Artigo de método

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

DOI:

10.3791/62539

⸱

15 de junho de 2021

 , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 2Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.

Resumo

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A principal causa de morte no mundo persiste como doença cardiovascular (DCV). No entanto, modelar a complexidade fisiológica e biológica do músculo cardíaco, o miocárdio, é notoriamente difícil de realizar in vitro. Principalmente, os obstáculos residem na necessidade de cardiomiócitos humanos (CMs) que são adultos ou exibem fenótipos adultos e podem replicar com sucesso a complexidade celular do miocárdio e a arquitetura 3D intrincada. Infelizmente, devido a preocupações éticas e falta de tecido cardíaco humano derivado do paciente primário disponível, combinado com a proliferação mínima de CMs, a fonte de CMs humanos viáveis tem sido um passo limitante para a engenharia de tecidos cardíacos. Para isso, a maioria das pesquisas passou para a diferenciação cardíaca das células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) como a principal fonte de CMs humanos, resultando na ampla incorporação de hiPSC-CMs dentro de ensaios in vitro para modelagem de tecido cardíaco.

Aqui neste trabalho, demonstramos um protocolo para o desenvolvimento de um tecido cardíaco humano 3D derivado de células-tronco dentro de um dispositivo microfluido. Explicamos e demonstramos visualmente a produção de um modelo 3D in vitro de tecido cardíaco anisotrótrópico de CMs derivados de hiPSC. Descrevemos principalmente um protocolo de purificação para selecionar para CMs, a co-cultura das células com uma razão definida através da mistura de CMs com CFs humanos (hCFs), e suspensão desta co-cultura dentro do hidrogel à base de colágeno. Demonstramos ainda a injeção do hidrogel carregado de células dentro do nosso dispositivo microfluido bem definido, embutido com micropostos elípticos escalonados que servem como topografia superficial para induzir um alto grau de alinhamento das células circundantes e da matriz de hidrogel, imitando a arquitetura do miocárdio nativo. Prevemos que o modelo 3D anisotrópico de tecido cardíaco on-chip é adequado para estudos fundamentais de biologia, modelagem de doenças e, através de seu uso como ferramenta de triagem, testes farmacêuticos.

Introdução

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Abordagens de engenharia de tecidos têm sido amplamente exploradas, nos últimos anos, para acompanhar os achados clínicos in vivo na medicina regenerativa e modelagem da doença1,2. A ênfase significativa tem sido particularmente colocada na modelagem in vitro do tecido cardíaco devido às dificuldades inerentes à obtenção do tecido cardíaco primário humano e à produção fisiologicamente relevante substitutos in vitro, limitando a compreensão fundamental dos mecanismos complexos de doenças cardiovasculares (DCV)1,3. Modelos trad....

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Protocolo

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Realize toda a preparação de manuseio de células e reagentes dentro de um Gabinete de Biossegurança. Assegure-se de que todas as superfícies, materiais e equipamentos que entram em contato com as células são estéreis (ou seja, pulverizar com 70% de etanol). As células devem ser cultivadas em uma incubadora umidificada de 37 °C, 5% de CO2. Toda cultura e diferenciação hiPSC é realizada em placas de 6 poços.

1. Criação de dispositivo microfluido (duração aproximada: 1 semana)

  1. fotolitografia
    NOTA: A máscara, projetada usando o arquivo CAD (fornecido como Arquivo Suplementar 1),contém o....

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Resultados

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Para obter uma população altamente purificada de CMs de hiPSCs, uma versão modificada envolvendo uma combinação do protocolo de diferenciaçãolian 33 e as etapas de purificação de Tohyama34 é usada (consulte a Figura 1A para cronograma experimental). Os hiPSCs precisam ser parecidos com colônias, ~85% confluentes, e se espalhar uniformemente por toda a cultura bem 3-4 dias após a passagem, no início da diferenciação cm(Figur.......

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Discussão

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A formação de um modelo de tecido cardíaco humano in vitro com interações células-células aprimoradas e estrutura 3D biomimética é imprescindível para pesquisas cardiovasculares básicas e aplicações clínicas correspondentes1. Este protocolo delineado explica o desenvolvimento de tecido cardíaco anisotrótrópico humano 3D dentro de um dispositivo microfluido, utilizando co-cultura de CMs derivados de células-tronco com CFs conectivos encapsulados dentro de um hidrogel de colágeno, servindo .......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer ao NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Award (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) e ao Prêmio Flinn Foundation por fornecer fontes de financiamento para este projeto. A linha hiPSC, SCVI20, foi obtida de Joseph C. Wu, MD, PhD no Stanford Cardiovascular Institute financiado pelo NIH R24 HL117756. A linha hiPSC, IMR90-4, foi obtida pelo WiCell Research Institute55,56.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga de 0,65 mLVWR87003-290
Punção de biópsia de 1 mmVWR95039-090
Punção de biópsia de 1,5 mmVWR95039-088
Tubos Falcon de 15 mLVWR89039-670
Laínulas de 18x18 mmVWR16004-308As lamínulas devem ser nº 1, para permitir imagens
de alta ampliaçãoParaformaldeído a 4%ThermoFisher101176-014
Placas de cultura de tecidos de fundo plano de 6 poçosVWR82050-844
B27 menos insulinaLifeTechA1895602
B27 mais insulinaLifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
Colágeno I, cauda de ratoCorning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001também pode ser fabricado internamente
EDTAVWR45001-122
Etanol
FGM3VWR10172-048
GFR-MatrigelVWR47743-718
GlycineSigmaG8898-500G
Soro de cabraVWR10152-212
hESC-MatrigelCorningBD354277
IPA
IWP2SigmaI0536-5MG
KimwipesVWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigmaS5881-500G
Pen/Strep VWR15140122
placa de Petri (150x15mm)VWR25384-326
placa de Petri (60x15mm)VWR25384-092
Fenol RedSigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 menos glicoseVWR45001-110
Bolachas de silício (100 mm)University Wafer1196
lactato de sódioSigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 DesenvolvedorFrascos ThermoFisherNC9901158
Sylgard ElastomerEssex BrownellDC-184-1.1
T75 VWR82050-856
Triton X-100SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
Tripsina-EDTA (0,5%)ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632Tecnologias de Células-Tronco72304
EVG620 AlinhadorEVG
Limpador de plasma PDC-32GHarrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscópioNikon
Leica SP8 Microscópio confocalLeica

Referências

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  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimen....

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