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O sequenciamento de RNA (RNA-seq) é uma das tecnologias mais utilizadas em transcriptômica, pois pode revelar a relação entre a alteração genética e os processos biológicos complexos e tem grande valor em diagnósticos, prognósticos e terapêuticas de tumores. A análise diferencial dos dados do RNA-seq é crucial para identificar transcrições aberrantes, e limma, EdgeR e DESeq2 são ferramentas eficientes para análise diferencial. No entanto, a análise diferencial do RNA-seq requer certas habilidades com linguagem R e a capacidade de escolher um método adequado, que está faltando no currículo da educação médica.
Aqui, fornecemos o protocolo detalhado para identificar genes expressos diferencialmente (DEGs) entre o cholangiocarcinoma (CHOL) e os tecidos normais através de limma, DESeq2 e EdgeR, respectivamente, e os resultados são mostrados em parcelas vulcânicas e diagramas de Venn. Os três protocolos de limma, DESeq2 e EdgeR são semelhantes, mas têm etapas diferentes entre os processos da análise. Por exemplo, um modelo linear é usado para estatísticas em limma, enquanto a distribuição binomial negativa é usada em edgeR e DESeq2. Além disso, os dados de contagem de RNA-seq normalizados são necessários para EdgeR e limma, mas não é necessário para o DESeq2.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para três métodos de análise diferencial: limma, EdgeR e DESeq2. Os resultados dos três métodos são parcialmente sobrepostos. Todos os três métodos têm suas próprias vantagens, e a escolha do método depende apenas dos dados.