotonetes para hemostasia. Em seguida, continue removendo o clipe distal do CCA esquerdo. Se não houver sangramento maior, continue retirando o clipe proximal no CCA esquerdo, para permitir o fluxo sanguíneo. Se houver algum sangramento da anastomose, aplique alguma pressão com a bola de gaze e o cotonete; aguarde alguns minutos. Se persistir, substitua os clipes e realize novos pontos.
NOTA: Uma perda de sangue de mais de 20-30 mL pode colocar em risco a fase de recuperação.
- Controle de patência e documentação
- Após a abertura de todos os vasos, documente os resultados fotograficamente e meça-os (Figura 1F e Figura 2A,B).
- Confirmar a restauração do fluxo na CCA distal através da curva invasiva da pressão arterial (medida na artéria da orelha, um ramo direto da carótida externa), que também deve retornar ao normal.
- Realize angiografia por fluorescência administrando 1 mL de fluoresceína IV, usando 2 filtros passa-banda, uma câmera de vídeo e um holofote de bicicleta. Ver publicações anteriores para a descrição de todo o procedimento18,19.
- Encerramento
- Readapte a almofada de gordura na anastomose e suture-a com uma sutura reabsorvível de 4-0. Finalmente, sutura subcutânea e pele com pontos únicos usando sutura reabsorvível 4-0.
3. Fase pós-cirúrgica
- Ao final da cirurgia, descontinuar o isoflurano e a analgesia sistêmica sem reversão, a fim de manter o efeito analgésico. Certifique-se de que o controle do reflexo da deglutição retornou antes de realizar a extubação traqueal.
- Administrar meloxicam 0,5 mg/kg IV para garantir analgesia, aspirina (ASS) 10 mg/kg IV para prevenir eventos trombóticos imediatos, vitamina B12 100 μg SC e clamoxil 20 mg/kg IV como profilaxia antibiótica.
- Fornecer oxigenação suplementar e aquecimento até que o coelho recupere espontaneamente a decúbito esternal. Realize analgesia de resgate com metadona se algum sinal de dor for observado. Realizar acompanhamento e cuidados pós-operatórios 4 vezes ao dia nos primeiros 3 dias de pré-operatório, de acordo com as diretrizes para avaliação e manejo da dor em roedores e coelhos23,24.
- Garantir analgesia pós-operatória com adesivo de fentanil (12 μg/h) aplicado na orelha externa, meloxicam 1x/SC por 3 dias e metadona como terapia de resgate, juntamente com uma folha de pontuação para avaliação da dor (Arquivo Suplementar).
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Resultados
A criação de um coto e um aneurisma de bifurcação foi bem sucedida em todos os 5 coelhos brancos da Nova Zelândia sem complicações intraoperatórias. Nenhuma mortalidade foi observada durante a cirurgia ou durante o período de seguimento de 24 ± 2 dias. Um coelho apresentou complicações pós-operatórias com síndrome vestibular e cegueira do lado direito. O animal se recuperou completa e espontaneamente após 24 h. Essa complicação não interferiu em suas atividades normais (movimentos livres, ingestão de água e alimentos, in...
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Discussão
A técnica mais comum para a criação de aneurisma envolve a criação de um aneurisma de coto na origem do CCA direito, seja através de um método aberto ou endovascular. O modelo foi validado para ser um aneurisma estável e não crescente que permanece aberto com o tempo20,21. A segunda técnica possível envolve a criação microcirúrgica de um aneurisma de bifurcação arterial, por anastomose da CCA direita à esquerda e sutura de uma bolsa de aneurisma na bifurcação 14,...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Prof. Hans Rudolf Widmer, ao Dr. Luca Remonda e ao Prof. Javier Fandino pelo seu apoio científico e contribuição técnica para este trabalho. Um agradecimento especial a Olgica Beslac por seus conselhos durante os procedimentos e Kay Nettelbeck por sua assistência. Além disso, agradecemos a Daniela Casoni DVM, PhD e medic. vet. Luisana Garcia, PD Dra. Alessandra Bergadano e Dra. Carlotta Detotto por seu apoio veterinário dedicado.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sutura reabsorvível 4-0 | Ethicon Inc., EUA | VCP292ZH | |
| Sutura reabsorvível 4-0 | Ethicon Inc., EUA | VCP304H | |
| Sutura não absorvível 6-0 | B. Braun, Alemanha | C0766070 | |
| Sutura não absorvível 9-0 | B. Braun, Alemanha | G1111140 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | qualquer genérico |
| A Amiodarona | Helvepharm AG | 5078567 | qualquer máquina de anestesia genérica |
| Drä ger | qualquer outra | ||
| aspirina | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | genérica |
| Labatec Pharma SA | 6577083 | qualquer | |
| filtro passa-banda genérico azul | Thorlabs | FD1B | qualquer outro |
| filtro passa-banda verde | Thorlabs | FGV9 | qualquer outro |
| clipe de vaso Biemer (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Suíça | FD560R | qualquer outro |
| fórceps | qualquer outro | ||
| índice bispectral (neonatal) | qualquer outro | ||
| manguito de pressão arterial (neonatal) | qualquer outro | ||
| holofote | qualquer outro | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | qualquer genérico |
| Dexmedetomidina | Ever Pharma | 136740-1 | qualquer genérico |
| Elastase | Sigma Aldrich | E7885 | |
| Eletrodos | |||
| Ephedrine | Amino AG | 1435734 | |
| Esmolol | OrPha Swiss GmbH | 3284044 | |
| Fentanil (uso intravenoso) | Janssen-Cilag AG | 98683 | |
| Fentanil (transdérmico) | Mepha Pharma AG | 4008286 | |
| Fluoresceína | Curatis AG | 5030376 | |
| Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | |
| Almofada de aquecimento ou sistema | |||
| Solução isotônica de cloreto de sódio (0,9%) | Fresenius KABI | 336769 | |
| Cetamina | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 342261 | |
| afastador | Approach | ||
| Lidocaína | Streuli Pharma AG | 747466 | |
| Longuettes | |||
| Metacam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | Medicação |
| Metadona | Streuli Pharma AG | 1084546 | Sedaton |
| Micro-fórceps curvado | Ulrich Swiss, Suíça | U52-015-15 | |
| Micro-fórceps reto 2x | Ulrich Swiss, Suíça | U52-010-15 | |
| Microtesoura | Ulrich Swiss, Suíça | U52-327-15 | |
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | |
| Agulha 23 G | arteriotomia | ||
| Porta-agulha | |||
| O2-Máscara | |||
| Microscópio de operação | Wild Heerbrugg | ||
| Papaverin | Bichsel | aplicação tópica | |
| Povidona iodo | Mundipharma Medical Company | qualquer creme genérico | |
| de prilocaína-lidocaína | Emla | ||
| Propofol | B. Braun Medical AG, Suíça | Anestesia geral | |
| Oxímetro | |||
| Sonda de temperatura retal (neonatal) | |||
| Ringer Lactato | Bioren Sintetica SA | Infusão | |
| Ropivacaína | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | Anestesia local |
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | |
| Barbeador | |||
| Pinça | |||
| Espalhador de | |||
| Tigelas | |||
| Micro cotonetes | |||
| Estetoscópio | |||
| Campo | cirúrgico | ||
| Tesoura | |||
| Seringas 1 mL, 2 mL e 5 mL | |||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | Solução de elastase |
| Aplicador de clipe vascular | B. Braun, Alemanha | FT495T | |
| Cateter de veia e arterial 22 G | |||
| alça | Abordagem | ||
| câmera de vídeo ou smartphone | |||
| Vitarubin | Streuli Pharma AG | 6847559 | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Suíça | FT242T |
Referências
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